Tài liệu Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô cơ của tôm sú penaeus monodon tại việt nam

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---- oOo---- LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGHIÊN CỨU HỆ PHIÊN MÃ TỪ MÔ CƠ CỦA TÔM SÚ PENAEUS MONODON TẠI VIỆT NAM. NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60420114 Giáo viên hƣớng dẫn: PGS.TS Đinh Duy Kháng Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Minh Thƣ Khóa học : 2012 - 2014 LỜI CÁM ƠN Hà Nội, 2014 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận văn này trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS Đinh Duy Kháng Phòng vi sinh vật học phân tử, Viện công nghệ sinh học người luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đồng Văn Quyền, Trưởng Phòng vi sinh vật học phân tử, Phó viện trưởng Viện công nghệ sinh học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi được nghiên cứu và thực hiện luận văn tại phòng. Qua đây tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Thị Tuyết Nhung, ThS. Hà Thị Thu, ThS. Nguyễn Thị Hoa, các cô chú, anh chị đang công tác tại phòng Vi sinh vật học phân tử, những người luôn tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong lĩnh vực chuyên môn cùng với tinh thần làm việc khoa học và nghiêm túc. Trong thời gian thực tập, lãnh đạo phòng và các cô chú, anh chị trong phòng đã giúp tôi trưởng thành hơn rất nhiều. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Trường Đại Học Thái Nguyên, Viện Sinh Thái và Tài Nguyên Sinh Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học đã hướng dẫn và truyền thụ kiến thức cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới những người than trong gia đinh tôi, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó./. Hà nội, ngày 21 tháng 12 năm 2014 Học viên: Nguyễn Thị Minh Thư Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ cDNA Complementary ddNTP Dideoxyribonucleotide DNA Deoxyribonucleotide axit dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate EST Expressed sequence tag FC Flow Cell GO Gene Ontology Kb Kilo base KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes mRNA RNA thông tin NGS Next Generation Sequencing PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragement Length Polymorphism RNA Ribonucleotide axit SBL Sequencing By Ligation SBS Sequencing By Synthesis TF Transcription factor Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU .........................................................................................1 1.1. 1.2. Đặt vấn đề ................................................................................................ 1 Mục tiêu đề tài ......................................................................................... 3 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................4 2.1. Đại cƣơng về Tôm Sú............................................................................. 4 2.1.1. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú ............................................................ 4 2.1.2. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng ..................................... 8 2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú ....................................................... 9 2.2. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú.... 10 2.3. Các công trình nghiên cứu về Tôm Sú. ................................................. 12 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới.................................................... 13 2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam .................................................... 14 2.4. Khái quát về hệ phiên mã ...................................................................... 16 2.5. Giới thiệu về công nghệ giải trình tự thế hệ mới .................................. 18 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 27 3.1. Vật liệu .................................................................................................. 27 3.1.1. Đối tƣợng............................................................................................ 27 3.1.2. Trang thiết bị ...................................................................................... 27 3.1.3. Sinh phẩm ........................................................................................... 27 3.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 28 3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................... 29 3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết và tinh chế mRNA tổng số từ mô Cơ .......... 29 3.3.3. Gắn Adaptor ....................................................................................... 32 3.3.4. Khuếch đại các đoạn DNA đã gắn Adaptor ....................................... 32 CHƢƠNG IV : KẾT LUẬN VÀ THẢO LUẬN KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 50 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình 1 Hình ảnh tôm sú ....................................................................................... 4 Hình 2: Vòng đời của Tôm sú .............................................................................. 8 Hình 3: Tôm sú thu từ vùng biển Nghệ An ........................................................ 27 Hình 4. FC chứa 8 kênh (A), trong mỗi kênh của FC (B) đã đƣợc gắn hàng triệu primer xuôi (F) và ngƣợc (R) bằng liên kết cộng hóa trị. Các mồi này bắt cặp bổ sung với đầu gắn adaptor trên các đoạn cDNA tổng hợp từ phân đoạn mRNA tôm sú ..................................................................... 34 Hình 5. Tổng hợp sợi DNA mới nhờ Taq DNA polymerase, primer gắn FC và khuôn là cDNA sợi đơn gắn adaptor tổng hợp từ mRNA mô cơ tôm sú. .............................................................................................................. 35 Hình 6. Sợi DNA tổng hợp mới gắn với một vị trí nhất định trên FC. .............. 35 Hình 7. Đầu 3’ của sợi mới tổng hợp bắt cặp bổ sung với primer xuôi (F) gắn trên FC và quá trình kéo dài chuỗi nhờ Taq lại xảy ra. ........................ 36 Hình 8. Quá trình hình thành cụm (Cluster) DNA đồng nhất trên mỗi vị trí của FC nhờ hình thành cầu nối (A) và khuếch đại cầu nối (B), biến tính tạo mạch thẳng (C) và cắt bỏ sợi nghĩa khỏi FC (D). ................................ 36 Hình 9. Giải trình tự bằng việc bổ sung các primer giải trình tự bắt cặp bổ sung với adaptor ở đầu 3’ của các sợi gắn FC (A) và kéo dài chuỗi nhờ Taq DNA polymerase với 4 bazơ gắn 4 chất màu khác nhau theo nguyên lý kết thúc hồi tính (Reversible Terminator, B). ...................................... 37 Hình 10. Các bƣớc tách chiết, tinh chế phân cắt và tổng hợp cDNA ................ 39 Hinh 11. Các bƣớc gắn adaptor, khuếch đại bằng PCR và chọn đoạn gen có độ dài thích hợp để giải trình tự. ............................................................... 41 Hình 15. Chất lƣợng trình tự theo vị trí trên trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý ...... 45 Hình 16. Chất lƣợng trình tự theo vị trí trên trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý .... 45 Hình 17. Thống kê độ dài của toàn bộ trình tự đọc mô cơ sau khi tiền xử lý ... 45 Hình 18. Phân bố Contigs theo độ dài lắp ráp ................................................... 46 Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nuôi trồng thuỷ sản là ngành kinh tế quan trọng đóng góp một phần đáng kể trong thị phần xuất khẩu của Việt Nam cũng nhƣ nhiều quốc gia trong khu vực. Trong đó, ngành nuôi tôm là một trong những ngành mũi nhọn mang lại nguồn ngoại tệ lớn. Chiến lƣợc phát triển ngành nuôi trồng tôm sú ở Việt Nam cũng nhƣ của các nƣớc trong khu vực là làm sao để có đƣợc ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế đƣợc tối thiểu các tác động tiêu cực đến môi trƣờng, sinh thái. Nền tảng cho chiến lƣợc phát triển này là phát triển nguồn tôm bản địa với các chƣơng trình nhân giống khoa học để nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trƣởng. Để đạt đƣợc mục đích này, việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen (genome) tôm sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng hết sức quan trọng. Tôm sú (Penaeus monodon) là loài thủy sản đƣợc nuôi trồng và mang lại lợi nhuận rất lớn nhờ xuất khẩu cho nhiều quốc gia ở châu Á - Thái Bình Dƣơng (Thái Lan, Việt Nam, Hàn Quốc, Đài Loan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ, Autralia v.v...). Năm 2008, tổng sản lƣợng tôm trên toàn thế giới đạt 6 triệu tấn, đạt giá trị thƣơng mại 10 tỷ USD, chiếm 16% tổng kim ngạch xuất khẩu hải sản (Leu và cs, 2010). Riêng ở Việt Nam, theo Hội nghị tổng kết xuất khẩu tôm năm 2012 do VASEP tổ chức vào ngày 28/12/2012 tại thành phố Hồ Chí Minh thì kim ngạch xuất khẩu tôm năm 2012 đạt khoảng 2,25 tỷ USD. Ngày 2/11/2014, tại hội nghị tổng kết nuôi tôm nƣớc lợ 2014 cho biế t: 9 tháng đầu năm 2014 xuấ t khẩ u tôm của Viê ̣t Nam đa ̣t gầ n 2,94 tỷ USD , tăng 42% so với cùng kỳ . Đến cuối năm dự báo xuất khẩu tôm sẽ đạt mức 3,8 tỷ USD. Xuất khẩu tôm nhiều năm liền độc chiếm ngôi đầu, chiếm trên 50% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ sản của cả nƣớc. Ở nƣớc ta nghề nuôi tôm sú Penaeus monodon đã và đang phát triển mạnh trong những năm gần đây. Thống kê cho thấy, năm 2012 tổng diện tích nuôi tôm trên cả nƣớc là 530000 héc ta (ha). Dự kiến năm 2014, con số này sẽ tăng lên Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 1ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn đến 600000 ha và sản lƣợng dự kiến sẽ là 270000 tấn. Sản lƣợng nuôi tôm sú qua các năm tăng mạnh kéo theo giá trị xuất khẩu tôm sú cũng tăng nhanh tạo ra nguồn lợi đáng kể cho kinh tế nƣớc ta.Việt Nam xuất khẩu tôm vào 92 thị trƣờng, trong đó tôm sú chiếm trên 50% giá trị xuất khẩu mặt hàng tôm. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm của nƣớc ta hàng năm chịu thiệt hại rất lớn do dịch bệnh, trong đó dịch bệnh do virus đóng vai trò chủ yếu. Vì vậy, việc kiểm tra, phát hiện kịp thời các tác nhân gây bệnh để đề ra biện pháp phòng chống, giảm thiểu thiệt hại tới mức thấp nhất cho ngành nuôi tôm là vấn đề đƣợc nhiều cơ sở nghiên cứu quan tâm. Cho đến nay, những hiểu biết cơ bản về sự sinh sản, hệ miễn dịch và đặc biệt là sự điều khiển sinh trƣởng của tôm sú còn rất hạn chế do những thiếu sót thông tin về genome và sự biểu hiện gen của chúng. Kích thƣớc genome của tôm sú cũng rất lớn (khoảng trên 2 tỉ cặp base = 2/3 bộ gen ngƣời), nên việc giải mã toàn bộ genome tôm sú đòi hỏi nhiều thời gian và chi phí rất lớn, ƣớc tính hàng chục triệu đô la. Vì vậy một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc lựa chọn là lập bản đồ di truyền liên kết genome tôm sú, lập bản đồ di truyền từ DNA vi vệ tinh hay lập bản đồ gen tôm sú từ giải mã EST/cDNA, bằng việc lựa chọn những gen ứng viên dự báo phù hợp với mục đích nghiên cứu, ta có thể xây dựng đƣợc các chỉ thị phân tử phục vụ cho công tác chọn giống, nghiên cứu cấu trúc và chức năng của các gen liên quan. Việc nghiên cứu giải mã và lập bản đồ bộ gen thƣờng tập trung vào các đối tƣợng có giá trị kinh tế cao. Nhƣ đã trình bày ở trên, tôm sú là đối tƣợng nuôi trồng có giá trị kinh tế mang tính chiến lƣợc. Chính vì vậy việc phối hợp giữa các quốc gia nhằm giải mã và lập bản đồ gen tôm sú sẽ mang lại lợi ích chung cho cộng đồng và cũng là cho mỗi quốc gia. Nghiên cứu hệ gen phiên mã (transcriptome) là một hƣớng nghiên cứu quan trọng, tập chung nghiên cứu gen mã hóa protein và mức độ biểu hiện của chúng trong từng loại mô cơ quan, từng giai đoạn của quá trình phát triển hay trong các điều kiện môi trƣờng khác nhau. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 2ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Trong khuôn khổ của đề tài chúng tôi tiến hành nghiên cứu mô Cơ của Tôm Sú. Hiện nay, kết quả nghiên cứu từ mô Cơ của Tôm Sú là những dữ liệu quan trọng phục vụ cho việc giải trình tự hệ phiên mã. Chính vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hệ phiên mã từ mô Cơ của Tôm Sú (penaues monodon) tại Việt Nam” 1.2. Mục tiêu đề tài - Tách chiết và tinh sạch đƣợc ARN thông tin (mRNA) từ mô cơ của Tôm Sú. - Đánh giá đƣợc chất lƣợng mRNA đủ tiêu chuẩn cho việc giải trình tự hệ phiên mã của Tôm Sú bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Chuẩn bị đƣợc mẫu, cho đi giải trình tự gen bằng máy xác định trình tự gen thế hệ mới - Phân tích hệ phiên mã mô cơ của Tôm Sú Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 3ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đại cƣơng về Tôm Sú 2.1.1. Đặc điểm sinh học của Tôm Sú Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ. Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thƣớc lớn (có thể lên đến 330 mm hoặc lớn hơn về chiều dài cơ thể) và là loài tôm thƣơng mại quan trọng. Hình 1 Hình ảnh tôm sú 2.1.1.1. Phân loại Tôm sú có tên tiếng Anh là Black tiger shrimp. Chúng thuộc ngành Arthropoda; phân ngành Crustacea; lớp Malacostraca; bộ Decapoda; phân bộ Dendrobranchiata; họ Penaeidea; giống Penaeus; loài Penaeus Monodon. 2.1.1.2. Cấu tạo Phần đầu trên của tôm sú Penaeus Monodon có chủy cứng với các răng cƣa. Phía trên của chủy có từ 7 đến 8 răng và phía dƣới chủy có 3 răng. Ở tôm sú, mũi khứu giác và râu là cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng cho tôm. Trong khi đó 3 cặp chân hàm của tôm có tác dụng lấy thức ăn và và giúp cho việc bơi lội thì 5 cặp chân ngực ngoài tác dụng để lấy thức ăn chúng còn đƣợc tôm sử dụng Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 4ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn khi chúng bò. Ngoài ra một cặp chân bụng khác cũng đƣợc dùng để bơi. Phần đuôi của tôm sú có 1 cặp chân đuôi để tôm có thể nhảy xa và điều chỉnh lên cao hay xuống thấp khi bơi. Bộ phận sinh dục của tôm sú thì nằm ở dƣới bụng. Tôm sú thuộc loại dị hình. Tôm cái có kích thƣớc to hơn tôm đực. Khi tôm trƣởng thành, sự khác biệt giữa tôm đực và tôm cái rất rõ rang thông qua sự khác biệt của cơ quan sinh dục bên ngoài.Ở con đực, cơ quan sinh dục chính nẳm ở phía trong phần đầu ngực. Bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2. Lỗ sinh dục đực mở ra hốc hang đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng của loài này thƣợng đƣợc chứa trong túi. Ở tôm cái, buồng trứng nằm dọc theo mặt lƣng phía trên với hai ống dẫn trứng mở ra ở khớp hang đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dƣới bụng tôm. 2.1.1.3. Phân bố Tôm sú có phạm vi phân bố rộng, từ ấn Độ Dƣơng qua hƣớng Nhật Bản, Đài Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955, Holthuis và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985) Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30E đến 155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nƣớc vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia, Malaixia, Philippines và Việt Nam. Riêng ở Việt Nam Tôm Sú phân bố rộng từ Bắc tới Nam, từ ven bờ đến vùng có độ sâu 40m. Tròn đó vùng phân bố chính là vùng biển miền Trung. Tôm bột , tôm giống (Juvenile) và tôm gần trƣởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Tuy nhiên, khi tôm trƣởng thành di chuyển xa bờ vì những vùng nƣớc sâu là nơi sống ƣa thích của chúng. Sự phân bố của Tôm Sú phụ thuộc vào giai đoạn phát triển 2.1.1.4. Chu kỳ sống của Tôm Sú Ấu trùng tôm sú (Nauplli) đƣợc biến đổi theo 5 giai đoạn trong vòng từ 36 đến 51 giờ. Các ấu trùng tôm này thƣờng bơi từng đoạn ngắn rồi nghỉ. Đối với giai đoạn này, ngƣời ta không cần cung cấp thức ăn vì chúng tự sống bằng noãn hoàng. Chúng lột vỏ 4 lần, mỗi lần khoảng 7 giờ. Về kích thƣớc, nauplli 1 dài Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 5ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn khoảng 0.40mm, dày 0.20mm; nauplli 2 dài khoảng 0.45mm, dày 0.20mm; nauplli 3 dài khoảng 0.49mm, dày 0.20mm; nauplli 4 dài khoảng 0.55mm, dày 0.20mm; nauplli 5 dài khoảng 0.61mm, dày 0.20mm; Zoea đƣợc chia thành 3 giai đoạn diễn ra trong vòng từ 105 đến 120 giờ. Ở gian đoạn này, các Zoea bơi liên tục gần mặt nƣớc và lột vỏ 2 lần, mỗi lần khoảng 36 giờ, ăn thực vật phù du. Về kích thƣớc, zoea 1dài khoảng 1mm, dày 0.45mm. Vào thời điểm này zoea xuất hiện hai phần dầu và bụng rõ rệt. Zoea 2 dài khoảng 1.9mm với sự xuất hiện mặt và chủy trong khi đó zoea 3 dài khoảng 2.7mm với gai trên bụng. Mysis cũng đƣợc chia ra làm 3 giai đoạn, diễn ra trong vòng 72 giờ. Các mysis bơi hƣớng xuống sâu và đuôi đi trƣớc, đầu đi sau. Về kích thƣớc, mysis 1 dài khoảng 3.4mm, có hình dạng của tôm trƣởng thành. Ở giai đoạn này, tôm xuất hiện các cặp chân bụng, đuôi và quạt đuôi. Các gai bụng đƣợc thu nhỏ lại. Mysis 2: dài khoảng 4.0mm và mysis 3 dài khoảng 4.4mm, chân bụng dài hơn, phân thành đốt nhỏ, xuất hiện răng trên chủy. Tôm phải trải qua giai đoạn postlarvae là giai đoạn gần trƣởng thành, trƣớc khi phát triển thành tôm trƣởng thành. Tuổi thành thục của tôm đực và tôm cái từ tháng thứ 8 trở đi. Xác định sự thành thục của tôm cái dễ hơn vì ngƣời ta chỉ cần quan sát xem có túi tinh ở cơ quan sinh dục phụ hay không. Phƣơng pháp xác định thành thục ở con đực khó hơn do phải vác định sự có mặt của tinh trùng ở cuối ống dẫn tinh. Thông thƣờng ngƣời ta thƣờng dựa vào trọng lƣợng để xác định giới tính khi con đực nặng từ 50g trở lên. Hormone điều khiển sự thành thục sinh dục (gonal inhibiting hormone- GIH) đƣợc sản xuất bởi tế bào thần kinh trong cơ quan X của cuống mắt. Sau khi đƣợc tổng hợp, hormone này đƣợc vận chuyển tới tuyến giáp sinap, rồi chúng đƣợc đƣa vào kho dự trữ và chỉ đƣợc tiết ra khi cần thiết. Sự thành thục sinh dục của tôm sú thông qua tác động của tuyến nội tiết. Cắt mắt tôm sẽ có tác dụng thúc đẩy chu kỳ lộ xác, dẫn đến sự thành thục nhanh hơn. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 6ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Số lƣợng trứng đẻ của tôm cái phụ thuộc vào chất lƣợng buồng trứng và trọng lƣợng cá thể mẹ, trọng lƣợng càng lớn thì cho càng nhiều trứng. Con cái thành thục ngoài tự nhiên thƣờng có trọng lƣợng từ 100 đến 300g và đẻ từ 300000 đến 1200000 trứng. Nếu cắt mắt và nuôi vỗ con cái trong bể xi măng, chúng sẽ thành thục và đẻ với số lƣợng trứng dao động từ khoảng 200000 đến 600000 trứng. Tôm sú cái thƣờng đẻ trứng vào ban đêm, khoảng 22 giờ đến 2 giờ sáng. Từ 14 đến 15 giờ sau khi đẻ đƣợc, ở nhiệt độ 27-28C trứng sẽ nở thành ấu trùng gọi là Nauplii. Tôm sú đẻ quanh năm, nhƣng tập trung vào hai thời kỳ chính là tháng 3-4 và tháng 7-10. Tôm sú đực có tuổi thọ là khoảng 18 tháng trong khi đó tuổi thọ của tôm sú cái là khoảng 24 tháng. Vòng đời của tôm sú có hai đặc điểm quan trọng cần chú ý. Sự tăng trƣởng của tôm sú từ hậu ấu trùng cho đến lúc trƣởng thành đƣợc phát triển ở các vùng ven bờ hay vùng cửa song đƣợc đặc trƣng bởi vùng nƣớc lợ. Khi tôm sú đã trƣởng thành thì mọi hoạt động đều sảy ra ở ngoài khơi nơi có nồng độ muối giao động trừ 28‰ đến 32‰ và ổn định. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 7ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 2: Vòng đời của Tôm sú 2.1.2. Khả năng thích ứng với điều kiện môi trƣờng 2.1.2.1. Khả năng thích ứng với nhiệt độ Tôm sú có biên độ giao động nhiệt cao từ 14oC đến 35oC và nhiệt độ thích hợp là từ 28oC đến 30oC. 2.1.2.2. Độ muối Tôm sú thích ứng rộng với độ muối từ 0,2‰ đến 40‰ và tôm sú thích hợp nhất là nồng đồ muối từ 15‰ đến 32 ‰. Nồng độ muối thích ứng nhất cho các mô hình nuôi bán thâm canh và thâm canh là ở 10‰ đến 18‰. Đối với ấ u trùng ƣơng nuôi trong bể thì nồng độ muối thích hợp nhất là tƣ̀ 28‰ đến 30‰. 2.1.2.3. Độ pH Đối với tôm sú thì phạm vi pH thích ứng là 7,5 – 9. Khi môi trƣờng sống của tôm sú có pH= 5 thì tôm sú sẽ chết sau 45 giờ và khi môi trƣờng sống có pH = 5,5 thì tôm sú sẽ chết sau 24 giờ. Và nếu môi trƣờng sống của tôm sú có pH xuống thấ p thì tôm sú sẽ đi mất khả năng vùi mình xuống bùn tôm sú sẽ yếu ớt, Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 8ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn màu sắc thay đổi đột ngột (tôm nhợt nhạt) và đôi khi tôm nhảy cả lên bờ. Trong bể ƣơng ấ u trùng thì pH luôn dao động trong khoảng tƣ̀ 7,5 đến 8,5. 2.1.2.4. Các chất khí hòa tan Đối với hàm lƣợng oxythì tôm sú rất nhạy cảm với hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc và phạm vi giới hạn của hàm lƣợng là từ 3mg/lít đến 11mg/lít. Đối với hàm lƣợng CO2 thì tôm sú thích hợp nhất là 10mg/lít. Hàm lƣợng H2S trong các ao nuôi thâm canh và bán thâm canh thì lƣợng H2S cho phép là 0,03mg/lít và tối ƣu là bằng 0. Còn trong bể ƣơng ấ u trùng thì hàm lƣơ ̣ng H2S luôn bằ ng 0. 2.1.2.5. Tính thích ánh sáng và hướng quang của tôm Đặc tính của tôm sú là thích ánh sang yếu. Mọi hoạt động của tôm sú nhƣ: Giao vĩ, sinh sản, bắt mồi… đều diễn ra vào ban đêm nhất là lúc chập choạng tối và gần sáng. Tôm trƣởng thành có thể nhận biết đƣợc tầng ánh sáng 1 lux cách xa từ 20-30m. Nhƣng nếu nguồn sáng không ổn định tôm sú có thể bỏ ăn. Đối với ánh sáng tự nhiên trong bể ƣơng ấu trùng là không cầ n thiế t mà chủ yếu là ánh sáng nhân tạo. 2.1.2.6. Cơ chế lột xác của tôm Mỗi lần tôm sú lột xác là một lần tôm sus tăng trƣởng về chiều dài và trọng lƣợng trung bình từ 10-15% so với trƣớc khi lột xác. Sự lột xác của tôm sú là do một loại hoocmôn ở cuống mắt quy định. Cuống mắt của tôm sú còn lại chứa các tế bào kết tủa ion Canxi và ion Photpho làm cho vỏ tôm cứng lại sau khi lột xác đƣợc 0,5 đến 1 giờ. Các tế bào này hoạt động đƣợc dƣới tác dụng của ánh sáng mặt trời. 2.1.3. Đặc điểm sinh trƣởng của Tôm Sú Giai đoạn ấu trùng tôm sú (nauplius) đƣợc trải qua 6 lần lột xác và sau 30 đến 35 giờ thì chuyển thành Zoea với kích thƣớc cơ thể tôm sú đạt khoảng 0,34mm. Giai đoại Zoea trải qua 3 lần lột và xác thời kì lột xác từ giai đoạn zoea lần thứ1 đến giai đoạn zoea lần thứ 3 mất khoảng 4 ngày và kích thƣớc cơ thể tôm sú đạt khoảng 2,5mm. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu – 9ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Giai đoạn mysis cũng phải trải qua 3 lần lột xác. Thời gian lột xác từ giai đoạn mysis lấn thứ 1 đến giai đoạn mysis lần thứ 3 mất khoảng 3 ngày. Đầu giai đoạn này kích thƣớc cơ thể trung bình đạt 2,83mm đến cuối giai đoạn kích thƣớc cơ thể đạt 3,79mm. Đầu giai đoạn postlarvae cứ một ngày lột xác một lần, từ postlarvae 5 trở đi thì sau 1 đến 2 ngày tôm lột xác một lần (sự lột xác của tôm sú phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ muối). Ở giai đoạn này cơ thể gần giống tôm trƣởng thành, kích thƣớc cơ thể đầu giai đoạn postlarvae đạt khoảng từ 4,9 đến 5mm. Đến cuối giai đoạn kích thƣớc cơ thể đạt khoảng từ 2 đến 3cm. Thời kì tôm con, tôm sú lớn lên phải trải qua các quá trình lột xác, mỗi lần lột xác tôm tăng trƣởng về trọng lƣợng từ 10% đến 15% so với lúc ban đầu. Ở thời kì tôm con cứ sau 2 đến 3 ngày tôm lột xác một lần. Thời kì tôm trƣởng thành, tôm trƣởng thành lột xác ít hơn, thời gian giữa hai lần lột xác phụ thuộc rất lớn vào nồng độ muối. Nồng độ muối thích hợp cho tôm sú là 15‰ đến 20‰. Ở Đài loan trong các bể nuôi tôm sú thì nồng độ muối dao động từ 10‰ đến 15‰. Trên thực tế cho thấy nếu nồng độ muối lớn hơn 25‰ thì tốc độ lột xác của tôm chậm và dẫn tới việc tôm chậm phát triển. 2.2. Tầm quan trọng của việc lập bản đồ và giải mã hệ gen của Tôm Sú Việc nghiên cứu cấu trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen (genome) Tôm Sú là một vấn đề khoa học cơ bản có định hƣớng ứng dụng hết sức quan trọng. Những nghiên cứu chi tiết về hệ gen (genome), (transcriptome) hệ phiên mã, hệ protein (proteome) và bản đồ gen Tôm Sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học giúp cho việc xác định các gen liên quan đến tính trạng cần thiết nhƣ tính kháng bệnh, tính chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trƣờng, tính trạng quyết định năng suất, chất lƣợng cũng nhƣ khả năng sinh sản của tôm. Các chỉ thị phân tử cũng nhƣ các thông tin quan trọng khác có đƣợc từ nghiên cứu hệ gen và lập bản đồ gen Tôm Sú sẽ đóng góp một cách hết sức có ý nghĩa và mang tính quyết định cho công tác chọn giống và nuôi trồng tôm. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –10 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Chính vì vậy, ngay từ đầu thế kỷ này một dự án giải mã genome Tôm Sú đã đƣợc đề xuất và vào ngày 2-3 tháng 10 năm 2004, hội nghị bàn về hợp tác giải mã genome tôm sú đã đƣợc chính thức tổ chức tại Bangkok, Thái Lan. Hội nghị với sự tham dự của 12 nƣớc (Úc, Canada, Trung quốc, Hồng Kông, Ấn Độ, Nhật Bản, Malaysia, Singapore, Đài Loan, Thái Lan, Hoa Kỳ và Việt Nam) đã đề xuất Ban chỉ đạo và chƣơng trình hành động để giải quyết từng khâu và tiến tới giải mã toàn bộ hệ gen cũng nhƣ xây dựng bản đồ gen Tôm Sú. Các khâu cần phải giải quyết để có thể tiến tới giải mã toàn bộ hệ gen cũng nhƣ xây dựng bản đồ gen Tôm Sú bao gồm: 1. Giải trình tự EST, thiết lập Ngân hàng trình tự EST (khoảng 300.000 ngàn trình tự EST). 2. Microarrays để đánh giá biểu hiện của các gen có chức năng khác nhau ở các mô khác nhau. 3. Thiết lập thƣ viện nhiễm sắc thể vi khuẩn nhân tạo (BAC), xác định trình tự đầu tận cùng (end sequencing) phục vụ việc lập bản đồ (physical map). 4. Lập bản đồ gen Tôm Sú. EST là một phần nhỏ của trình tự DNA (thƣờng dài từ 200 – 500 nucleotid) đƣợc tạo ra từ một hoặc hai đầu của gen biểu hiện (từ đầu 5’ hay đầu 3’ của cDNA). Gồm có 5’ EST và 3’ EST 5’ EST đƣợc tạo ra từ một phần đầu 5’ của cDNA có khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loại và không thay đổi nhiều trong một họ gen 3’ EST đƣợc tạo ra từ một đầu 3’ của cDNA dạng này có thể sẽ rơi vào vùng không mã hóa (non – coding) hay vùng không dịch mã. Do đó khuynh hƣớng bảo tồn giữa các loại thấp hơn những trình tự mã hóa. Một EST có thể sử dụng giúp cho việc xác định nhiều gen chƣa biết và lập bản đồ của chúng trong một bộ gen. Tạo thƣ viện và giải mã các đoạn trình tự gene biểu hiện (Expressed Sequence Tag, EST) là một phƣơng pháp hữu hiệu để nghiên cứu hệ phiên mã. Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –11 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3. Các công trình nghiên cứu về Tôm Sú. Công trình đầu tiên nghiên cứu về EST Tôm Sú đã đƣợc Lehnert SA và cs công bố vào năm 1999. Trong công trình nghiên cứu này, 3 thƣ viện cDNA đã đƣợc thiết lập từ 3 mô khác nhau của Tôm Sú, bao gồm chân bơi, gốc mắt và hạch ngực. Các tác giả đã giải mã đƣợc 172 trình tự EST, trong đó có 88 trình tự từ hạch ngực, 56 trình tự từ gốc mắt và 32 trình tự từ chân bơi (Lehnert SA và cs, 1999). Ngân hàng dữ liệu EST thu đƣợc từ các mô khác nhau của Tôm Sú (P. monodon) và tôm thẻ chân trắng (L. vannamei): Tham vọng lớn nhất của dự án giải mã EST tôm là xác định đƣợc toàn bộ hệ phiên mã (hệ phiên mã) của tôm. Dự án này đƣợc tiến hành với sự chỉ đạo của GS. P.S. Gross thuộc Trung tâm khoa học Môi trƣờng và Sinh-Y biển, Trƣờng Đại học Y khoa, South Carolina, Hoa Kỳ, với mục tiêu giải mã 100.000 EST ở cả hai đầu 5’ và 3’ của tôm thẻ chân trắng (L. vannamei). Nhƣ vậy, tổng số trình tự cần giải mã là 200.000. Nhóm nghiên cứu này đã công bố 13.656 trình tự EST (O’Leary et al. 2006). Để có thể phát hiện đƣợc nhiều gen chức năng trong các trình tự EST đã giải mã, nhóm tác giả này đã thiết lập các cDNA từ 6 mô khác nhau (hemocyte, gan-thận, mang, tổ chức lymphô, gốc mắt, và huyệt thần ki.nh) và giải mã đƣợc 7.896 EST từ ngân hàng cDNA của các mô này (Robalino et al. 2007). Bởi vì nhóm này chủ yếu tập trung nghiên cứu các thành phần tham gia vào hệ thống phòng vệ của tôm nên hầu hết các EST thu nhận đều xuất phát từ các mô miễn dịch, bao gồm hemocyte, gan-thận, mang và tổ chức lymphô. Hemocyte là các tế bào phòng vệ đầu tiên chống lại sự xâm nhập của tác nhân gây bệnh ở tôm nên phần lớn các EST (gần 40%) đi ra từ nguồn này. Ở các EST có nguồn gốc từ hemocyte, các gen liên quan tới các peptide kháng khuẩn chiếm đa số. Ngoài ra, các gen mã hóa cho các chất ức chế protease, các yếu tố làm đông kết, lysozyme và các proteins sốc nhiệt cũng đƣợc xác định. Hai gen mã hóa cho các phân tử tạo tín hiệu miễn dịch là STAT và I-kappa-B Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –12 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn kinase cũng đƣợc tìm thấy trong EST từ hemocyte. Đây cũng là hai gen đầu tiên đƣợc tìm thấy ở tôm. Một gen quan trọng nữa là gen điều khiển miễn dịch imd (immune deficiency) cũng lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở tôm. Cho đến năm 2010, số EST của L. vannamei đã đƣợc công bố là 176.198, trong số đó đã tìm thấy 14.548 vùng nằm kề (contigs). Các trình tự này đã có trong Ngân hàng trình tự EST của NCBI. 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên Thế giới 2.3.1.1. Nghiên cứu giải mã và lập bản đồ gen ở Thái Lan Thái Lan là nƣớc đứng đầu thế giới về xuất khẩu tôm với thu nhập khoảng 2 tỷ USD/năm. Chính vì vậy, ngay sau hội nghị quốc tế Bangkok 2004, Thái Lan đã đầu tƣ khoảng 1,5 triệu USD cho giải mã EST và xây dựng bản đồ gen tôm sú. Các nghiên cứu xây dựng Ngân Hàng EST và các EST liên quan tới nhiều tính trạng quan trọng nhƣ giới tính của tôm, khả năng phòng vệ của tôm, tìm ra các microsatellite phục vụ xây dựng bản đồ liên kết di truyền... đã đƣợc Trung Tâm SHPT và Genomics của GS Tassanakajon tiến hành thành công và công bố kết quảtrên các tạp chí khác nhau. Phân tích hơn 10 ngàn EST, Maneeruttanarungroj và cs đã tìm ra đƣợc 997 EST có duy nhất 1 microsatellite marker. Sử dụng các marker microsatellite kết hợp với các marker khác nhƣ AFLP, SNP, các nhà khoa học Thái Lan đã phân ra đƣợc các nhóm liên kết gồm 47 nhóm liên kết trên tôm đực và 36 nhóm liên kết trên tôm cái, chiếm tới 1/2 hệ gen tôm sú và xây dựng thành công bản đồ liên kết di truyền(Maneeruttanarungroj và cs, 2006). Từ năm 2006 Tassanakajon và cs tại trƣờng Đại học tổng hợp Chulalongkorn, Bangkok đã thực hiện một dự án lớn giải mã EST và thiết lập Ngân hàng dữ liệu EST Tôm Sú. Khởi đầu bằng 15 thƣ viện cDNA từ các mô khác khau trong điều kiện bình thƣờng hoặc stress nhằm tìm ra các gen đặc hiệu kháng bệnh và thích ứng với stress. Trong công trình công bố vào năm 2006, 10.100 clone đã đƣợc giải trình tự, trong đó tìm đƣợc 4845 trình tự không trùng lặp và một nửa trong số đó có độ tƣơng đồng cao với các gen đã biết Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –13 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3.1.2. Nghiên cứu giải mã và lập bản đồ gen ở Đài Loan Các công trình nghiên cứu về EST và các gen quan trọng mã hóa cho các tính trạng liên quan tới biến đổi môi trƣờng và kháng bệnh cũng nhƣ xây dựng bản đồ gen Tôm Sú đã đƣợc nhóm của Lo CF, Đài Loan công bố trong các tạp chí khác nhau. Gần đây nhất, vào năm 2010, You EM và cs thuộc Viện Động vật học, Trƣờng Đại học tổng hợp Quốc gia Đài Bắc đã xây dựng đƣợc bản đồ liên kết di truyền tôm sú dựa trên các marker microsatellite và AFLP. Dựa trên 256 marker microsatellite và 85 marker AFLP, các nhà khoa học đã phân tích chỉ số LOD score và tìm ra đƣợc 43 nhóm liên kết trong bản đồ gen tôm đực và 46 nhóm liên kết trong bản đồ gen tôm cái. Bản đồ liên kết di truyền tôm đực chứa 176 microsatellite và 49 AFLP marker với khoảng cách giữa các marker là 11.2 cM, Trong khi đó bản đồ gen tôm cái chứa 171 microsatellite và 36 AFLP marker với khoảng cách giữa các marker là 13.8 cM. Xác định đƣợc 40 trong số 44 nhiễm sắc thể thuộc dạng metacentric, một thuộc dạng submetacentric và 3 thuộc dạng acrocentric 2.3.2. Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam Để đáp ứng nhu cầu nuôi tôm, việc nghiên cứu sinh sản nhân tạo tôm sú đƣợc đặt ra nhƣ một nhiệm vụ hết sức quan trọng từ lâu. Trong giai đoạn 1987-1998, Trung tâm nghiên cứu sản xuất tôm Vũng Tàu – Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 đã nghiên cứu thành công việc nuôi trong bể xi măng Tôm Sú bố mẹ từ nhiều ngồn khác nhau nhƣ biển, đầm nuôi quảng canh. Kết quả sau 21-45 ngày nuôi tỷ lệ thành thục lớn hơn 30%, thu đƣợc ấu trùng từ 200.000300.000/cá thể, đồng thời xây dựng đƣợc qui trình sản xuất giống tôm sú chất lƣợng cao (Phạm Văn Tình, 2000). Giai đoạn 1988-1996, Trại thực nghiệm nuôi trồng Hải sản – Trƣờng Đại học thủy sản Nha Trang đã thử nghiệm sản xuất giống Tôm Sú từ nguồn tôm bố mẹ giao phối và cấy nghép tinh nhân tạo bằng phƣơng pháp cắt mắt trong bể xi măng. Kết quả của tôm giao vỹ với tỷ lệ thành thục 88,8%, sức sinh sản thực tế Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –14 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 475.000 ấu trùng/con, tỷ lệ sống chuyển đến giai đoạn Zoael > 80%; đối với tôm ghép tinh nhân tạo, tỷ lệ thành thục 83,3%, sức sinh sản thực tế 465.000 ấu trùng/con, tỷ lệ sống chuyển đến giai đoạn Zoael >75% (Ngô Anh Tuấn, 1995). Giai đoạn 1995-2000, Trung tâm nghiên cứu phát triển giống hải sản miền Bắc (Cát Bà) – Viện Nghiên cứu Hải Sản (Nay thuộc Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1) đã nghiên cứu thử nghiệm nuôi vỗ Tôm Sú bố mẹ tại Vịnh Hạ Long và Cát Bà đồng thời sau đó áp dụng và từng bƣớc hoàn thiện công nghệ nuôi vỗ Tôm Sú bố mẹ. Kết quả đã đạt đƣợc độ thành thục từ 77,7 đến 100%, sức sinh sản thực tế 358.000 ấu trùng/con. Giai đoạn 2000-2001, Trung tâm nghiên cứu sản xuất giống tôm Vũng Tàu (nay là Trung tâm quốc gia giống hải sản Nam Bộ) - Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 2 đang tiến hành đề tài cấp Bộ NN&PTNT về nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh học và kỹ thuật nhằm làm cơ sở khoa học cho chƣơng trình cải thiện chất lƣợng di truyền của Tôm Sú tại Việt Nam. Trong đó, với nội dung xây dựng đàn Tôm Sú bố mẹ nhân tạo làm vật liệu phục vụ nghiên cứu đã bƣớc đầu nuôi vỗ đƣợc đàn Tôm Sú trong điều kiện nhân tạo từ các nguồn gốc khác nhau. Kết quả tỷ lệ thành thục đạt >30%, sức sinh sản thực tế 200.000 ấu trùng/con, (Nguyễn Quốc Hƣng, 2004). Việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen Tôm Sú để phục vụ cho việc nhân giống tôm dựa trên nguồn tôm bản địa đảm bảo cho việc nuôi tôm bền vững vẫn chƣa đƣợc xúc tiến tại Việt Nam. Trong khuôn khổ của một đề tài thuộc Chƣơng trình Công nghệ sinh học thủy sản của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, viện Công nghệ sinh học đã tiến hành nghiên cứu giải trình tự một phần hệ gen phiên mã (cDNA/EST) và xây dựng cơ sở dữ liệu genome Tôm Sú. Đề tài đã bƣớc đầu đạt đƣợc những kết quả nhƣ: thƣ viện cDNA/EST đƣợc thiết lập từ các mô khác nhau của Tôm Sú; giải mã hàng chục trình tự cDNA trong đó có các gen quan trọng liên quan đến sinh trƣởng và miễn dịch; xây dựng cơ sở dữ liệu genome nhằm cung cấp thông tin di truyền hữu ích để xác định các marker phân Số hoá bởi Trung tâm Học liệu –15 ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn