Tài liệu Nghiên cứu chuyển gen cry1ac cho cây khoai tây (solanum tuberosum l.) bằng vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ LÊ THỊ VÂN NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Cry1Ac CHO CÂY KHOAI TÂY (Solanum tuberosum L.) BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 60.62.05 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH HÀ NỘI, 2011 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, hình ảnh, kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược công bố trong bất cứ công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan các tài liệu trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Lê Thị Vân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. i LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực tập tại viện sinh học nông nghiệp trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội, ñược sự quan tâm, giúp ñỡ và dìu dắt tận tình của các thầy cô giáo, các cán bộ tại phòng thí nghiệm của viện, cùng sự cố gắng và nỗ lực của bản thân, tôi ñã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình. Lời ñầu tiên, tôi xin trân trọng bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất ñến PGS. TS Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã tận tình hướng dẫn và giúp ñỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện ñề tài, cũng như trong thời gian tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự dạy bảo và những ý kiến ñóng góp của các thầy cô trong bộ mộ Di truyền –chọn giống, các thầy cô trong khoa, trong trường và các thầy cô trong viện ñào tạo sau ñại học. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới Ths. Nguyễn Thị Thanh Phương, ñã trực tiếp tận tình hướng dẫn tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Qua ñây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn ñến lãnh ñạo và cán bộ nghiên cứu phòng Sinh học phân tử và chọn tạo giống cây trồng, cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu của Viện Sinh học Nông Nghiệp ñã giúp ñỡ tôi rất nhiều trong thời gian tôi thực hiện ñề tài vừa qua. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn gia ñình, người thân và bạn bè ñã tạo ñiều kiện tinh thần tốt nhất và luôn ủng hộ cho tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luân văn này. Hà nội, ngày 08 tháng 09 năm 2011 Tác giả luận văn Lê Thị Vân Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. ii MỤC LỤC lời cam ñoan i lời cảm ơn ii mục lục iii danh mục các chữ viết tắt vi danh mục bảng vii danh mục hình ix 1. MỞ ðẦU 1 1.2 Mục ñích và yêu cầu 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 4 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở thế giới và Việt Nam 5 2.3 Chuyển gen ở thực vật 6 2.5 Các nghiên cứu về tái sinh invitro và chuyển gen ở cây khoai tây 18 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. ðối tượng, vật liệu, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 25 3.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 26 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 4.1. Nghiên cứu tái sinh invitro cho cây khoai tây Atlantic. 36 4.1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số loại ñường (manitol, glucose và saccarose) ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 4.1.2 36 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng kinetin ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 39 iii 4.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. 4.