Tài liệu Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể y ở nam giới khám vô sinh tại bệnh viện phụ sản thành phố cần thơ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẠNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI KHÁM VÔ SINH TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH - 9 42 02 01 2018 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CAO THỊ TÀI NGUYÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ DẠNG BẤT THƯỜNG NHIỄM SẮC THỂ Y Ở NAM GIỚI KHÁM VÔ SINH TẠI BỆNH VIỆN PHỤ SẢN THÀNH PHỐ CẦN THƠ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH - 9 42 02 01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN TRUNG KIÊN 2018 LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Thầy PGS.TS. Nguyễn Trung Kiên đã tận tình hướng dẫn, động viên tôi trong những lúc gặp khó khăn và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm, Thầy, Cô và các anh chị trong Bộ môn Sinh học Phân tử - Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học và các Thầy Cô của Trường Đại học Cần Thơ, những người đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đắc Khoa – Phó trưởng Bộ môn Sinh học Phân tử, PGS.TS. Trần Nhân Dũng, PGS.TS. Nguyễn Văn Thành, PGS.TS. Trương Trọng Ngôn, PGS.TS. Nguyễn Minh Chơn, TS. Bùi Thị Minh Diệu, KS. Trần Văn Bé Năm – Viện Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ, PGS.TS. Trần Ngọc Dung – Trường Đại học Y Dược Cần Thơ, TS. Evguenia - Servicio de Huellas Digitales Geneticas, University of Buenos Aires, Argentina và TS. Ray Banks – International Society of Genetic Genealogy (ISOGG) đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ một số nội dung nghiên cứu của luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Khoa Sau đại học – Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Lãnh đạo Bệnh viện Phụ sản Thành phố Cần Thơ và anh chị em đồng nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án này. Xin chân thành cảm ơn các anh, chị, em Khoa Hiếm muộn và Khoa Xét nghiệm Di truyền Y học, bạn bè và các bạn cùng khóa nghiên cứu sinh đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người bạn trong và ngoài nước đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận án. Cuối cùng, xin dâng lên ba, mẹ đã sinh thành nuôi dưỡng con, ba mẹ chồng đã giúp đỡ tạo mọi điều kiện cho con và xin được chia sẻ niềm vui này đến chồng và con thương yêu đã luôn ủng hộ trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cần Thơ, ngày 8 tháng 9 năm 2017 Nghiên cứu sinh Cao Thị Tài Nguyên MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN....................................................................................... LỜI CẢM ƠN............................................................................................ TÓM TẮT.................................................................................................. SUMMARY................................................................................................ DANH SÁCH BẢNG, BIỂU, SƠ ĐỒ....................................................... DANH SÁCH HÌNH.................................................................................. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.................................................................... i ii iii v ix CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU....................................................................... 1.1. Đặt vấn đề........................................................................................... 1.2. Mục tiêu nghiên cứu............................................................................ 1.3. Giới hạn của nghiên cứu..................................................................... 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn................................................ 1.5. Những đóng góp mới của luận án.................................................... 1 1 2 2 2 3 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................... 2.1. Đại cương về vô sinh và quá trình sinh tinh......................................... 2.1.1. Một số khái niệm về vô sinh và vô sinh nam........................... 2.1.2. Đại cương về quá trình sinh tinh………….............................. 2.2. Tinh dịch đồ và một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam................... 2.2.1. Tinh dịch đồ......……………………........................................ 2.2.2. Một số yếu tố liên quan đến vô sinh nam................................. 2.3. Nhiễm sắc thể Y và một số bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới vô sinh.......................................................................................................... 2.3.1. Cấu trúc nhiễm sắc thể Y của người......................................... 2.3.2. Một số chỉ dấu di truyền trên nhiễm sắc thể Y......................... 2.3.3. Bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới vô sinh...................... 2.4. Một số kỹ thuật dùng để phát hiện nguyên nhân di truyền ở nam giới vô sinh.................………………………..................................................... 2.4.1. Kỹ thuật di truyền tế bào......................................................... 2.4.2. Kỹ thuật lai tại chỗ huỳnh quang............................................. 2.4.3. Kỹ thuật PCR đa mồi……....………....................................... 2.4.4. Kỹ thuật khuếch đại các đầu dò phụ thuộc ghép nối............... 2.4.5. Kỹ thuật Realtime PCR........................................................... 2.4.6. Kỹ thuật QF-PCR.................................................................... 2.4.7. Kỹ thuật giải trình tự……………............................................ 2.5. Tình hình nghiên cứu một số nguyên nhân vô sinh ở nam giới........... 2.5.1. Trên thế giới............................................................................ 4 4 4 5 9 9 9 12 12 16 19 24 24 25 25 26 26 27 29 30 30 2.5.2. Ở Việt Nam.............................................................................. 32 34 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................... 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát ................................................................................................. 34 3.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 34 3.2.1. Tiêu chuẩn chọn mẫu .................................................................................... 34 3.2.2. Tiêu chuẩn loại trừ......................................................................................... 35 3.3. Cỡ mẫu ...................................................................................................................... 35 3.4. Phương pháp chọn mẫu ............................................................................................ 35 3.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 35 3.6. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất................................................................ 36 3.7. Phương pháp nghiên cứu...................................................................... 39 3.7.1. Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch ................................................................................. 39 3.7.2. Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định ............................................................... 43 3.7.3. Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch ........................................................................................ 47 3.8. Y đức trong nghiên cứu ............................................................................................ 55 56 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN... ............................................................. 4.1. Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch ................................................................................................... 56 4.1.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật QF-PCR........................................................... 56 4.1.2. Kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR ......................................................... 63 4.2. Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định ........................................................................ 77 4.2.1. Các dạng mất đoạn AZF trên nhiễm sắc thể Y ............................................. 80 4.2.2. Nhân đoạn gen DAZ ...................................................................................... 85 4.2.3. Hội chứng Klinefelter có bất thường nhiễm sắc thể Y .................................. 86 4.3. Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng /mL tinh dịch .................................................................................................. 87 4.3.1. Đặc điểm chung và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y................................................................................................................ 87 4.3.2. Đặc điểm tinh dịch đồ ................................................................................... 100 4.3.3. Đặc điểm nội tiết trục tuyến yên-tinh hoàn và liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ hormon ........................................................... 105 111 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................ 5.1. Kết luận ..................................................................................................................... 111 5.2. Kiến nghị................................................................................................................... 111 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 131 PHỤ LỤC........................................................................................................................ TÓM TẮT Luận án được thực hiện từ tháng 11/2014 đến 03/2017 với những mục tiêu là (1) xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch; (2) xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và kiểm định và (3) mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Nghiên cứu đã xây dựng thành công kit và quy trình kỹ thuật QF-PCR dùng để phát hiện một số bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh. Quy trình kỹ thuật QF-PCR sử dụng kit với 14 chỉ dấu di truyền là SRY, AMEL, TAF9B, sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY1291, CDY và DAZ. Kết quả kiểm định thấy rằng kit với 14 chỉ dấu di truyền và quy trình kỹ thuật QF-PCR đã được xây dựng và tối ưu có độ tin cậy và chính xác cao. Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y là 35,1% ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch (113/322 trường hợp). Các bất thường nhiễm sắc thể Y gồm có các mất đoạn AZF chiếm 94/113 trường hợp (83,2%), nhân đoạn gen DAZ chiếm 15/113 trường hợp (13,3%) và 4/113 trường hợp nam giới mắc hội chứng Klinefelter có bất thường nhiễm sắc thể Y chiếm 3,5%. Điểm mới trong luận án là 4 kiểu mất một phần đoạn AZFc mới được phát hiện: mất đoạn sY1191-sY1192, mất đoạn sY1291, mất 2 gen DAZ - 1 gen CDY1 và mất 1 gen CDY1. Bên cạnh đó, luận án ghi nhận nam giới vô tinh chiếm 93/322 trường hợp (28,9%). Tỷ lệ đối tượng nghiên cứu có bất thường nội tiết là 41,3% (133/322 trường hợp); trong đó tổn thương tế bào mầm nguyên phát gặp nhiều nhất (59/133 trường hợp). Kết quả cho thấy nam giới tiếp xúc với hóa chất, thuốc trừ sâu có nguy cơ bất thường nhiễm sắc thể Y cao gấp 1,64 lần so với nhóm không tiếp xúc, nhưng chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Ngoài ra, kết quả ghi nhận nam giới có bất thường nhiễm sắc thể Y nguy cơ bất thường về nồng độ hormon FSH, LH và testosteron cao gấp 1,43; 1,2 và 1,39 lần so với nhóm không có bất thường nhiễm sắc thể Y, tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Từ khóa: AZF, không có tinh trùng, nhiễm sắc thể Y, QF-PCR, thiểu tinh nặng, vô sinh nam. i SUMMARY The thesis was conducted from November 2014 to March 2017 with the objectives of (1) to set up and to assure the procedure of QF-PCR assay using for detecting some kinds of Y-chromosomal abnormalities in men with sperm concentration ≤ 5 million/ml, (2) to determine the percentage of some kinds of Y-chromosomal abnormalities in men with sperm concentration ≤5 million/ml by the settled up and assured procedure of QF-PCR assay and (3) to describe characteristics of semenogram, endocrines and some factors related to Ychromosomal abnormalities in men with sperm concentration ≤ 5 million/ml. The study had been settled up the successful kit and protocol of QF-PCR assay used to detect some kinds of Y-chromosomal abnormalities in men seeking medical care for their fertility. The kit and protocol of QF-PCR assay were used fourteenth markers such as SRY, AMEL, TAF9B, sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1191, sY1192, sY1291, CDY and DAZ. Assuring results were shown that the protocol of settled up and optimized QFPCR assay with 14 genetic markers was highly reliable and accurate. The incidence of Y-chromosomal abnormalities accounted for 35.1% (113/322 cases). Y-chromosomal abnormalities were figured out: AZF deletions were 94/113 cases (83.2%), DAZ duplications were 15/113 cases (13.3%) and 4/113 cases of Klinefelter syndrome having Y-chromosomal abnormalities (3.5%). The highlight in our data was four kinds of de novo partial AZFc deletions were detected as sY1191-sY1192 deletion, sY1291 deletion, two DAZ – one CDY1 deletion and one CDY1 deletion. Moreover, azoospermic men accounted for 93/322 cases (28.9%). The percentage of patients had endocrine disruptors was 41.3% (133/322 cases), in which primary germ cell damage was the most common, accounted for 44.3% (59/133 cases) The study found that men exposed to chemicals and pesticides had a 1.64-fold higher risk of the Y-chromosomal abnormalities than those without exposed (p > 0.05). Men with the Y-chromosomal abnormalities had 1.43 times; 1.2 times and 1.39 times higher risk of reducing FSH, LH and testosterone levels than the others, respectively. However, it was not statistically significant with p > 0.05. Keywords: A Z F , azoospermia, male infertility, QF–PCR, s e v e r e oligozoospermia, Y chromosome. ii DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1. Ngưỡng giá trị bình thường của tinh dịch đồ 9 Bảng 2.2. Các chỉ dấu di truyền dùng để xác định các đoạn AZF 18 Bảng 2.3. Những chỉ dấu di truyền khác 19 Bảng 3.1A. Các chỉ dấu di truyền dùng phát hiện một số dạng bất thường 38 nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh Bảng 3.1B. Một số đặc điểm của 2 chỉ dấu di truyền sY1291 và LAPT 39 Bảng 3.2. Nhiệt độ gắn mồi của các chỉ dấu di truyền tham khảo trên 40 trang web của NEB Bảng 3.3. Thành phần phản ứng QF-PCR set 1 đã tối ưu để phát hiện 41 một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh Bảng 3.4. Thành phần phản ứng QF-PCR set 2 đã tối ưu để phát hiện 41 một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh Bảng 3.5. Thành phần phản ứng QF-PCR set 3 đã tối ưu để phát hiện 42 một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh Bảng 3.6. Thể tích pha loãng sản phẩm PCR huỳnh quang 42 Bảng 3.7. Một số bất thường di truyền nhiễm sắc thể Y ở nam giới 46 khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch Bảng 4.1. Số lượng và vị trí các đoạn gen được khuếch đại bằng cặp 59 mồi của các chỉ dấu di truyền sử dụng màu FAM Bảng 4.2. Số lượng và vị trí các đoạn gen được khuếch đại bằng cặp 61 mồi của các chỉ dấu di truyền sử dụng màu VIC Bảng 4.3. Số lượng và vị trí các đoạn gen được khuếch đại bằng cặp 63 mồi của các chỉ dấu di truyền sử dụng màu NED Bảng 4.4. Kích thước sản phẩm PCR huỳnh quang so với kích thước 65 sản phẩm PCR tham khảo trên NCBI Bảng 4.5. So sánh kết quả với nghiên cứu Plaseska et al. (2011) và 66 ngân hàng cơ sở dữ liệu NCBI Bảng 4.6. Tỷ lệ nam giới khám vô sinh có bất thường nhiễm sắc thể Y ở 78 nhóm nam giới vô tinh và thiểu tinh nặng Bảng 4.7. Một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y của đối tượng 79 nghiên cứu Bảng 4.8. Các dạng mất đoạn AZF của đối tượng nghiên cứu 80 Bảng 4.9. Các kiểu mất một phần đoạn AZFc của đối tượng nghiên cứu 82 iii Bảng 4.10 Bảng 4.11. Bảng 4.12. Bảng 4.13. Bảng 4.14. Bảng 4.15. Bảng 4.16. Bảng 4.17. Bảng 4.18. Bảng 4.19. Bảng 4.20. Bảng 4.21. Bảng 4.22. Bảng 4.23. Bảng 4.24. Bảng 4.25. Bảng 4.26. Bảng 4.27. Bảng 4.28. Bảng 4.29. Bảng 4.30. Bảng 4.31. Bảng 4.32. Bảng 4.33. Bảng 4.34. Bảng 4.35. Bảng 4.36. So sánh tuổi của nam giới khám vô sinh ở một số nghiên cứu Nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa tuổi với bất thường nhiễm sắc thể Y Nghề nghiệp của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa nghề nghiệp có tiếp xúc với hóa chất, thuốc trừ sâu với bất thường nhiễm sắc thể Y Phân loại vô sinh nguyên phát và thứ phát của đối tượng nghiên cứu Thời gian vô sinh của đối tượng nghiên cứu Thói quen để điện thoại di động của đối tượng nghiên cứu Thời gian sử dụng điện thoại di động của đối tượng nghiên cứu Tiền sử quai bị của đối tượng nghiên cứu BMI của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa BMI với bất thường nhiễm sắc thể Y Thể tích tinh hoàn của đối tượng nghiên cứu Bất thường bìu của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa giãn tĩnh mạch thừng tinh với bất thường nhiễm sắc thể Y Đặc điểm pH tinh dịch của đối tượng nghiên cứu Đặc điểm thể tích tinh dịch của đối tượng nghiên cứu Đặc điểm mật độ tinh trùng của đối tượng nghiên cứu Tỷ lệ nam giới vô tinh và thiểu tinh nặng ở các nghiên cứu Đặc điểm các thông số tinh trùng của nhóm nam giới thiểu tinh nặng Nồng độ hormon FSH của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ FSH Nồng độ hormon LH của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ LH Nồng độ hormon testosteron của đối tượng nghiên cứu Liên quan giữa bất thường nhiễm sắc thể Y với nồng độ testosteron Phân loại kết quả xét nghiệm nội tiết của đối tượng nghiên cứu iv 88 88 89 90 91 91 92 93 93 94 95 96 97 99 99 100 101 102 102 103 105 105 106 107 107 108 110 DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1A. Hình 2.1B. Hình 2.2. Hình 2.3. Hình 2.4. Hình 2.5. Hình 2.6. Hình 2.7. Hình 2.8. Hình 2.9. Hình 2.10. Hình 2.11. Hình 2.12. Hình 2.13. Hình 2.14. Hình 2.15. Hình 2.16. Hình 2.17. Hình 2.18. Hình 2.19. Hình 3.1. Hình 4.1. Hình 4.2. Hình 4.3. Hình 4.4. Trang Cấu tạo bộ máy sinh dục nam. 5 Cấu tạo bên trong tinh hoàn và mào tinh hoàn. 5 Thiết đồ cắt ngang tinh hoàn. 6 Quá trình phát triển tế bào mầm ở nam giới. 7 Vị trí vùng hạ đồi, giao thoa thị giác và tuyến yên. 8 Vai trò của trục vùng hạ đồi-tuyến yên-tinh hoàn. 8 Ảnh hưởng của thuốc lá đến khả năng sinh sản của nam 11 giới. Cấu trúc nhiễm sắc thể Y. 12 Vị trí và các gen trên đoạn AZFa. 13 Các đoạn ADN lặp đối xứng đảo ngược và amplicon ở 14 đoạn AZFb và AZFc. Nhóm gen có trình tự đơn và nhóm gen có trình tự lặp ở 14 đoạn AZFb. Các tiểu amplicon tham gia cấu tạo đoạn AZFc và các 15 nhóm gen đoạn AZFc. Cấu trúc các gen DAZ ở người với các màu thể hiện cho 16 các trình tự lặp khác nhau. Vị trí sản phẩm các đoạn ADN được khuếch đại bằng cặp 17 mồi của 13 chỉ dấu di truyền trên nhiễm sắc thể Y. Các kiểu mất một phần đoạn AZFc. 22 Cấu trúc và các dạng mất đoạn AZF của nhiễm sắc thể Y 23 ở nam giới. Kết quả QF-PCR trên máy phân tích di truyền ABI 3500. 27 Kết quả QF-PCR ở người bình thường (A, B) và người thể 28 tam nhiễm (C, D). Thể tam nhiễm ở người có 3 alen đồng hợp tử. 28 Nguyên lý giải trình tự. 29 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 34 Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu 58 FAM. Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu 60 VIC. Sự đa hình về chiều dài sản phẩm PCR huỳnh quang được 62 khuếch đại bằng cặp mồi của chỉ dấu di truyền sY1291. Kết quả QF-PCR nhóm chỉ dấu di truyền sử dụng màu 62 v Hình 4.5. Hình 4.6. Hình 4.7. Hình 4.8. Hình 4.9. Hình 4.10. Hình 4.11. Hình 4.12A. Hình 4.12B. Hình 4.13A. Hình 4.13B. Hình 4.13C. Hình 4.13D. Hình 4.14. Hình 4.15A. Hình 4.15B. Hình 4.15C. NED. Kết quả QF-PCR mẫu chứng dương nam giới mắc hội chứng Klinefelter. Kết quả QF-PCR mẫu chứng dương nam giới bị mất hoàn toàn đoạn AZFc. Kết quả QF-PCR và lâm sàng của nam giới mắc hội chứng Klinefelter mẫu 97. Nam giới mắc hội chứng Klinefelter có karyotype 47,XXY được xác định bằng kỹ thuật nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi. Kết quả kiểm định mẫu ADN nam giới không có mất đoạn AZF bằng kỹ thuật QF-PCR theo kit của Devyser. Kết quả điện di gel agarose của 2 mẫu ADN 100 và 207 bằng cặp mồi của sY1292 và LAPT (M: thang chuẩn). Kết quả điện di gel agarose sản phẩm PCR 8 mẫu ADN được khuếch đại bằng cặp mồi LAPT từ line 1-9, trong đó line 7 là thang chuẩn . Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và trình tự nucleotid của mẫu (SA100) với kích thước đoạn gen khuếch đại là 527 bp. Độ tương đồng giữa trình tự nucleotid tham khảo (REF) và trình tự nucleotid của mẫu (SA207) với kích thước đoạn gen khuếch đại là 507 bp. Kết quả giải trình tự đoạn mồi xuôi của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 527 bp. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 527 bp. Kết quả giải trình tự đoạn mồi xuôi của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 507 bp. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng sY1291 có kích thước 507 bp. Trình tự nucleotid của đoạn gen dài 527 bp được khuếch đại bằng cặp mồi của sY1291. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 207. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 122. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 327. vi 67 68 69 69 70 71 72 72 73 74 74 74 74 75 76 76 76 Hình 4.15D. Kết quả giải trình tự đoạn mồi ngược của đoạn gen được khuếch đại bằng LAPT mẫu 100. Hình 4.16. Tỷ lệ bất thường nhiễm sắc thể Y của đối tượng nghiên cứu Hình 4.17 Kết quả QF-PCR mẫu 236 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL là 6:2 tại vị trí 210 bp và 214 bp. Hình 4.18 Kết quả QF-PCR mẫu 174 với tỷ lệ peak DAZ/DAZL là 8:2 tại vị trí 210 bp và 214 bp. Hình 4.19A. Nam giới bình thường có tỷ lệ peak của AMELX/AMELY và TAF9B3/TAF9BX tương ứng là 1:1 và 2:1 của mẫu 95. Hình 4.19B. Nam giới tăng 1 nhiễm sắc thể X có tỷ lệ peak của AMELX/AMELY và TAF9B3/TAF9BX tương ứng là 2:1 và 2:2 của mẫu 97. Hình 4.20. Tỷ lệ bất thường bìu của đối tượng nghiên cứu. Hình 4.21. Tỷ lệ bất thường về nội tiết của đối tượng nghiên cứu vii 76 77 85 85 86 86 98 109 TỪ VIẾT TẮT A ADN ARN AZF BMI BOULE (BOLL) bp BPY2 C CDY CNV Cy5 CYorf DAZ DAZL DBY DDX3X DDX3Y EAA EIF1AX EIF1AY EMQN F FAM FISH FSH G GnRH HEX HSFX HSFY ISCN IUI Adenine Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic Azoospermia factor (Yếu tố không có tinh trùng) Body mass index (Chỉ số khối cơ thể) Bol, boulelike Base pair Basic charge, Y-linked, 2 Cytosine Chromodomain protein, Y-linked Copy number variation (Biến dị số lượng bản sao) Cyanine 5 Chromosome Y open reading frame Deleted in azoospermia Deleted in azoospermia-like Dead box on Y chromosome DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, X-linked DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box polypeptide 3, Y-linked European Academy of Andrology (Viện Hàn lâm Nam học Châu Âu) Eukaryotic translation initiation 1A, X-linked Eukaryotic translation initiation 1A, Y-linked European Molecular Genetics Quality Network (Mạng lưới kiểm định chất lượng Di truyền phân tử Châu Âu) Forward (Xuôi) Fluorescent amidite matrix standards Fluorescence in situ hybridization (Lai tại chỗ huỳnh quang) Follice-stimulating hormon Guanine Gonadotropin releasing hormon 5’Hexachloro-fluorescein Heat shock transcription factor, X-linked Heat shock transcription factor, Y-linked International system for human cytogenetic nomenclature (Hệ thống danh pháp quốc tế về di truyền tế bào người) Intrauterine insemination (Bơm tinh trùng vào buồng tử cung) viii IVF ISOGG Karyotype KDM5D LH M mARN MicroTESE MLPA MSY NGS NP Palindrome PAR PCR PHA PR PRY QF-PCR R RBMX RBMY1A1 REF ROS ROX RPS4X RPS4Y2 SCOS SNP SRY STR STS T USP9X USP9Y In vitro fertilization (Thụ tinh trong ống nghiệm) International Society of Genetic Genealogy (Hiệp hội quốc tế về di truyền phả hệ Công thức nhiễm sắc thể, công thức nhân Lysine (K)-specific demethylase 5 D Luteinizing hormone Marker (Thang chuẩn) Messenger acid ribonucleic Micro testicular sperm extraction (Vi phẫu thuật tách tinh trùng từ tinh hoàn) Multiplex ligation dependent probe amplification (Khuếch đại các đầu dò phụ thuộc ghép nối) Male-specific Y (Vùng chỉ có ở nam giới) Next-generation sequencing (Giải trình tự thế hệ mới) Non-Progressive motility (Tinh trùng di động không tiến tới) Đoạn lặp lại đối xứng đảo ngược Pseudautosomal region (Vùng giả nhiễm sắc thể thường) Polymerase chain reaction Phytohemaglutinin Progressive motility (Khả năng di động tiến tới) PTPN13-like, Y-linked Quantitative flourescence polymerase chain reaction Reverse (Ngược) RNA binding motif protein, X-linked, RNA binding motif protein, Y-linked, family 1, member A1 Reference Reactive oxygen species (Các dạng oxi hoạt động tự do) 5’ 6 Carboxyl I-X-Rhodamine Ribosomal protein S4, X-linked Ribosomal protein S4, Y-linked 2 Sertoli cell only syndrome (Hội chứng chỉ có dòng tế bào Sertoli) Single nucleotide polymorphism Sex determining region Y (Vùng quyết định giới tính của nam) Short tandem repeat (Trình tự lặp cụm ngắn) Sequence tagged site (Vị trí trình tự được đánh dấu) Thymine Ubiquitin-specific peptidase 9 X-linked Ubiquitin-specific peptidase 9 Y-linked ix UTY WHO WPRO XKRY Ubiquily transcribed tetratricopeptide repeat gene, Y-linked World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) Western Pacific Region Organization XK, Kell blood group complex subunit-related, Y-linked x CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO - World Health Organization), Việt Nam là một trong những quốc gia tại khu vực Châu Á có tỷ lệ vô sinh cao nhất. Khoảng 10-15% các cặp vợ chồng cần điều trị vô sinh, trong đó nguyên nhân vô sinh do nam giới chiếm 40% (Trịnh Thế Sơn, 2011). Có nhiều nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới, trong đó nguyên nhân di truyền chiếm từ 4-38% (Mafra et al., 2011; Cavkaytar et al., 2012; Fu et al., 2012; Choi et al., 2013; Ambulkar et al., 2013; Nasasse et al., 2015; Nguyễn Đức Nhự, 2015). Hội chứng Klinefelter và mất đoạn AZF (AZF Azoospermia factor) trên nhiễm sắc thể Y là 2 nguyên nhân di truyền thường gặp ở nam giới vô sinh. Trên nhiễm sắc thể Y có các đoạn AZFa, AZFb và AZFc liên quan đến quá trình sinh tinh (Li et al., 2015). Nam giới bị mất đoạn AZF có kết quả tinh dịch đồ từ thiểu tinh nhẹ hoặc nặng đến vô tinh (Krausz et al., 2014). Tỷ lệ nam giới vô sinh bị mất đoạn AZF ở Việt Nam khoảng 5-12,8% (Nguyễn Minh Hà, 2011; Nguyễn Thị Việt Hà, 2012; Phan Thị Hoan, 2012; Trần Văn Khoa và ctv, 2013; Nguyễn Đức Nhự, 2015). Bằng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, cho đến nay chỉ có nam giới mất đoạn AZFc có thể có con; tỷ lệ thành công khoảng 70%. Viện Hàn Lâm Nam học Châu Âu/Mạng lưới kiểm định chất lượng Di truyền phân tử Châu Âu (EAA/EMQN - European Academy of Andrology/European Molecular Genetics Quality Network) khuyến cáo trước khi sử dụng kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch nên thực hiện xét nghiệm di truyền (Krausz et al., 2014). Hiện nay, tại các phòng xét nghiệm vẫn sử dụng phương pháp di truyền tế bào nuôi cấy bạch cầu lympho máu ngoại vi để xác định bất thường số lượng và một số bất thường cấu trúc lớn của nhiễm sắc thể. Trường hợp nam giới vô sinh có bộ nhiễm sắc thể bình thường (46,XY) sẽ được bác sỹ tư vấn làm xét nghiệm mất đoạn AZF bằng kỹ thuật PCR đa mồi. Năm 2014, Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ được trang bị máy phân tích di truyền ABI 3500 phục vụ chẩn đoán trước sinh. Phát huy thiết bị sẵn có, luận án đã xây dựng, tối ưu kit và quy trình kỹ thuật QF-PCR (QFPCR - Quantitative fluorescence – Polymerase chain reaction) để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh. So với quy trình hiện nay đang áp dụng ở các phòng xét nghiệm, quy trình kỹ thuật QF1 PCR được tối ưu có thể phát hiện đồng thời 2 nguyên nhân di truyền thường gặp ở nam giới vô sinh chỉ trong 1 lần xét nghiệm. Ngoài ra, thời gian xét nghiệm nhanh, giá thành rẻ là ưu điểm của kỹ thuật QF-PCR. Chính vì vậy, nhiều nghiên cứu đề xuất nên áp dụng kỹ thuật này trong chẩn đoán tìm nguyên nhân di truyền ở nam giới vô sinh (Qi et al., 2011; Yuanyuan et al., 2014). Trên cơ sở đó, đề tài “Nghiên cứu một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ” được thực hiện nhằm hỗ trợ các bác sĩ lâm sàng chẩn đoán và tư vấn điều trị hiếm muộn cho nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch một cách hiệu quả. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng và kiểm định quy trình kỹ thuật QF-PCR để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. - Xác định tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch bằng quy trình kỹ thuật QFPCR đã được xây dựng và kiểm định. - Mô tả đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố và một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. 1.3. Giới hạn của nghiên cứu Luận án chưa xác định được những trường hợp nam giới vô tinh là do tắc nghẽn hay không tắc nghẽn. Tất cả các trường hợp vô tinh đều được đưa vào nghiên cứu. 1.4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Cung cấp những cứ liệu khoa học về tỷ lệ một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y, đặc điểm tinh dịch đồ, nội tiết tố, một số yếu tố liên quan đến bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. - Sử dụng làm tài liệu tham khảo và học thuật cho sinh viên bậc đại học và học viên sau đại học tại các cơ sở đào tạo khi nghiên cứu về lĩnh vực này. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn Xét nghiệm tinh dịch đồ theo tiêu chuẩn của WHO (2010) đang được sử dụng thường qui để chẩn đoán vô sinh nam giới. Tuy nhiên, nếu chỉ căn cứ vào kết quả xét nghiệm này thì các bác sỹ lâm sàng không biết được nguyên nhân có phải do rối loạn vật chất di truyền hay không. Hiện tại, bệnh viện Phụ 2 sản thành phố Cần Thơ đã triển khai các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản như: lọc rửa tinh trùng, bơm tinh trùng vào buồng tử cung và thụ tinh trong ống nghiệm cho nam giới khám vô sinh có > 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch. Đối với nam giới có ≤ 5x106 tinh trùng/mL tinh dịch, bác sĩ sẽ tư vấn họ lên các bệnh viện tuyến trên chẩn đoán và điều trị. Vì vậy, nghiên cứu này có ý nghĩa rất lớn trong việc hỗ trợ chẩn đoán, tư vấn và điều trị vô sinh hiệu quả và ít tốn kém hơn cho bệnh nhân tại Bệnh viện Phụ sản thành phố Cần Thơ nói riêng và khu vực Đồng bằng sông Cửu Long nói chung. 1.5. Những điểm mới của luận án - Nghiên cứu xây dựng bộ kit với 14 chỉ dấu di truyền và tối ưu hóa thành công quy trình kỹ thuật QF-PCR dùng để phát hiện một số dạng bất thường nhiễm sắc thể Y ở nam giới khám vô sinh. - Nghiên cứu của Rozen et al. (2012) là nghiên cứu đầu tiên và duy nhất công bố có 2 kiểu mất một phần đoạn AZFc là gr/gr và b2/b3 ở người Việt Nam. Nghiên cứu của chúng tôi bên cạnh 2 kiểu trên, còn ghi nhận 4 kiểu đột biến mới là mất đoạn sY1191-sY1192, sY1291, 2 gen DAZ - 1 gen CDY1 và mất 1 gen CDY1. - Luận án ghi nhận sự đa hình về chiều dài đoạn gen được khuếch đại bằng chỉ dấu di truyền sY1291, dao động từ 507-527 bp. 3