Đăng ký Đăng nhập
Trang chủ Giáo dục - Đào tạo Cao đẳng - Đại học Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh...

Tài liệu Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học của sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha et grushv.) bằng phương pháp nuôi cấy lỏng

.PDF
85
128
89

Mô tả:

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI • HỌC • KHOA HỌC • Tự • NHIÊN ------ ũ ------ BÁO CÁO TỔNG KÉT ĐÈ TÀI TÊN ĐÈ TÀI:“NGHIÊN c ứ u MÔI TRƯỜNG TỐI ư u ĐẺ SẢN XUẤT SINH KHỐI VÀ CÁC CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA SÂM NGỌC LINH (PANAX VIETNAMENSIS HA ET GRUSHV.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỎNG”. ĐÈ TÀI ĐẶC BIỆT CÁP ĐẠI HỌC QƯÓC GIA HÀ NỘI MÃ SỔ: QG.06.14 CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI: TS. Nguyễn Trung Thành CÁC CÁN B ộ THAM GIA: ThS. Nguyễn Kim Thanh CN Nguyễn Anh Đức ThS. Hà Tuấn Anh ThS. Ngô Đức Phương ThS. Lê Thanh Sơn TS. Nguyễn Văn Kết GS.TS. Paek Kee Yoeup TS. Yu Kee Won HÀ NỘI - 6/2008 ĐAI HOC QUỐC GIA HÀ NỘỈ TPUNG TẦM ĩHÓNG TIN THƯ VIỆN O Q C lh ílC M O ị/l MỤC LỤC Trang Danh mục các từ viết tắt III Báo cáo tóm tắt 1 Đặt vấn đề 7 Mục tiêu nghiên cứu 8 Nội dung nghiên cứu 9 Tổng quan tài liệu 10 Nguyên liệu và phương pháp 12 Nguyên liệu nghiên cứu 12 Phương pháp nghiên cứu 12 Kết quả và thảo luận 15 Thu thập mẫu vật nghiên cứu 15 Một số đặc điểm ở khu vực thu mẫu 15 Mô tả tóm tắt về hình thái của Sâm Ngọc Linh 15 Các thành phần hoạt chất chính có mặt trong rễ sâm Ngọc Linh 16 Tạo mô sẹo trên môi trường ran 19 Anh của nồng độ 2,4D đến sự hình thành mô sẹo 19 Ảnh hưởng của auxin đến sự hình thành rễ bất định 20 Nuôi cấy tế bào trên môi trường lỏng 23 Ảnh hưởng của nồng môi trường lên sự sinhtrưởng của tế bào và sự tích lũy hàm lượng ginsenoside 23 Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sựtăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides 24 Ảnh hưởng của nồng độ BA và kinetinkết hợp với IBA lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides 26 I Ảnh hường của nồng độ đường lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides 28 Ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides 30 Kết luận và kiến nghị 32 Tài liệu tham khảo 34 Phụ lục 39 Tóm tắt các công trình nghiên cứu khoa học của cá nhân 40 Phiếu đăng ký kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ 43 II DANH MỤC CÁC TỪ VIÉT TẮT Ký hiệu viết tắt Tên viết đầy đủ 1. 2,4D 2,4 dichlorophenoxy acetic axit 2. BA Benzyladenine 3. IBA Indole 3 butyric axit 4. NAA Naphthalene acetic axit 5. MS Murashige & Skoog 6. TL tươi Trọng lượng tươi 7. TL khô Trọng lượng khô TT III BÁO CÁO TÓM TẮT 1. TÊN ĐÈ TÀI “Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học của Sâm Ngọc Linh {Panax vietnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp nuôi cấy lỏng”. 2. MÃ SỐ: QG.06.14 3. CHỦ TRỈ ĐÈ TÀI: TS. Nguyễn Trung Thành 4. CÁC CÁN B ộ THAM GIA ThS. Nguyễn Kim Thanh CN. Nguyễn Anh Đức ThS. Hà Tuấn Anh ThS. Ngô Đức Phương ThS. Lê Thanh Sơn TS. Nguyễn Văn Kết GS.TS. Paek Kee Yoeup TS. Yu Kee Won 5. MỤC TIỂU NGHIÊN c ứ u - Áp dụng một phương pháp tạo sinh khối một loài cây thuốc quý ngay trong phòng thí nghiệm mà hiện nay chưa được áp dụng ở Việt Nam. - Xây dựng một hướng nghiên cứu mới để tạo ra sản phẩm hừu ích nhằm ứng dụng rộng rãi phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng, đồng thời để sử dụng bền vững nguồn gen quý của nước ta. - Đe tài tập hợp các chuyên ngành khác nhau cùng tham gia nghiên cứu, bao gồm (chuyên ngành thực vật học, sinh lý thực vật, hóa sinh, Dược liệu). 6. NỘI DUNG NGHIÊN c ứ u - Thu thập mẫu vật, phân lập, tuyển chọn một số chủng có hoạt tính sinh học cao ở Việt Nam. - Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học. - Bước đầu phân tích và đánh giá thành phần, định lượng nhóm các chât có hoat tính sinh hoc. 7. CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC Kết quả khoa học đã đạt được 1. Chất điều hòa sinh trường thực vật là nhân tố quan trọng trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật, ở đây auxin 2,4-D đã được sử dụng trong nghiên cứu để tạo mô sẹo của Sâm Ngọc Linh (P. vietnamensis Ha Et Grush). Kêt quả thu được khi bổ sung 2,4-D vào môi trường răn MS ở nông độ 1 mg/L, mô sẹo của Sâm Ngọc Linh được hình thành và phát triên tôt sau 28 ngày nuôi cấy. 2. Trong nuôi cấy lỏng trên môi trường cơ bản MS thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triên của tê bào cũng như sự tông hợp sản phâm thứ câp ginsenoside ở nồng độ thấp 0,5 - 1. 3. Trong môi trường MS có bổ sung các loại auxin (IBA và NAA) kết quả sau 4 tuần nuôi cấy cho thấy IBA là tối ưu cho sự sinh truởng và phát triển của tế bào ở nồng độ 3 mg/L, sinh khối khô thu được 10.7 g/L và sản phẩm ginsenosiđe (5.45 mg/g TL khô). 4. Cytokinin (BA và kinetin) đã được bổ sung khi kết hợp với 3 mg/L IBA, kết quả cho thấy cytokinin đã ảnh hưởng không có nghĩa đến sự tăng trưởng sinh khối khi tăng nồng độ từ 0,1 đến 1 mg/L, nhưng lại ảnh hưởng đến sự tích lũy hàm lượng ginsenoside, hàm lượng ginsenside thu được ở nồng độ 0,5 mg/L BA là 5.95 mg/g TL khô và ở nồng độ 0,5 mg/L kinetin là 5.87 mg/g TL khô. 5. Nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy tế bào cũng được thay đổi, kết quả cho thấy 50 g/L là thích hợp cho sự tích luỹ sinh khối tế bào và sự tổng hợp sản phẩm ginsenoside. Sinh khối khô tăng từ 5.4 đến 10.3 g/L khi tăng nồng độ đường từ 0 đến 50 g/L. Tiếp tục tăng nồng độ đường sẽ kìm hãm sự sinh trưởng tế bào cũng như sự tổng hợp ginsenoside. 6. Tương tự, ở nồng độ 30 mM nitrogen là tối ưu cho sự sinh trưởng tế bào và sự tích lũy sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ginsenoside. Sổ bài báo khoa học đã và sắp được công Đã công bổ 03 bài báo khoa học trên các tạp chí chuyên ngành 1. Nguyen Trung Thanh, Le Thanh Son and Paek Kee Yoeup. 2007. Induction and proliferation of callus of Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv): Effects of plant growth regulators. J. Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23 (IS): pp. 167 - 173. 2. Nguyen Trung Thanh, Le Van Can and Paek Kee Yoeup. 2007. The adventitious root cultures o f Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis 2 Ha et Grushv.). Preceding o f National Conference on Life Sciences 2007, Science and Technical Publication House, Vietnam, pp. 828 - 831. 3. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup. 2007. Effecting o f medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture o f Panax vietnamensis Ha et Grushv. J. Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23: pp. 269 - 274. 01 bài sắp đăng trên Tạp chí Khoa học, ĐHQGHN 4. Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup. 2008. Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture o f Ngoe Linh ginseng (.Panax vietnamensis Ha et Grushv.). 8. TỈNH HÌNH KINH PHÍ CỦA ĐÈ TÀI - Đề tài đã thực hiện đúng thời hạn đăng ký 24 tháng. - Kinh phí được cấp tổng cộng trong 2 năm là 60.000.000 đồng, đến nay đã nhận và thanh quyết toán đầy đủ với Phòng Ke hoạch - Tài vụ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQHN. KHOA QUẢN LÝ CHỦ TRÌ ĐÈ TÀI PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa TS. Nguyễn Trung Thành TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN • M ổ Mt Ễ u T H Ư Ớ N G 3 SUMMARY REPORT 1. TITLE OF THE RESEARCH PROJECT “Study on the suitable medium to culture the biomass cell and ginsenosides production o f Ngoe Linh Ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) by cell suspension cultures”. 2. CODE OF THE RESEARCH PROJECT QG.06.14 3. PRINCIPAL RESEARCHER Dr. Nguyen Trung Thanh 4. MAIN COLLABORATORS TO RESEARCH PROJECT MSc. Nguyen Kim Thanh BC. Nguyen Anh Due MSc. Ha Tuan Anh MSc. Ngo Due Phuong MSc. Le Thanh Son Dr. Nguyen Van Ket Prof. Dr. Paek Kee Yoeup Dr. Yu Kee Won 5. RESEARCH PROJECT OBJECTIVES - The new method application to produce the biomass and useful metabolite production o f the medicinal plant in laboratory. - Design a reseach way to produce the useful production in order to care community health and the gene resource conservation. - The research way is combinated by other speciality to study (Botany, plant physiology and biochemistry, phamaceutical). 6. SKETCHES OF RESEARCH CONTENT - Collect, isolate and selection sample ginseng with high bioactive compound. - Determination suitable medium to produce the biomass and useful metabolite production in ginseng. - The first analyze on the ginsenoside content of Panax ginseng. 4 7. ACADEMIC RESEARCH OUTCOMES 1. Plant growth regulators in plant cell and tissue cultures are an important factor affecting the plant physiology. In this work, the first callus was induced from root explants o f Panax vietnamensis cultured on MS basal medium supplemented with lmg/L 2,4-D, while no plant growth regulators were needed for callus maturation. 2. We established cell suspension culture on Panax vietnamensis and some attempts have been made to increase ginsenoside yield o f ginseng cell culture through manipulation various culture factors and process variable. Half and full strength MS medium were found to be equally suitable for both biomass as well as ginsenoside production. The biomass production and ginsenoside yield were obtained 9.8 g/L DW and 6.81 mg/g DW, respectively. 3. The maximum biomass yields o f cell culture o f ginseng was obtained in medium containing auxin IBA and NAA. However, ginsenoside production was much higher in IBA or NAA containing medium and 3 mg/L IBA was found to be optimal for callus proliferaton (10.7 g/L DW) and ginsenoside production (5.45 mg/g DW). 4. Addition of cytokinin (BA and kinetin) did not affect cell growth but ginsenoside production was increased when the medium supplemented with 0.5 mg/L BA (5.95 mg/g DW) or 0.5 mg/L kinetin (5.87 mg/g DW), respectively. 5. The effect o f initial sucrose concentrations were also investigated in suspension cultures o f p. vietnamensis for biomass and production of ginseng saponin (secondary metabolite). The final dry cell weight was increased from 5.4 to 10.3 g/L with an increase of initial sucrose concentration from 0 to 50 g/L, but an even higher sucrose concentration of 60 g/L seemed to repress the cell growth, further increase o f sucrose concentration upto 70 g/L led to a decrease in ginsenoside accumulation and biomass production. 6. The maximum growth and ginsenoside production was obtained for nitrogen concentration of 30 mM. The scientific articles and reports published and will being 'JW published + 03 scientific articles were published on specialist journals 1. Nguyen Trung Thanh, Le Thanh Son and Paek Kee Yoeup. 2007 Induction and proliferation of callus of Ngoe Linh ginseng (Panax 5 vietnamensis Ha et Grushv): Effects of plant growth regulators. J. Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23 (IS): pp. 167 - 173. 2. Nguyen Trung Thanh, Le Van Can and Paek Kee Yoeup. 2007. The adventitious root cultures o f Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). Proceeding o f National Conference on Life Sciences 2007, Science and Technical Publication House, Vietnam, pp. 828 - 831. 3. Nguyen Trung Thanh, Nguyen Van Ket, Paek Kee Yoeup. 2007. Effecting o f medium composition on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture o f Panax vieừiamensis Ha et Grushv. J. Science, Natural Sciences and Technology, Vietnam, 23: pp. 269 - 274. 01 scientific report will being published on J. Science, VNU 4. Nguyen Trung Thanh, Ha Tuan Anh, Paek Kee Yoeup. 2008. Effects of macro elements on biomass and ginsenoside production in cell suspension culture o f Ngoe Linh ginseng (Panax vietnamensis Ha et Grushv.). 8. EXPENDITUDE AND SCHEDULE - The project has been implemented on time (24 months). - All budget (60.000.000 VND) have been fully received and completed drawn the balance sheet at the Department o f Account, Hanoi University o f Science, VNƯ. FACULTY OF BIOLOGY PRINCIPAL RESEARCHER Assoc.Prof.Dr. Phan Tuan Nghia Dr. Nguyen Trung Thanh HANOI UNIVERSITY OF SCIENCE 6 ĐẢT VẤN ĐỀ Các loài Sâm thuộc chi Panax: Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax japonicus, Panax quinquefolium, Panax vietnamensis, v.v, từ rất lâu được coi là một trong số những cây thuốc có tác dụng đồng hóa các sản phẩm trong tế bào, kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề kháng cho cơ thể, hệ thần kinh và chống một số bệnh ung thư, v.v. Thành phần chính saponin đã được ghi nhận như là hợp chất có hoạt tính quan trọng nhất trong rễ sâm. Mặt khác chúng còn chứa các thành phần khác nhau như các chất chống ôxy hóa, peptides, polysaccharides, axit béo và vitamin (Lee và Cộng sự, 1995). Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chúng đã tăng nhanh theo thòi gian trên toàn thế giới. Nhưng để thu hoạch được rễ sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thì phải mất từ 4-6 năm và nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lên rất cao (Persons, 1995). Ngoài ra việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng (Yu và Ohh, 1995). Trong những năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành công trong sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các nguyên liệu thô trong dược phẩm, các sắc tố và các hóa chất khác (Choi, 1998 ; Zhong, 1998; Bourgaud, 2001). Sản phẩm ginsenosides cũng đã thu được nhieu kêt quả thật đáng tự hào thông qua nuôi cấy tể bào thực vật (Furuya và Cộng sự, 1983; Liu và Zhong, 1998; Akalezi và Cộng sự, 1999Paek và Cộng sự, 2001; Thành, 2005). Sâm Ngọc Linh, còn gọi là Sâm K5 (Panax vỉetnamensis Ha et Grushv) là loại Sâm đặc hữu ở Việt Nam đã được đoàn điều tra dược liệu Ban Dân y Khu V phát hiện năm 1973 tại vùng núi Ngọc Linh thuộc hai tỉnh Kon Turn và Quảng Nam ở độ cao 1.500 - 2.300m. Do dược tính quý 7 giá của cây Sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ trong những năm gần đây. Trong nhiều năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác cây Sâm Ngọc Linh một cách ồ ạt vô tội vạ, không có kế hoạch bảo vệ, số lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã đến mức báo động. Trước tình hình như vậy, một dự án "Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất giống, kỳ thuật và quy hoạch phát triển cây sâm K5 tại Kon Tum" có sự hỗ trợ của 2 cơ quan: 1. Viện Dược liệu Bộ Y tế; 2. Trung tâm Nghiên cứu Trồng chế biến Cây thuốc Hà Nội đã và đang được thực thi cho đến nay. Ngoài ra, cho đến nay cũng đã có một số kết quả báo cáo về phân tích thành phần saponin của cây Sâm Ngọc Linh (Tanaka 1989; Hường và Cộng sự, 1996; Đức và Cộng sự, 1997; Konoshima và Cộng sự, 1998; Yamasaki, 1999). Như vậy có thể nói rằng, những hiểu biết về cây Sâm Ngọc Linh đến nay là rất khiêm tốn, và đặc biệt là trong vấn đề sản xuất sinh khối ở quy mô lớn là còn đang hạn chế. Do đó cần nhiều những nghiên cứu chi tiết cũng như khả năng ứng dụng của cây dược liệu quý giá này. Chính vì vậy chúng tôi đề xuất hướng nghiên cứu này với đề tài: “Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học của Sâm Ngọc Linh (Panax vỉetnamensis Ha et Grushv.) bằng phương pháp nuôi cấy lỏng”. • MỤC TIÊU NGHIÊN CỬU - Áp dụng một phương pháp tạo sinh khối một loài cây thuốc quý ngay trong phòng thí nghiệm mà hiện nay chưa được áp dụng ở Việt Nam. - Xây dựng một hướng nghiên cứu mới để tạo ra sản phẩm hữu ích nhăm ứng dụng rộng rãi phục vụ cho việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng đông thời đê sử dụng bền vững nguồn gen quý của nước ta. 8 - Đề tài tập hợp các chuyên ngành khác nhau cùng tham gia nghiên cứu, bao gồm (chuyên ngành thực vật học, sinh lý thực vật, hóa sinh). • NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Thu thập mẫu vật, phân lập, tuyển chọn một số chủng có hoạt tính sinh học cao ở Việt Nam. - Nghiên cứu môi trường tối ưu để sản xuất sinh khối và các chất có hoạt tính sinh học. - Bước đầu phân tích và đánh giá thành phần, định lượng nhóm các chất có hoạt tính sinh học. 9 I. TỎNG QUAN TÀI LIỆU Cây sâm Việt Nam (sâm Ngọc Linh, sâm K5, củ ngãi rọm con) thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) đã được sử dụng trong dân gian như một vị thuốc dấu của đồng bảo Xê Đăng. Năm 1973, đoàn điều tra dược liệu Ban dân y khu 5 do dược sĩ Đào Kim Long và Nguyễn Châu Giang hướng dẫn, đã phát hiện một loài Panax mọc hoang thành quần thể ở độ cao 1.800 m tại Kon Tum. Bắt đầu từ năm 1974, loài sâm mới này được gọi với tên sâm K5 để đánh dấu bước phát hiện lịch sử tại vùng liên khu 5, (Đức và Cộng sự, 1996; Dong, 2003). Đi cùng với thời gian cây sâm Ngọc Linh đã được biết về tác dụng phòng chữa bệnh, tăng lực và sinh thích nghi (antistress), phục hồi sự suy giảm chức năng giúp cho tình trạng của cơ thể trở lại bình thường mà khái niệm của y học cổ truyền gọi là "hồi dương". Tác dụng chống lão hóa, kháng các độc tố gây hại tế bào, giúp kéo dài sự sống của tế bào, tái tạo các tế bào mới. Tác dụng kích thích điều hòa cơ chế miễn dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, phòng và chống lại một số bệnh ung thư. Do dược tính quý giá của cây sâm nên giá thành lên tới hàng triệu đồng/củ. Trong nhiều năm qua người dân địa phương đã săn lùng khai thác một cách ồ ạt vô tội vạ, không có ké hoạch bảo vệ, số lượng ngày càng trở nên khan hiếm và đã đến mức báo động. Nhu cầu về sử dụng sâm và chiết xuất các hoạt chất của chúng đã tăng nhanh theo thời gian trên toàn thế giới. Nhưng để thu hoạch được rễ sâm bằng phương pháp trồng trên đồng ruộng thì phải mất từ 4-6 năm và nhân công lao động cũng đã làm cho giá thành tăng lên rất cao (Person 1995). Ngoài ra việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng (Yu and Ohh, 1995). Trong những năm gần đây, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật đã rất thành 10 công trong sản xuất các sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, bao gồm các nguyên liệu thô trong dược phẩm, các sắc tố và các hợp chất khác (Bourgand, 2001). Sản phẩm ginsenosides thu được nhiều kết quả thật đáng tự hào thông qua nuôi cấy tế bào thực vật (Lee và Cộng sự, 1995; Person, 1995; Thanh và Cộng sự, 2005) Chất điều hòa sinh truởng thực vật được coi là một trong những nhân tố quan trọng và quyết định sự thành công trong sự sinh trưởng, biệt hóa và tổng hợp sản phẩm trao đổi thứ cấp của tế bào trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật (Rokem và Goldberg, 1985). Nhiều bài báo nói về sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong nuôi cấy in vitro Panax ginseng, từ nghiên cứu rất sớm (Kita va Sugii, 1969) đã chỉ ra trong nuôi cấy mô Panax ginseng thì hooc môn 2,4D là nhân tố rất quan trọng. Pisetskaya, (1970) đã tìm thấy vai trò của NAA và kinetin trong nuôi cấy mô lá và rễ p. ginseng. Khi nghiên cửu ảnh hưởng của 2,4D và kinetin lên sự tích lũy sản phẩm saponin trong nuôi cấy Panax ginseng (Kim và Cộng sự, 1980) đã tìm thấy sự tổng hợp sản phẩm saponin tăng lên khi có sự kết hợp của 2 chất điều hòa sinh trưởng thực vật (2,4D và kinetin). Aitsu và Cộng sự, (1992) đã chứng minh rằng, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy sẽ kích thích sự tổng hợp saponin. 11 II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Nguyên liệu nghiên cứu Rễ tươi Sâm Ngọc Linh (Panax vieừiamensỉs Ha et Grushv.) từ 4-5 năm tuổi được thu từ núi Ngọc Linh được sử dụng trong các nghiên cứu này (Hình 1). Hình 1. Củ sâm Ngọc Linh 5 năm tuổi (Panax vietnamensis) 2. Phương pháp nghiên cứu 2.1. Phương pháp phân lập và tạo mô sẹo Rễ tươi Sâm Ngọc Linh tươi 4-5 năm tuổi thu tại núi Ngọc Linh, tỉnh Quảng Nam (Hình 1), được rửa sạch bằng nước lã từ 3-5 phút, sau đó khử trùng bằng cồn 70% trong 2 phút, cuối cùng khử trùng trong dung dịch sodium hypochlorite 1 - 5% và sửa lại bàng nước lã vô trùng 3 lần. Mầu được cắt thành từng miếng nhỏ có kích thước từ 0.2 - 0.5 cm và được nuôi cấy trong môi trường MS cơ bản. 12 2.2. Điêu kiện nuoi cay Điều kiện nuôi cấy trong bóng tối ở nhiệt độ 23 ± 2 °c, sau 4 tuân nuôi cấy mô sẹo đã được hình thành trên môi trường rắn MS, bô sung 1 mg/L 2,4D. 2.3. Nuôi cấy tế bào lỏng Mô sẹo đã phát triển ổn định trong thời gian 4 tuần sau đó được chuyển vào môi trường MS lỏng để nuôi cấy. Te bào được duy trì trong môi trường được bổ sung 3% đường sucrose, 1 mg/L 2,4D và 0,1 mg/L kinetin để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm nuôi cấy lỏng được tiến hành trong các bình tam giác có dung tích 300 ml chứa 50 ml môi trường, đặt trên máy lắc với tốc độ 105 vòng/phút. Các thí đều được lặp lại 3 lần. - Ảnh hưởng của nồng môi trường lên sự sinh trưởng của tế bào và sự tích lũy hàm lượng ginsenoside. - Ảnh hưởng của nồng độ NAA và IBA lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides. - Ảnh hưởng của nồng độ BA và kinetin kết hợp với IBA lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides. - Ảnh hưởng của nồng độ đường lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides. - Ảnh hưởng của nồng độ nitơ lên sự tăng trưởng sinh khối và sản phẩm ginsenosides. 2.3. Nuôi cấy rễ bất định Rễ bất định đã hình thành từ mô sẹo sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS bô sung 30 g/L đường sucrose, 10 g/L agar (Công ty sản xuất đồ hộp Quảng Ninh). Hai loại auxin được sử dụng trong thí nghiệm để tạo ra rễ bất định IBA và NAA với nồng độ 0, 1, 2, 4, 6 mg/L. 13 2.4. Chiết xuất và xác định hàm lượng ginsenosides Rễ bất định đã thu hoạch, sửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 60°c trong 7 giờ. Quá trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosides có trong rễ sâm đã tiến hành theo mô tả (Furuya và cộng sự, 1983; Thành và cộng sự 2005). Các bước được thể hiện qua (Hình 2). Material (1-2 g dry wt.) ị extract 2 times with 50 mL of 75% MeOH Ginseng extract ị evaporate the methanol and dissolve in 50 mL water Water so: ution partitioning twice with ethyl ether Ether layer Aqueous layer extract 3 times using spur-buthanol Spur-butanol layer Aqueous layer wash twice with water and evaporate in vacuum at 50"C Crude ginsenoside dissolve in 5 mL of methanol (w/v dry wt.) and filtrate with 0.45 àl PTEF membrane filter V HPLC analysis H'mh 2. Quy trình chiết suất, xác định hàm lượng ginsenosỉdes để phân tích HPLC 14 m. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. THU THẬP MẪU NGHIÊN c ử u 1.1. Môt số đăc điểm ở khu vưc thu mẫu Xã vùng cao Trà Linh ở phía Tây Nam huyện miền núi Trà My, tỉnh Quảng Nam, có núi cao từ 800m trở lên, trong đó có đỉnh Ngọc Linh cao nhất miền Nam Việt Nam (2.598m). Khu vực thu mẫu có độ cao từ 16002300m, địa thế hơi dốc, bề mặt lớp đất vàng đỏ trên đá granitnai dày trơn 50cm, đặc biệt đất ở vùng thấp có độ mùn cao, tơi xốp, rừng nguyên sinh cây lá rộng, rất thích hợp cho sự phát triển của cây sâm Ngọc Linh. Khí hậu thuộc á nhiệt đới núi cao. Nhiệt độ trung năm là 20°c. Mùa nóng từ tháng 5 đến tháng 11, nhiệt độ tối đa 20-25°C, nhiệt độ ban đêm tối thiểu 4-6°C. Mùa lạnh từ tháng 11 đến tháng 4, nhiệt độ tối đa 17-20°c, nhiệt độ tối thiểu l-2°c. Lượng mưa trung bình hàng năm là 3.286 mm, cao nhất là 4.168mm, thấp nhất là 2,049mm, các tháng khô là tháng 3, 4, 5, 6. Độ ẩm trung bình năm là 86-95%, nhiều tháng trong năm có độ ẩm cao 98%. số giờ nắng trung bình trong ngày 4 giờ/ngày. Từ tháng 11 đến tháng 5 thường xuyên có sương mù kéo dài khoảng 15 ngày/tháng. 1.2. Mô tả tóm tắt về hình thái của Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamesis Ha et Grashv.) Cây thảo sống nhiều năm có thể cao 0,6 - lm , có thân rễ phát triển. Thân rễ nạc đường kính 2-3cm (3,5cm), không có rễ phụ dày dữ trữ, đôi khi cuối thân rễ có rễ củ to hình cầu, hình cong đường kính 5cm. Trên thân rễ mang nhiều vết sẹo tròn, dấu vết thân khí sinh của các mùa sinh trưởng để lại. Thân khí sinh nhẵn cao 40-60cm (lm ). Lá kép hình chân vịt mọc vòng, thường có từ 3-4 lá kép (ít khi 5, 6): mồi lá kép thường có 5 lá chét. Lá chét có hình trứng ngược hay hình mũi mác, mép lá có răng cưa, có lông cứng ở cả hai mặt (3mm). Cụm hoa: thường là tán đon dài 15-25cm (dài gấp 1 5-2 15 lần chiều dài cuống lá kép). Tán hoa có đường kính 2,5-4cm có thể mang từ 50-120 hoa. Cuống hoa dài l-l,5cm . Hoa màu lục nhạt, đường kính khi hoa nở 3-4mm, gồm 5 lá đài hợp thành hình chuông trên chia thành 5 răng nhỏ hình tam giác cao l-l,5m m , năm cánh hoa màu lục nhạt; chỉ nhị trắng, mảnh dài l,5-2mm. Bao phấn xoan, dính lưng. Đế hoa hơi lồi. Bầu 1 ô, từ 1-2 vòi. Quả mọng khi chín có màu đỏ tươi, thường có chấm đen không đều ở đỉnh quả, quả có từ 1-2 hạt có hình thận hoặc cầu dẹt. Hạt có màu trắng hay vàng nhạt, bề mặt hạt ráp, có nhiều chỗ lồi lõm. Chu kỳ sinh sản, phụ thuộc vào điều kiện thời tiết và địa hình khác nhau. Nên có thể xác định chu kỳ sinh trưởng hàng năm như sau. - Từ tháng 10 đến thàng 12: thân khí sinh của năm trước bắt đầu tàn lụi, chồi mầm các bộ phận trên mặt đất bắt đầu hình thành. - Từ tháng 1 đến tháng 3: xuất hiện và phát triển thân khí sinh và tán hoa. - Từ tháng 4 đến tháng 6: cây ra hoa và kết quả. - Từ tháng 7 đến tháng 9: thời kỳ quả chín rộ. 1,3. Các thành phần hoạt chất chính có mặt trong rễ sâm Ngọc Linh - Họp chất saponin được xem là thành phần hoạt chất chủ yếu. Đã xác định được cấu trúc protopanaxadiol II. Các saponin dammaran được xem là hoạt chất quyết định như ginsenoside-Rbl, -Rb2, -Rb3, Rd đã được xác định. Trong đó ginsenoside-Rb 1 chiếm tỷ lệ 2%, -Rb2 (0.12%), -Rb3 (0.11%). Các saponin dẫn chất đã xác định được các đại diện ginsenosideRe, -R gl, notoginsenoside-Rl. + Ginsenoside Rgl + Re = 1.35% - Hợp chất gluxit: 16
- Xem thêm -

Tài liệu liên quan