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 4.1.5 41 44 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 46 4.2 Các thí nghiệm tiền ñề cho chuyển gen 50 4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime ñến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây 4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime ñến tỷ lệ sống của vi khuẩn A. tumefaciens. 4.2.3 50 54 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất chọn lọc PPT ñến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy 56 4.3 Nghiên cứu xác ñịnh một số thông số kỹ thuật trong chuyển gen 58 4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.3.3 4.3. 66 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. 4.3.5 63 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.3.4 58 70 ðánh giá tác ñộng tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 76 Kết quả ñánh giá cây khoai tây Atlantic chuyển gen bằng PCR 80 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. iv 4.4. So sánh và thảo luận kết quả ñề tài với các kết quả nghiên cứu chuyển gen ở cây khoai tây ñã ñược công bố ở Việt Nam. 83 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 85 5.1 Kết luận 85 5.2 ðề nghị 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 PHỤ LỤC 96 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4 D Dichlorophenoxyacetic acid BA Benzyl adenin αNAA α-Naphthylacetic acid IAA Indol acetic acid MS Murashige and Skoog, 1962 ðC ðối chứng ðNC ðồng nuôi cấy AS Acetosyringone A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens DNA DNA- Ribonucleic acid Gus Β- Glucuronidase PPT DL- photphinothricin Ka Kanamycin Kb Kilo base kDa Kilo Dalton PCR Polymerase chain reaction- phản ứng chuỗi trùng hợp DK Diệt khuẩn CT Công thức Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. vi DANH MỤC BẢNG STT 4.1. Tên bảng Trang Ảnh hưởng của một số loại ñường (manitol, glucose và saccarose) ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.2. Ảnh hưởng của kinetin ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.3. 37 40 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy). 4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.5 55 Ảnh hưởng của PPT ñến tỷ lệ sống của mô nuôi cấy (sau 6 tuần nuôi cấy) 4.9a 51 Nghiên cứu ảnh hưởng của kháng sinh cefotaxime ñến tỷ lệ sống của vi khuẩn A. tumefaciens. 4.8 47 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime ñến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.7 45 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA tới khả năng phát inh hình thái mô nuôi cấy (sau 8 tuần nuôi cấy) 4.6 42 56 ðánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant và Atlantic. 4.9b 59 ðánh giá ảnh hưởng của nguồn mẫu cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 61 vii 4.10a ðánh giá ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Dianmant và Atlantic. 63 4.10b Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 64 4.11a Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium trên hai giống Diamant và Atlantic. 67 4.11b ðánh giá ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 69 4.12a Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterim trên hai giống Diamant và Atlantic 71 4.12 b ðánh giá ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens qua biểu hiện của gen Bar và gen Gus (8 tuần) 73 4.13a ðánh giá tác ñộng tổ hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A. tumefaciens trên hai giống khoai tây Atlantic và Diamant 76 4.13b ðánh giá tác ñộng tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens qua sự biểu hiện của gen Bar và gen Gus (sau 8 tuần) Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 77 viii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Sơ ñồ cấu trúc plasmid ITB2c. 4.1 Ảnh hưởng