Tài liệu Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền trung và bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH Hà Nội - 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LÊ THỊ PHƯƠNG THẢO NGHIÊN CỨU MỨC ĐỘ NHIỄM AFLATOXIN VÀ ĐỀ XUẤT MỘT SỐ GIẢI PHÁP CÔNG NGHỆ BẢO QUẢN LẠC SAU THU HOẠCH Ở CÁC TỈNH MIỀN TRUNG VÀ BẮC VIỆT NAM Ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 9540104 LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. HÀ DUYÊN TƯ 2. PGS. TS. PHẠM XUÂN ĐÀ Hà Nội - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này là công trình nghiên cứu bởi bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của tập thể hướng dẫn. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm Thay mặt tập thể giáo viên hướng dