Tài liệu Nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thương mại

i LỜI CẢM ƠN Trong thời gian 3 tháng vừa qua với sự nỗ lực của bản thân cùng với sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô, cha me và bạn bè, đến nay em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình. Em xin trân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các thầy cô viện Công nghệ sinh học và Môi trƣờng đã truyền đạt những kiến thức trong những năm học vừa qua. Đồng thời em xin chân thành cảm ơn các cán bộ và nhân viên phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sin học và môi trƣờng đã tận tình giúp đỡ em tạo điều kiện cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths. Nguyễn Công Minh đã trực tiếp hƣớng dẫn em hết sức tận tình và chu đáo trong suốt thời gian làm khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình và bạn bè đã động viên khích lệ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận. Nha Trang, tháng 6 năm 2012 Sinh viên thực hiện Mai Thị Ngọc Diệp ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................i MỤC LỤC ................................................................................................................... ii DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................v LỜI MỞ ĐẦU ..............................................................................................................1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................2 1.1. Tổng quan về phế liệu tôm. ...............................................................................2 1.2. Tổng quan về carotenoprotein. ..........................................................................3 1.2.1. Sự tồn tại của carotenoprotein. ...................................................................3 1.2.2. Tính chất của carotenoprotein ....................................................................4 1.2.3. Ứng dụng của carotenoprotein. ..................................................................6 1.3. Tổng quan về enzyme protease. .........................................................................7 1.3.1. Đặc tính của enzyme protease. ...................................................................7 1.3.2. Ứng dụng của enzyme protease. .................................................................9 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc. ....................................................12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. ............................................................12 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. ............................................................16 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................20 2.1. Nguyên vật liệu:...............................................................................................20 2.1.1Nguyên liệu đầu tôm:..................................................................................20 2.1.2. Enzyme Alcalase.......................................................................................20 2.1.3. Enzyme Flavourzyme. ..............................................................................20 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu. ................................................................................21 2.2.1. Sơ đồ tổng quát thí nghiệm .......................................................................21 2.2.2. Xác định chế độ thích hợp để tách chiết protein giàu carotenoid từ đầu tôm bằng Alcalase. ..............................................................................................22 2.2.2.1. Xác định tỷ lệ enzyme/phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase. .................................................................................................22 2.2.2.2. Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase. ..........................................................................................................24 iii 2.2.3.Xác định chế độ thích hợp để tách chiết carotenoid từ đầu tôm ở giai đoạn hai bằng enzyme Flavourzyme (sau khi đã xử lý bằng Alcalase)......................25 2.2.3.1. Xác định tỷ lệ enzyme/ phế liệu thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Flavourzyme ...........................................................................................25 2.2.3.2. Xác định thời gian xử lý thích hợp cho công đoạn thủy phân Flavourzyme. ...................................................................................................26 2.3. Các phƣơng pháp phân tích sử dụng trong đề tài. ..........................................27 2.4.Phƣơng pháp xử lý số liệu ................................................................................27 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................28 3.1. Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm đầu thẻ chân trắng. .................28 3.2. Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme Alcalase. ..................................................................................................................29 3.2.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin. ........................................................................................29 3.2.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme Alcalase/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin. ............................................................................32 3.3. Nghiên cứu điều kiện thủy phân carotenoprotein từ đầu tôm bằng enzyme Flavourzyme. ..........................................................................................................34 3.3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin. ........................................................................................34 3.3.2. Ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme Flavourzyme/ phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein và astaxanthin. ....................................................................36 3.4. Thành phần hóa học của carotenoprotein .......................................................38 3.5. Đề xuất quy trình thu hồi carotenoprotein bằng hỗn hợp hai enzyme. ..........38 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................39 4.1. Kết luận. ...........................................................................................................39 4.2. Đề nghị. ............................................................................................................39 TÀI LIỆU THAM KHẢO. .........................................................................................40 PHỤ LỤC ...................................................................................................................45 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần hóa học cơ bản của phế liệu tôm thẻ chân trắng ....................28 Bảng 3.2. Thành phần hóa học cơ bản của carotenoprotein ......................................38 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Quy trình sản xuất chitin của Pháp. ...........................................................13 Hình 1.2. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto........................................15 Hình 1.3. Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sỹ Trung. ..................................17 Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát. .............................................................21 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Alcalase ..23 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme Alcalase.......................................................................................................................24 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme. ..............................................................................................................25 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm cho công đoạn xác định thời gian enzyme Flavourzyme ...............................................................................................................26 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm. ..............................................................................................29 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm. .......................................................................................31 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm. ..............................................................................................32 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Alcalase/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm. .......................................................................................33 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm. ..............................................................................................34 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm. .......................................................................................35 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi protein từ phế liệu tôm. ........................................................................................36 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian enzyme Flavourzyme/phế liệu đến hiệu suất thu hồi astaxanthin từ phế liệu tôm. .................................................................................37 1 LỜI MỞ ĐẦU Cùng với sự phát triển của nền kinh tế trong và ngoài nƣớc, ngành thủy sản trong những năm gần đây đã đạt đƣợc những thành tựu đáng kể về nuôi trồng, chế biến cũng nhƣ xuất nhập khẩu. Trong các mặt hàng xuất khẩu của nƣớc ta thì mặt hàng tôm xuất khẩu luôn chiếm tỷ lệ lớn, chiếm hơn 50% tổng kim ngạch xuất khẩu. Theo Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP), trong sáu tháng đầu năm 2011, cả nƣớc đã xuất khẩu 101.872 tấn tôm, trị giá 971,109 triệu USD; tăng 16,9% về khối lƣợng và 35,2% về giá trị so với cùng kì năm 2010 và là nhóm hàng có mức tăng trƣởng cao nhất trong các nhóm hàng thủy sản xuất khẩu của Việt Nam. Mặc dù gặp nhiều khó khăn, xuất khẩu tôm vẫn đạt mức kỉ lục gần 2,4 tỉ USD. Theo VASEP cho biết dự kiến xuất khẩu tôm 2012 sẽ đạt 2,5 tỷ USD. Do đó lƣợng phế liệu tôm thải ra từ các nhà máy chế biến là khá lớn khoảng 100.000 tấn/ năm. Đây là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất protein, astaxanthin, chitin, chitosan…và các sản phẩm có giá trị kinh tế khác. Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu tận thu phế liệu tôm nhƣng chủ yếu tập trung vào quá trình thu hồi chitin–chitosan. Các quá trình sản xuất chitin– chitosan này thƣờng là các quá trình hóa học, sử dụng acid và base mạnh để khử khoáng và protein do vậy vừa gây ô nhiễm môi trƣờng do hóa chất vừa gây lãng phí về kinh tế vì không thể tận thu đƣợc các thành phần có giá trị nhƣ protein và carotenid. Nhằm giảm ô nhiễm môi trƣờng và tận thu đƣợc các thành phần có giá trị nhƣ protein và astaxanthin đề tài “Nghiên cứu điều kiện chiết rút carotenoprotein từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme protease thƣơng mại” đƣợc thực hiện. Nội dung thực hiện: - Xác định thành phần hóa học của đầu tôm the chân trắng. - Nghiên cứu điều kiện chiết carotenoprotein từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng các enzyme Alcalase, Flavourzyme. - Đánh giá chất lƣợng carotenoprotein thu đƣợc. - Đề xuất quy trình. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về phế liệu tôm. Phế liệu tôm chủ yếu là đầu và các mảnh vỏ, ngoài ra còn kể đến các mảnh thịt vụn do bóc nõn không cẩn thận, một số tôm bị hỏng. Tùy theo giống loài, phƣơng pháp gia công chế biến mà lƣợng phế liệu có thể lên đến 60% sản lƣợng khai thác đƣợc. Ví dụ tôm càng xanh, phần đầu tôm chiếm 60% khối lƣợng tôm, với tôm sú thì phần đầu chiếm khoảng 40% khối lƣợng tôm. Đối với sản phẩm tôm bóc nõn, rút ruột mất mát theo vỏ và đuôi khoảng 25% khối lƣợng tôm. Đối với tôm thẻ, lƣợng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, nhƣ vậy tổng khối lƣợng phế liệu vỏ, đầu tôm thẻ chiếm khoảng 37% [4]. Lƣợng phế liệu này có thể đƣợc giảm xuống bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế biến tốt hơn. Giảm lƣợng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử dụng chúng đang trở nên phổ biến nhƣ một phƣơng cách giúp làm tăng lợi nhuận cho ngành thuỷ sản. Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao mà còn có ý nghĩa trong việc bảo vệ môi trƣờng. Thành phần hóa học trong đầu tôm. Thành phần chiếm tỷ lệ đáng kể trong đầu tôm là protein, chitin, sắc tố, khoáng và enzyme…tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài đặc điểm sinh lí,…thành phần chitin và protein trong vỏ tôm tƣơi tƣơng ứng là 4,50% và 8,05%. Trong vỏ tôm khô là 11 – 27,50% và 23,25 – 53% Hàm lƣợng chitin, khoáng, protein và carotenoid trong phế liệu vỏ tôm thay đổi rất rộng phụ thuộc vào điều kiện bóc vỏ trong quá trình chế biến cũng nhƣ phụ thuộc vào loài, trạng thái dinh dƣỡng, chu kì sinh sản. Vỏ giáp xác chứa chủ yếu là protein (30-40%), khoáng (30-50%), chitin (13-42%) [34]. - Protein: protein trong phế liệu tôm thƣờng là loại protein không hòa tan, do đó khó trích ly ra khỏi vỏ, nó tồn tại dƣới hai dạng: - Dạng tự do: Tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ. - Dạng phức tạp: Liên kết với Chitin, CaCO3 nhƣ một phần thống nhất của vỏ tôm. 3 - Chitin: Tồn tại dƣới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác, chủ yếu là CaCO3 – thành phần chính tạo nên vỏ tôm, chính sự liên kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế. - Canxi: Trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lƣợng lớn muối vô cơ, chủ yếu là cacbonat canxi (CaCO3). - Astaxanthin: là sắc tố chủ yếu trong vỏ tôm, astaxanthin là dẫn xuất của carotenoid, thƣờng ở dạng liên kết với acid béo (ester hóa) hay với protein tạo nên một phức hợp chặt chẽ có màu xanh của tôm. Khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng bị oxy hóa thành astaxin. - Lipid: Chứa một lƣợng đáng kể, chủ yếu là các axit béo chƣa no bão hòa nhƣ eicosapentaenoic acid (EPA), decosahexaenoic (DHA). Đây là những acid béo rất có lợi cho sức khỏe con ngƣời và có nhiều ứng dụng trong y học. - Enzyme: Trong phế liệu tôm cũng có chứa một số loại enzyme, theo tạp chí Khoa học và Công nghệ Thủy sản (số 5/1993) thì hoạt độ enzyme protease của đầu tôm khoảng 6,5 đơn vị hoạt độ/gam tƣơi. Trong đầu tôm có chứa enzyme tiêu hóa chymotrypsin, đƣợc sử dụng trong điều trị ung thƣ. Một vài loại enzyme khác có mặt trong phế liệu tôm nhƣ alkaline phosphatase, β-N-acetyl glucosaminease, chitinase cũng đƣợc ứng dụng nhiều trong thực tế. 1.2. Tổng quan về carotenoprotein. 1.2.1. Sự tồn tại của carotenoprotein. Carotenoprotein là tên gọi chung của phức hợp bao gồm một protein và một carotenoid liên kết với nhau. Phức hợp protein và sắc tố này đƣợc tìm thấy rất phổ biến trong cơ thể động vật biển không xƣơng sống [24]. Sự tƣơng tác giữa carotenoid và protein là một đặc điểm sinh lý quan trọng trong cơ thể một số sinh vật sống. Carotenoid ở trong cơ thể sinh vật có tính bền vững hơn so với khi đã đƣợc tách chiết. Trong những hệ thống quang hợp, các sắc tố nhƣ carotenoid, chlorophyll hoặc bacteriochlorophyll đều đƣợc định vị trong những phức hợp protein - sắc tố nhằm đảm bảo vị trí và sự định hƣớng chính xác của các loại sắc tố này, đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền năng lƣợng ở cơ thể sinh vật. 4 Ngoài ra, sự phân bố của carotenoprotein trong tự nhiên cũng khá đa dạng. Ở thực vật, các carotenoid thƣờng định vị trên một số lƣợng lớn các grana của lục lạp, và chúng tồn tại ở dạng phức hợp carotenoprotein. Động vật không xƣơng sống ở biển nhƣ động vật da gai, động vật thân mềm, nhìn chung là các nhóm sinh vật chứa nhiều phức hợp carotenoprotein trong cơ thể. Bên cạnh đó, các loại tảo, bao gồm cả tảo đơn bào hai roi (indoflagellate) cũng sử dụng phức hợp carotenoprotein nhƣ những thụ quan ánh sáng. Carotenoid ở dạng tự do thƣờng có màu vàng, cam hoặc đỏ. Tuy nhiên, trong cơ thể những loài động vật biển không xƣơng sống, các phức hợp carotenoprotein tạo nên nhiều màu khác nhau nhƣ xanh lá cây, xanh dƣơng và tía. Một ví dụ điển hình là α-crustacyanin, một phức hợp astaxanthin - protein trong vỏ tôm hùm (Homarus gammarus) có màu xanh dƣơng. Khi còn sống, cơ thể loài tôm hùm này có màu xanh đen; tuy nhiên, sau khi đƣợc nấu chín, cơ thể chúng chuyển thành màu đỏ cam. Màu đỏ này đƣợc tạo ra nhờ một loại carotenoid là astaxanthin (3,3’dihydroxy-β,β’-carotene-4,4’-dione) đƣợc phóng thích ra ở dạng tự do thông qua quá trình biến tính phức hợp astaxanthin - protein bởi nhiệt. 1.2.2. Tính chất của carotenoprotein Carotenoprotein là phức hợp của carotenoid và protein. Tuy nhiên, đối với đối tƣợng lớp giáp xác thì thành phần carotenoid này chủ yếu là astaxanthin. Do vậy trong phạm vi nghiên cứu một khóa luận tốt nghiệp, tôi chủ yếu tập trung đề cập những thông tin về dạng phức hợp astaxanthin - protein. Astaxanthin là một trong các sắc tố carotenoid, có màu đỏ cam, đƣợc tìm thấy trong một số loài thủy sản nhƣ cá hồi, cá hồng, tôm, cua...trong vi tảo nƣớc ngọt Haematococcus pluvialis, trong nấm men Phaffia rhodozyma... là chất tan trong lipid có khối lƣợng phân tử 596,8 Da. Trong tự nhiên astaxanthin thƣờng tồn tại ở dạng astaxanthin liên kết với protein tạo phức chất có màu xanh đen. Khi gia nhiệt hay bị oxy hóa, liên kết giữa astaxanthin và protein bị cắt đứt, giải phóng astatin có màu đỏ cam. 5 Phức hợp carotenoid – protein Bản chất của sự liên kết. Theo P.F.Zagalsky (1976) [39], carotenoprotein đƣợc chia làm 2 loại chính: loại 1, kém bền vững hơn loại 2, là dạng phức hợp carotenoprotein mà trong đó, thành phần carotenoid liên kết với một lipo(glyco)protein. Trong khi đó, loại 2 là dạng phức hợp mà carotenoid kết hợp với một protein đơn giản hoặc một glycoprotein. Dạng 1 thƣờng hiện diện ở buồng trứng, trứng và máu của động vật không xƣơng sống. Mặt khác, dạng 2 thƣờng đƣợc tìm thấy ở vùng bề mặt (vỏ và da) của chúng. Carotenoid đƣợc cho là nằm sâu trong lòng phức hợp, bị cách ly gần nhƣ hoàn toàn với môi trƣờng nƣớc, với nhóm 4 và 4’-keto của nó đƣợc định vị gần bề mặt của phân tử protein. Cơ chế “liên kết nhờ sức căng” đƣợc các nhà nghiên cứu đề xuất yêu cầu phải có sự ăn khớp giữa chuỗi polypeptide và các nhóm methyl của chuỗi polyene, đồng thời phải có sự duy trì bền vững của cấu trúc vòng β-ionone. Hàm lƣợng cao các loại amino acid kích thƣớc nhỏ tạo điều kiện dễ dàng hơn cho sự khớp nối giữa chuỗi polyme và khung sƣờn polypeptide. Cấu trúc của phức hợp carotenoprotein hầu nhƣ đƣợc hình thành từ các xoắn ngẫu nhiên (random coil) và có dạng cấu hình phiến β. Một minh chứng rõ rệt là trong thành phần carotenoprotein, hàm lƣợng amino acid leucine (giúp làm bền kiểu cấu hình xoắn α) rất thấp nhƣng hàm lƣợng các loại amino acid khác nhƣ proline, serine, glycine và asparagine (làm phá vỡ cấu trúc xoắn α) tƣơng đối cao. Điển hình nhƣ trong phức hợp crustacyanin, tỉ lệ cấu trúc xoắn α chỉ chiếm khoảng 6% [39]. Bên cạnh đó, trong thành phần phức hợp carotenoprotein, các amino acid thƣờng thấy trong dạng cấu hình β nhƣ isoleucine, valine, threonine và glutamine hiện diện với tỉ lệ không nhỏ, đồng thời một số lƣợng lớn các “cấu trúc quay ngƣợc” β (β-bends) cũng đƣợc tìm thấy (cấu trúc này hỗ trợ sự hình thành của dạng cấu hình phiến β đối song song. Sự dịch chuyển bƣớc sóng hấp thụ cực đại. 6 Phức hợp carotenoprotein hòa tan trong nƣớc và có tính bền vững, trong một vài trƣờng hợp, màu sắc của nó bền đến vài năm trong không khí ở điều kiện nhiệt độ phòng. Ngoài ra, sự tƣơng tác giữa protein và astaxanthin dẫn đến sự thay đổi lớn về bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại (spectral shift), từ đó dẫn đến sự thay đổi về màu sắc của nó. Chẳng hạn, trong cơ thể động vật giáp xác, astaxanthin thƣờng liên kết với các phân tử protein tạo thành phức hợp α-crustacyanin, hấp thụ cực đại bức xạ ở bƣớc sóng 628 nm, tạo nên màu xanh đen đặc trƣng thƣờng thấy ở các loài thủy sản sống. Dƣới tác dụng của nhiệt, liên kết trên bị phá hủy và giải phóng astaxanthin tự do (có bƣớc sóng hấp thụ cực đại chỉ là 480nm) màu đỏ cam. Sự thay đổi bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của astaxanthin trong phức hợp carotenoprotein so với dạng phân tử tự do phụ thuộc vào sự liên kết của nó với thành phần apoprotein, về vị trí không gian, và chính bản chất cấu trúc của astaxanthin. 1.2.3. Ứng dụng của carotenoprotein. Carotenoid và carotenoprotein chịu trách nhiệm tạo nên những màu sắc khác nhau trong cơ thể động vật giáp xác. Những hợp chất này thu hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhờ vào các tính chất quan trọng của chúng nhƣ có nguồn gốc tự nhiên, không chứa độc tố, cung cấp những sắc tố tan đƣợc cả trong nƣớc và chất béo. Một trong những ứng dụng đƣợc quan tâm lớn hiện nay của phức hợp carotenoprotein là nó có thể đƣợc sử dụng làm thức ăn cho cá hồi để tạo nên màu sắc tƣơi tự nhiên cho thịt cá [30]. Do cá hồi không thể tự tổng hợp astaxanthin, chúng phải thu nhận astaxanthin từ nguồn bên ngoài nhƣ ở các loại vi tảo hoặc từ thức ăn có bổ sung loại sắc tố này [36]. Mặt khác, trong tình hình hiện nay, khi mà nguồn astaxanthin tổng hợp bị kiểm duyệt nghiêm ngặt về tính an toàn với sức khỏe con ngƣời, nhu cầu astaxanthin tách chiết từ nguồn nguyên liệu tự nhiên phát triển mạnh mẽ hơn bao giờ hết [30]. Bên cạnh đó, nhờ vào tính chất không gây ra các phản ứng dị ứng trong cơ thể ngƣời, dạng astaxanthin tự nhiên (ở dạng tự do và dạng phức hợp 7 carotenoprotein) hiện nay đã đƣợc nghiên cứu trong những ứng dụng mỹ phẩm và thẫm mỹ [32]. Một hƣớng ứng dụng khác của phức hợp carotenoprotein, đó là dựa trên tính chất dịch chuyển bƣớc sóng của bức xạ hấp thụ cực đại của phức hợp này so với phân tử sắc tố tự do, kéo theo sự thay đổi về màu sắc, mà carotenoprotein có thể đƣợc sử dụng làm chất chỉ thị cảm ứng nhiệt độ, đối với cả khoảng nhiệt gây ra xảy ra sự đổi màu thuận nghịch và không thuận nghịch. Cuối cùng, carotenoprotein còn có tiềm năng trong việc sử dụng để bổ sung vào nguồn thực phẩm cho ngƣời khi mà nhu cầu về protein thực phẩm ngày càng tăng mạnh trên toàn cầu, đặc biệt là ở các nƣớc chƣa phát triển. Carotenoprotein chứa nhiều loại amino acid thiết yếu, đồng thời lại kết hợp với thành phần carotenoid (chủ yếu là astaxanthin), rất có lợi cho sức khỏe con ngƣời nhờ khả năng chống oxy hóa mạnh (gần gấp 10 lần so với các loại carotenoid khác nhƣ zeaxanthin, lutein, canthaxanthin và β-carotene, và mạnh hơn gấp 500 lần so với αtocopherol). Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã tập trung vào đối tƣợng carotenoprotein nhƣ là nguồn thực phẩm mới giúp giảm thiểu hoặc kiểm soát các bệnh liên quan đến vấn đề ăn uống nhƣ: chứng xơ vữa động mạch, ung thƣ, suy thận và suy gan [17] cũng nhƣ giúp kiểm soát cân nặng cho các bệnh nhân đang đƣợc điều trị [38]. 1.3. Tổng quan về enzyme protease. 1.3.1. Đặc tính của enzyme protease. Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất protein ra, có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học xảy ra nhanh chóng trong điều kiện sinh lý bình thƣờng của cơ thể sống và chỉ cần một lƣợng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một lƣợng cơ chất lớn. Protease là enzyme thủy phân liên kết peptid của phân tử protein. Enzyme protease đƣợc phân thành hai dạng là endoprotease và exoprotease. - Các endoprotease nhƣ trypsin, chymotrypsin, chymosin thủy phân các liên kết peptid bên trong chuỗi polypeptid. 8 - Các exoprotease cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptid, các exoprotease cắt vào đầu các nhóm carboxyl tận cùng đƣợc gọi là carboxylpeptidese còn những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi là aminopeptidase [27]. Các endo và exoprotease kể trên cộng tác với nhau rất có hiệu quả trong việc phân giải protein. Có thể nói rằng, chức năng chính của endoenzyme tạo ra một lƣợng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động [23]. Tuy nhiên, tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của acid amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hƣởng mạnh đến hoạt động của các enzyme. Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao [27]. Hiện nay, các enzyme protease đã đƣợc thƣơng mại hóa nhƣ enzyme Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Neutrase … Enzyme Alcalase. Năm 1947, Linderstrom, Lang và Ottesen tại phòng thí nghiệm Carlsberg đã tiến hành nuôi cấy Bacillus licheniformis và thu đƣợc loại enzyme Subtilisin Carlsberg. Nó đƣợc thu lần đầu tiên ở dạng kết tinh vào năm 1952 và từ đó đến nay, subtilisin là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, đƣợc sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa. Subtilisin là một nhóm enzyme protease kiềm (serine protease) và Alcalase là một dẫn xuất thuộc nhóm này đã đƣợc thƣơng mại hóa. Điều kiện hoạt động tối ƣu của Alcalase là ở khoảng pH hơi kiềm. Một số nghiên cứu cho thấy enzyme Alcalase hoạt động tối ƣu ở pH = 8, nhiệt độ 50 – 600C [29]. Alcalase đƣợc xếp vào nhóm endoprotease, nó bị bất hoạt ở điều kiện pH thấp. Enzyme Flavourzyme. Flavourzyme là peptidase mang cả hai hoạt tính endo và exoprotease (aminopeptidase), đƣợc sản xuất từ quá trình lên men chìm loài Aspergillus oryzae. Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu. 9 Điều kiện hoạt động tối ƣu của Flavourzyme 500 L là pH 5 – 7, nhiệt độ khoảng 500C. Flavourzyme 500 L có hoạt tính 500 L APU/g. Flavourzyme có thể bị ức chế hoạt động ở 90°C trong 10 minutes hoặc 120°C trong 5 giây [21]. 1.3.2. Ứng dụng của enzyme protease. Ngày nay, cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học… thì enzyme protease đƣợc ứng dụng khá rộng rãi nhất là trong ngành công nghiệp thực phẩm. Quá trình thủy phân protein có thể đƣợc tiến hành bằng cách sử dụng đơn enzyme hoặc kết hợp nhiều enzyme, tuy nhiên hiệu quả của quá trình thủy phân khi sử dụng đơn enzyme không đƣợc tốt. Vì vậy, sự kết hợp các hệ enzyme endoprotease và exoprotease khác nhau đƣợc tiến hành. Việc bổ sung endoprotease trong giai đoạn đầu của quá trình sẽ làm tăng số lƣợng chuỗi peptid do đó tăng số lƣợng đầu C và đầu N tận cùng để các exoprotease hoạt động [27]. Hơn nữa, sau khi thêm endoprotease, pH của dung dịch phản ứng sẽ giảm chậm từ giá trị pH ban đầu là 8,5 xuống gần 7 đây là pH thích hợp của các exopeptidase, sau 24 giờ thủy phân bằng exopeptidase, giá trị pH của dịch thủy phân giảm còn 6,5 [21]. Khi thủy phân một enzyme, hiệu suất thƣờng đạt không cao do enzyme đó chỉ mang một trong hai đặc tính hoặc là exo hoặc là endoprotease. Theo nghiên cứu của Adriena Drya´kova (2010) khi sử dụng một enzyme để thủy phân protein sữa chua trong 4 loại enzyme đƣợc sử dụng là Alcalase, Neutrase, Protamex và Flavourzyme thì Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân cao nhất với DH đạt đƣợc tƣơng ứng là 37% điều đó đã chứng tỏ ƣu thế vƣợt trội khi enzyme mang bản chất exoprotease [15]. Nhƣ vậy việc kết hợp nhiều enzyme để thủy phân protein là có triển vọng. Theo Chulaporn Kamnerdpetch và cộng sự (2007) [21], trong quá trình thủy phân bột khoai tây, Alcalase hoặc Flavourzyme thích hợp để thủy phân hơn novo – pro D hoặc corolase . Tuy nhiên độ thủy phân đạt cao nhất chỉ đạt 22%, (đối với mẫu sử dụng Flavourzyme). Báo cáo cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp endoprotease 10 Alcalase hoặc novo – pro D và exopeptidase Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân tốt hơn khi sử dụng đơn enzyme. Độ thủy phân đạt cao nhất 44% khi sử dụng phối hợp Alcalase và Flavourzyme (2% Alacalse (v/w) + 5% Flavourzyme (w/w)). Hơn nữa, hàm lƣợng amino acid trong dịch thủy phân đạt rất cao, đặc biệt là các acid amin thiết yếu (His, Phe, Trp and Tyr) và acid amin chứa lƣu huỳnh methionine (Met)[21]. 1999, Javier Vioque và cộng sự đã tiến hành thủy phân Rapeseed Protein, kết quả cho thấy rằng, nếu chỉ sử dụng Alcalase thì độ thủy phân đạt tối đa là 27%, tuy nhiên khi ông tiến hành ủ Alcalase trong 60 phút rồi cho tiếp Flavourzyme vào và ủ tiếp 2 giờ, độ DH đạt tối đa là 60% [28]. Việc sử dụng hai enzyme Alcalase và Flavourzyme cũng đã đƣợc Cristina Megías (2009) ứng dụng trên sunflover protein. Theo Cristina Megías sau khi thủy phân Alcalase 60 phút, DH đạt 27%, tuy nhiên, nếu dùng cả hai loại enzyme Alcalase và Flavourzyme thì sau 2 giờ thủy phân DH có thể đạt > 66% [19]. Theo Hee Jeong Chae (1998), sử dụng kết hợp 3 enzyme Neutrase, Alcalase và Flavourzyme để thủy phân protein sẽ cho độ thủy phân cao hơn khi sử dụng kết hợp hai enzyme Alcalase và Flavourzyme. Theo tác giả này, độ thủy phân đạt cao nhất khi sử dụng kết hợp 3 enzyme là 51% trong khi đó giá trị DH chỉ đạt 47 % khi sử dụng hai enzyme [26]. Đối với phế liệu protein tôm, việc ứng dụng enzyme để tách protein trong quá trình sản suất chitin đã đƣợc quan tâm từ lâu. Tuy nhiên, các nghiên cứu chỉ dừng lại ở hƣớng nghiên cứu đơn enzyme để tách protein. Do vậy việc ứng dụng phƣơng pháp kết hợp đa enzyme trong quá trình tách protein tôm là một hƣớng mới cần đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều hơn trong thời gian đến. Enzyme protease đƣợc dùng để thủy phân protein trong sản xuất chitin, astaxanthin, bột đạm… Phần lớn phế liệu tôm tại Việt Nam cũng nhƣ trên thế giới hiện nay chủ yếu đƣợc sử dụng để sản xuất chitin – chitosan, một ứng dụng có ý nghĩa lớn. Công nghệ sản xuất chitin - chitosan còn đang gặp nhiều bất cập khi các 11 quy trình sản xuất chitin - chitosan quy mô lớn tại Việt Nam chủ yếu là quy trình hóa học. Việc sử dụng hóa chất với nồng độ cao dẫn đến lƣợng chitin - chitosan thu đƣợc chƣa cao và nhiều tạp chất. Mặt khác các quy trình này chỉ tập trung vào việc thu nhận chitin – chitosan chƣa chú trọng đến việc tận thu các sản phẩm khác của phế liệu tôm nhƣ protein, chất màu. Các hóa chất và chất hữu cơ chƣa đƣợc tận thu thải ra gây ô nhiễm môi trƣờng. Việc kết hợp enzyme protease trong quá trình sản xuất chitin - chitosan có ƣu thế hơn so với phƣơng pháp hóa học truyền thống. Nó giảm thiểu lƣợng hóa chất sử dụng và thải ra môi trƣờng. Mặt khác, quy trình cải tiến với sự vƣợt trội về chất lƣợng chitin - chitosan thu đƣợc và thu hồi sản phẩm protein - astaxanthin có giá trị dinh dƣỡng và sinh học, làm hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nƣớc thải, giảm thiểu chi phí xử lý môi trƣờng. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trƣờng trầm trọng do các cơ sở chế biến chitin - chitosan gây ra, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất chitin - chitosan từ phế liệu thủy sản. Đây là một hƣớng đi cho phƣơng pháp sản xuất sạch hơn. Bên cạnh đó, việc kết hợp sinh học và hóa học còn đảm bảo vấn đề giá thành sản xuất hợp lý, cơ hội cho mở rộng sản xuất với quy mô lớn. Chitin - chitosan thu đƣợc có chất lƣợng cao hơn so với phƣơng pháp hóa học, đặc biệt là độ nhớt và phân tử lƣợng. Đồng thời, giảm hơn 50% lƣợng hóa chất sử dụng so với phƣơng pháp hóa học truyền thống. Enzyme protease còn dùng để thủy phân phế liệu cá để sản xuất phế phẩm dẫn mùi giàu đạm dùng trong thức ăn nuôi tôm, cá hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Với công nghệ sản xuất đơn giản sử dụng chất xúc tác enzyme của vi khuẩn đã phân lập đƣợc bổ sung vào phế liệu thủy sản (đầu, xƣơng cá), chúng sẽ tự tách phần thịt ra khỏi xƣơng. Với phần thịt đƣợc cô đặc giàu chất đặc giàu chất đạm trộn với thức ăn cho tôm, phần xƣơng đƣợc làm sạch, sấy khô, nghiền thành bột dùng cho chăn nuôi gia súc. Biện pháp không những xử lý ngay đƣợc chất thải rắn với chi phí thấp, mà còn mang lại hiệu quả kinh tế từ việc sản xuất ra thức ăn dùng cho chăn nuôi đƣợc ngƣời tiêu dùng chấp nhận. 12 1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc. 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc. Các nhà nghiên cứu trên thế giới từ lâu đã quan tâm đến lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitin – chitosan, protein và carotenoid từ phế liệu tôm bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ phƣơng pháp hóa học, phƣơng pháp sinh học hay kết hợp giữa phƣơng pháp hóa học và sinh học. Quá trình sản xuất chtin – chitosan theo phƣơng pháp hóa học diễn ra theo các bƣớc sau: Nguyên liệu → xử lý acid (khử khoáng)→ xử lý kiềm (khử protein và deaceatyl) → sản phẩm (có độ deaceatyl khác nhau) Quy trình sản xuất chitosan của Pháp [6]. 13 Vỏ tôm Hấp chín, phơi khô Xay nhỏ Tách protein NaOH 3,5% Nhiệt độ = 650C Thời gian 2h w/v = 1/10 Rửa trung tính Ngâm HCl HCl 1N Nhiệt độ phòng Thời gian 2 h w/v =1/10 Ngâm aceton Ngâm NaOCl NaOCl 0,135% Nhiệt dộ phòng Thời gian 6 phút w/v = 1/10 Rửa trung tính Deacetyl chitin NaOH 40% Nhiệt độ = 850C Thời gian 4 giờ w/v = 1/4 Rửa trung tính Chitosan Hình 1.1. Quy trình sản xuất chitin của Pháp. Quy trình sản xuất này rút ngắn đƣợc thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm thu đƣợc rất sạch có màu trắng đẹp do đã khử đƣợc sắc tố triệt để. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hóa mạnh nên ảnh hƣởng đến mạch polymer làm cho độ 14 nhớt của sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác, aceton rất đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm cao. Tách chiết chitin bằng phƣơng pháp hóa học tuy có ƣu điểm nhƣ đơn giản, hiệu quả, dễ triển khai ở qui mô lớn. Tuy nhiên, phƣơng pháp hóa học cũng có một số nhƣợc điểm nhƣ xử lý bằng acid và kiềm ở nồng độ cao, thời gian dài dẫn đến chất lƣợng sản phẩm chitin, chitosan thu đƣợc có độ nhớt và phân tử lƣợng thấp, đồng thời sản phẩm có thể còn chứa tạp chất hóa học, chƣa tận thu nguồn protein và astaxanthin có giá trị để ứng dụng trong chế biến thức ăn. Bên cạnh đó, lƣợng hóa chất thải ra từ qui trình sản xuất là rất lớn, gây ô nhiễm môi trƣờng. Vì vậy, việc hạn chế sử dụng hóa chất, cải tiến công nghệ theo hƣớng thân thiện môi trƣởng, ứng dụng công nghệ sinh học trong chế biến chitin - chitosan là xu thế hiện nay nhằm nâng cao chất lƣợng chitin, chitosan, tận thu các thành phần có giá trị phi chitin (protein và astaxanthin,…), giảm thiểu chất thải hóa học, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp chế biến chitin. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto (2006) [25]. 15 Phế liệu tôm Khử protein bằng enzyme Alcalase pH = 8,5 t0 = 550C tỷ lệ enzyme/ nguyên liệu: 3% w/v = 1/1 Ly tâm (40C, 15 phút) Phần bã Phần dịch nổi phía trên Chiết astaxanthin bằng dầu nành và hỗn hợp dung môi Sấy lạnh Khử khoáng HCl 2,5%, 2h, t0 phòng Bột protein Rửa trung tính Sấy khô (600C, 16h) Chitin Hình 1.2. Quy trình sản xuất chitin của Holanda và Netto. Quy trình này có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm chitin thu đƣợc cho chất lƣợng khá tốt, màu trắng đẹp do đã đƣợc khử sắc tố trong công đoạn chiết astaxanthin. Ngoài ra còn tận thu đƣợc protein và astaxanthin mang lại hiệu quả kinh tế cao, đồng thời giảm thiểu đƣợc lƣợng hóa chất sử dụng. Synowiecki và cộng sự (2000) nghiên cứu ứng dụng Alcalase để khử protein của phế liệu vỏ tôm Cangon cangon thu hồi chitin - protein. Ban đầu vỏ tôm Cangon cangon đƣợc khử khoáng sơ bộ bằng dung dịch HCl 10% ở 20 0C trong 30