của kinetin ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 4.2 25 41 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng BA thuộc nhóm cytokinin ñến khả năng tạo chồi của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4 - D ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Sau 8 tuần nuôi cấy) 4.4 49 Ảnh hưởng của chất kháng sinh diệt khuẩn cefotaxime ñến khả năng sống và tái sinh của cây khoai tây 4.7 49 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 4.6 46 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA ñến khả năng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy 4.5 44 53 Kết quả tái sinh của các loại mẫu trên môi trường MS3 + 300mg/L cefotaxime (A: ðoạn thân không mang mắt ngủ, B: callus) 4.9 54 ðoạn thân không mang mắt ngủ và callus ở nồng ñộ 1,0 mg/L PPT (Sau 6 tuần nuôi cấy) 57 4.10 Hình ảnh mẫu ñồng nuôi cấy 3 ngày 60 4.11 Ảnh hưởng của nguồn mẫu ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 4.12 62 Ảnh hưởng của thời gian tiền nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 66 ix 4.13: Sự biểu hiện của gen Gus. 4.14 66 Ảnh hưởng của phương pháp lây nhiễm mẫu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 70 4.15: Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 74 4.16: Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy tới sự nhiễm khuẩn 75 4.17 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến khả năng tái sinh 75 4.18 ðánh giá tác ñộng tổng hợp của các công thức tối ưu tới tốc ñộ sinh trưởng của hai giống Atlantic và Diamant (8 tuần) 4.19 ðánh giá tác ñộng tổng hợp của các công thức tối ưu tới khả năng chuyển gen của vi khuẩn A.tumefaciens 4.20 78 78 ðánh giá tác ñộng của công thức tối ưu tới tỷ lệ mẫu sống sau chọn lọc. 79 4.21: Sự biểu hiện tạm thời của gen Gus A trên các loại mẫu cấy thu 4.22 ñược ở công thức 6 79 Kết quả ñiện di sản phẩm PCR 81 Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. x 1. MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề Khoai tây (Solanum tuberosum L.) có nguồn gốc ở vùng cao thuộc dãy núi Andes, Nam Mỹ. Trên thế giới, cây khoai tây ñược coi là cây lương thực có tầm quan trọng ñứng hàng thứ tư sau lúa mì, lúa nước và ngô (Steveson, Loria, Frane và Weingartner, 2001). Ở Việt Nam, khoai tây là nhóm cây lương thực có tầm quan trọng thứ ba sau lúa và ngô. Tuy nhiên, những năm gần ñây, diện tích trồng khoai tây chỉ dao ñộng trong khoảng 30.000 - 35.000 ha với năng suất bình quân khoảng từ 10 - 11 tấn/ha. Một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn ñến năng suất thấp và diện tích trồng giảm dần là do thiếu nguồn củ giống tốt, củ giống trồng phổ biến là loại củ giống chất lượng thấp (tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao, già sinh lý và ñộ thuần chủng thấp). Do ñó, việc nghiên cứu cải tiến các ñặc tính nông sinh học và khả năng chống chịu của khoai tây là rất cần thiết. Qua nhiều năm các nhà nông nghiệp và nhà chọn giống thực vật ñã ñặc biệt thành công trong việc tối ưu hóa các ñặc tính có lợi như hàm lượng protein, tinh bột. .. và tăng năng suất. tuy nhiên với cách tiếp cận truyền thống ñã gặp phải rất nhiều khó khăn. ðặc biệt trong lai xa, và trong tạo giống kháng bệnh ở khoai tây. Vì vậy, sự ra ñời của công nghệ sinh học trở thành một công cụ mới hữu hiệu, góp phần cùng với phương pháp chọn giống truyền thống ñạt ñược nhiều kết quả khả quan. Hiện nay, việc cải tiến và tạo giống cây trồng mới bằng kỹ thuật chuyển gen ñã trên nên rất phổ biến trên thế giới (Clive, 2008). Trên thế giới , ñã có nhiều nghiên cứu về xây dựng hệ thống tái sinh và chuyển gen thành công vào cây khoai tây. Các nghiên cứu chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens, một số tác giả như Vazquez Rovere C và cs. (2001), Bendahmane và cs (1995, 2000), Li và cs. (1999), Vidal và cs (2002) ñã biến nạp thành công vào cây khoai tây các gen kháng sâu, bệnh. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 1 Tuy nhiên nước ta, các nghiên cứu về chuyển gen trên cây khoai tây còn hết sức hạn chế, mới chỉ có nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh in vitro trên giống khoai tây Diamant và một số giống nhị bội của ðinh Trường Sơn và cs., (2007). Chính từ vấn ñề ñó chúng tôi tiến hành thực hiện ñề tài: “Nghiên cứu chuyển gen Cry1Ac cho cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.” 1.2 Mục ñích và yêu cầu 1.2.1. Mục ñích - Xây dựng ñược quy trình tái sinh in vitro cho cây khoai tây - Xác ñịnh ñược các thông số kỹ thuật cho các bước trong quy trình chuyển gen mục tiêu vào cây khoai tây nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, làm cơ sở cho việc tao cây chuyển gen mang những ñặc tính mong muốn. 1.2.1 Yêu cầu. - Xác ñịnh ñược thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tái sinh chồi từ mô lá, thân không mang mắt ngủ bao gồm: + Xác ñịnh nồng ñộ ñường tối ưu. + Xác ñịnh nồng ñộ các chất ñiều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin, cytokinin tối ưu bổ sung trong môi trường tái sinh. - Tái sinh ñược cây khoai tây Atlantic hoàn chỉnh - Xác ñịnh ñược nồng ñộ kháng sinh cefotaxime hợp thích hợp ảnh hưởng tới sự tái sinh và sinh trưởng của mẫu cấy. - Xác ñịnh ñược nồng ñộ PPT tới hạn ảnh hưởng ñến tỷ lệ sống của mẫu cấy. - Xác ñịnh ñược vật liệu lây nhiễm phù hợp. - Xác ñịnh ñược phương pháp lây nhiễm vi khuẩn phù hợp. - Xác ñịnh ñược thời gian tiền nuôi cấy thích hợp. - Xác ñịnh ñược thời gian ñồng nuôi cấy thích hợp. - ðánh giá ñược sự có mặt của gen chuyển nạp trong mẫu ñã chuyển gen. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 2 1.3.1 Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu xây dựng ñược quy trình chuyển gen và xác ñịnh ñược các thông số kỹ thuật và xây dựng ñược quy trình chung cho chuyển gen vào cây khoai tây. Từ ñó, làm cơ sở cho việc chuyển các gen mong muốn vào cây khoai tây. Góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu bệnh. Từ kết quả nghiên cứu làm cơ sở thúc ñẩy việc ứng dụng công nghệ sinh học trong cải tiến và chọn tạo giống cây trồng. ðưa kỹ thuật chuyển gen trở thành công cụ hỗ trợ ñắc lực cho công tác chọn tạo giống truyền thống. Tạo các giống cây trồng chuyển gen mang các ñặc tính mong muốn. 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu của ñề tài góp phần cung cấp vật liệu cho chọn tạo giống khoai tây kháng sâu, nhằm giảm thiểu rủi ro, chi phí sản xuất và bảo vệ môi trường. Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây Khoai tây là một cây trồng cổ ñại. Các bằng chứng về khảo cổ học, lịch sử và ngôn ngữ học cũng như thực vật học ñều chứng minh rằng khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Nhiều loại khoai tây hoang dại còn tồn tại ñến ngày nay, ñặc biệt ở dãy Andes thuộc peru, Bolivia, ngoài ra các loại hoang dại cũng xuất hiện ở Mexico và Trung Mỹ, nhưng dạng Solanum tuberosum ñược ñưa vào Tây Ban Nha từ Nam Mỹ năm 1570 và lan rộng ra các nước và gần 100 năm sau có mặt ở hầu hết các nước châu Âu. Khoai tây thực sự ñược trồng trọt trên quy mô lớn sau khoảng 1870 và mãi tới thế kỷ 19 mới thực sự phổ biến trên các châu lục. Ở Việt Nam, khoai tây ñược người Pháp ñưa vào trồng trọt năm 1890 tại một số vùng : Tú Sơn- Hải Phòng (1901), Trà Lĩnh- Cao Bằng (1907), Thường Tín- Hà Tây (1917). Hiện nay, khoai tây ñược trồng tập trung ở vùng ñồng bằng thuộc châu thổ Sông Hồng, ðà Lạt. Gần ñây khoai tây ñược trồng ở một số vùng núi phía bắc như Sapa- Lào Cai, Hòa An- Cao Bằng. Kết quả nghiên cứu cho thấy khoai tây trồng ở ñộ cao so với mặt nước biển sẽ cho năng suất cao, chất lượng tốt, thích ứng cao, ít sâu bệnh.[5] Khoai tây thuộc họ cà (Solanaceae), chi Solanum là một chi rất lớn với trên 2000 loài ñược phân bố hầu khắp trên thế giới. Sự ña dạng về loài, giống tập trung chủ yếu ở Trung- Nam Mỹ và Australia. Cùng với các loài S.tuberosum có khoảng 7 loài trồng trọt khác. Theo J. G. Hawkerkks (1991), khoai tây ñược phân thành 18 nhóm, trong ñó có 68 loài hoang dại, chỉ có 8 loài trồng trọt, ñược chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng NST. [5] Khoai tây thuộc nhóm cây thực phẩm cao cấp. Hàm lượng dinh dưỡng trong củ ña dạng phong phú, bao gồm tinh bột, protein, lipit, gluxit, các loại vitamin: carotene, B1, B2, B3, B6, PP, C. Thành phần khoáng của khoai tây chủ yếu là P, Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 4 Ca, Fe, Mg, K. Trong khoai tây còn chứa một số axit amin tự do, vì vậy giá trị dinh dưỡng ở khoai tây ñược khẳng ñịnh là rất quan trọng với con người. Trong củ khoai tây chứa 78% nước, gần 1% chất béo. Hàm lượng chất khô biến ñộng từ 18.3- 22.0% trong ñó 82% của chất khô là cacbon hydrat, tinh bột, một số chất xơ và lượng nhỏ ñường ñơn. Hàm lượng protein ở khoai tây tươi là 0.61.2%. Trong 100g tươi, có các loại vitamin chủ yếu như: B1 (0.1- 0.15mg%), B2 (0.05mg%), C (20-30mg%). Các chất khoáng cơ bản là P (50mg%), Ca (10mg%), Fe (1.2mg%). Ngoài ra còn có 0.05- 0.07mg% riboflavin. Khoai tây chứa 12 loại vitamin và muối khoáng, ngoài ra còn có thiamin, sắt, folic axit. Khoai tây ñược nhận ñịnh là có giá trị dinh dưỡng tốt hơn ngũ cốc và ñậu tương. Khoai tây cũng là cây lương thực giữ vai trò chủ yếu của nhiều nước trên thế giới. [5] 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở thế giới và Việt Nam 2.2.1 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới Theo thống kê của FAO (2004- 2005), diện tích trồng khoai tây toàn thế giới có xu hướng giảm dần, từ 20.028.896 ha xuống 18.652.381 ha. Năng suất tăng rõ vào 2004, 2005 nhưng không tăng nhiều. Do ñó, tổng sản lượng tăng không ñáng kể. [5] Do ñiều kiện sinh thái, mức ñộ thâm canh và trình ñộ sản xuất khác nhau nên năng suất khoai tây chênh lệch rất lớn, từ 7 ñến 65 tấn/ha. Tính ñến năm 2005 hàng năm trên thế giới sản xuất ñược khoai tây với diện tích 18,89 triệu ha, sản lượng ñạt 320,98 triệu tấn (FAO, 2006) [64] Châu Âu có nền sản xuất khoai tây lớn nhất thế giới, tuy nhiên trong những năm gần ñây vị trí cây khoai tây có phần giảm về cả diện tích và sản lượng. Về diện tích năm 2000 cả Châu lục ñạt 9,13 triệu ha, ñến năm 2005 chỉ còn 7,59 triệu ha, giảm 1,54 triệu ha. ðể ñáp ứng nhu cầu về khoai tây trong ñiều kiện diện tích giảm, các nhà khoa học ñã nghiên cứu nhiều biện pháp kỹ thuật, ñặc biệt là về giống nên năng suất cây khoai tây không ngừng ñược nâng cao. Năng suất khoai tây năm 2005 ñạt 17,24 tấn/ha, tăng 1,74 tấn/ha so với năm 2001 và 0,94 tấn/ha so với năm 2000. Mặc dù năng suất tăng nhưng do diện tích giảm nhiều nên sản lượng năm 2005 vẫn thấp, thấp hơn 6,36 triệu tấn so với năm 2000. [67] Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 5 2.2.2 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam Khoai tây không phải là cây trồng bản ñịa và ñã ñược trồng ở Việt Nam từ hơn 100 năm nay, ñược nhập nội vào nước ta từ Châu Âu do người Pháp mang vào. Trước năm 1966, diện tích trồng khoai tây chỉ ñạt dưới 1 nghìn ha và ñược trồng rải rác ở Sa Pa (Lào Cai), ðà Lạt, Cao Bằng, ðông Anh (Hà Nội), Thường Tín (Hà Tây), ðồ Sơn (Hải Phòng). Năm 1971 có 5 nghìn ha khoai tây, năm 1980 diện tích trồng khoai tây lên tới 100.000 ha, mỗi năm tăng 12.000 ha (ðào Huy Chiên, 2002) [6] sau ñó giảm xuống còn 28.022 ha năm 2000 và hiện nay ñạt 35.000 ha (năm 2005). Cây khoai tây ở nước ta ñã và ñang phát triển nhưng tốc ñộ mở rộng diện tích và tăng năng suất hàng năm không cao. ðiều này ñược giải thích bởi: thiếu bộ giống thích hợp với ñiều kiện nóng ẩm , ñặc biệt là thiếu giống có chất lượng tốt có thể trồng ñược ở nhiều vùng sản xuất . [16] Mặt khác hầu hết các giống khoai tây trồng trên ñồng ruộng ñều bị nhiễm virus với tốc ñộ tăng dần làm cho giống bị thoái hóa, năng suất và chất lượng giảm sút (Lê Hưng Quốc, 2006) [23] Thứ hai là do ñiều kiện khí hậu ở Việt Nam ít thuận lợi cho khoai tây sinh trưởng và phát triển: Nhiệt ñộ cao, ngày ngắn và nhiều ñiều kiện khí hậu không thích hợp nên khoảng cách giữa năng suất thực tế với tiềm năng năng suất là rất lớn (chỉ bằng 10%) và thời vụ gieo trồng ngắn, chỉ trồng ñược 1 ñến 2 vụ/năm (Caldiz, D.O.,et al., 2001) (Dẫn theo Lê Sỹ Lợi, 2007) [18]. Thời vụ gieo trồng ngắn không chỉ trồng ñược ít vụ mà năng suất cây trồng cũng không cao (Hunt, 1993) [47]. Do ñiều kiện khí hậu không thuận lợi, giống khoai tây nhập nội khi trồng ở Việt Nam thời gian sinh trưởng bị rút ngắn, chỉ khoảng 85 – 115 ngày (Nguyễn Văn Thắng và cs, 1996). [35] Thời gian sinh trưởng ngắn là yếu tố bất lợi, hạn chế nhiều ñến năng suất và phẩm chất khoai tây (Trương Văn Hộ và cs, 1990) [14] 2.3 Chuyển gen ở thực vật 2.3.1 Khái niệm chuyển gen và cây chuyển gen Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật ñưa 1 hay nhiều gen lạ ñã ñược thiết kế dưới dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinh vật nói chung (vi sinh vật, ñộng vật......) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmid tái tổ Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 6 hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ các gen này hoạt ñộng tổng hợp nên các protein ñặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các ñặc tính mới của cơ thể chuyển gen. Cây chuyển gen (transgenic plant) là cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gen lạ ñược lồng vào genom, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn ñịnh từ thế hệ này sang thế hệ khác. [30]. 2.3.2 Chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium 2.3.2.1 Giới thiệu về A. tumefaciens và quy trình chung chuyển gen nhờ A. tumefaciens Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật, trong ñó, phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium ñã ñược sử dụng khá rộng rãi và ñã thành công trên nhiều ñối tượng cây trồng, ñặc biệt là thực vật hai lá mầm. Từ những năm 1960- 1970, các nghiên cứu ñã ñược tiến hành trên vi khuẩn này, việc phát hiện ra vi khuẩn này có khả năng chuyển gen vào thực vật vào ñầu những năm 1980 ñã biến loài này trở thành một trong những công cụ quan trọng của công nghệ sinh học thực vật với nhiều ưu ñiểm nổi trội như: số bản sao của gen biến nạp ñược chuyển vào tế bào thực vật thấp khoảng 1- 2 gen, trong khi sử dụng súng bắn gen là nhiều hơn. Do vậy, phương pháp này giảm tối thiểu sự không biểu hiện của gen ñược chuyển, tăng khả năng chuyển gen bền vững, hiệu quả chuyển gen cao, tránh ñược sự hình thành của các cây chuyển gen khảm. [29] Chuyển gen bằng Agrobacterium ñã thu ñược nhiều kết quả ở thuốc lá, cà chua, khoai tây, ñậu tương, ngô, bông. [33] ðặc ñiểm chung của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: Agrobacterium là vi khuẩn ñất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm vào qua vết thương, tạo ra các u sần ảnh hưởng tới sự sinh trưởng bình thường của cây bị xâm nhiễm [3] Trong chi Agrobacterium thì A.tumefaciens ñược sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen. Phân loại khoa học: Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 7 Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Alpha Proteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Rhizobiaceae Chi: Agrobacterium Loài: A.tumefaciens Danh pháp khoa học: Agrobacterium tumefaciens Quy trình chung chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium: Bước 1: Thiết kế vector mang gen. Bước 2: Nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli. Bước 3; Chuyển vector mang biến nạp từ E.coli sang A.tumefaciens. Bước 4: Lây nhiễm Agrobacterium tumefaciens chứa gen biến nạp với tế bào, mô thực vật ñể tiến hành quá trình chuyển gen sang mô, tế bào ñích. Bước 5: Chọn lọc các mô, tế bào ñược biến nạp thành công. Bước 6: Tái sinh mô, tế bào biến nạp thành cây hoàn chỉnh. Sau ñó, từ cây chuyển gen thu ñược cần ñánh giá sự ổn ñịnh di truyền qua các thế hệ, sử dụng phương pháp lai hữu tính ñể thu ñược con cái mang gen mong muốn. [30] 2.3.2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens a) Cơ sở về khả năng tái sinh ở thực vật Trong kỹ thuật chuyển gen vào thực vật thì những ñối tượng thường ñược sử dụng ñể chuyển gen là: mô lá, mô thân, mẫu callus hay các tế bào tách rời..sau khi chuyển gen thành công các tế bào này phải ñược ñưa vào các môi trường phù hợp ñể tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quả Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 8 của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Về cơ bản, 2 quá trình này là các quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời ñiểm nào ñó trong quá trình phát triển cá thể có một số gen ñược hoạt hóa ( vốn trước ñó các gen này bị ức chế) ñể cho ta tính trạng mới còn một số gen khác lại bị ñình chỉ hoạt ñộng. ðiều này xảy ra theo một chương trình ñã ñược mã hóa trong cấu trúc phân tử của DNA của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn ñược hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh, khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [30] Do ñó, việc lựa chọn và ñiều chỉnh môi trường nuôi cấy và tế bào thực vật ñóng vai trò quan trọng góp phần quyết ñịnh sự thành công của thí nghiệm biến nạp. Yêu cầu cơ bản ñối với hệ thống tái sinh: - Các mẫu tế bào, mô dùng cho quá trình chuyển gen cần phải có khả năng phân chia invitro nhanh. - Các mô, tế bào này phải có khả năng nhận gen mới. - Quy trình tái sinh cây phải có hiệu quả cao, không hoặc ít phụ thuộc vào kiểu gen. - Cây tái sinh phải có tỉ lệ sống cao khi ñưa ra ngoài ñiều kiện tự nhiên, tần số biến dị thấp và khả năng hữu thụ cao, ñể có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu ban ñầu tiếp tục tiến hành chuyển gen trong ñiều kiện invivo sau này. Nếu sự biến nạp xảy ra mà không có sự tái sinh, hoặc sự tái sinh diễn ra mà không kèm theo sự biến nạp thì thí nghiệm biến nạp ñó không thành công. Vì vậy, trong chuyển gen, cả giai ñoạn biến nạp và giai ñoạn tái sinh cây ñều có ý nghĩa quan trọng. b) Cơ chế chuyển gen của Agrobacterium tumefaciens Bước ñầu của quá trình nhiễm là A. tumefaciens gắn vào một tế bào của cây ở vị trí vết thương hở, thường là ở phần gốc của thân cây. Sau bước gắn khởi ñầu, A. tumefaciens sản sinh một mạng lưới các sợi xellulose liên kết chặt vi khuẩn vào Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp …………………….. 9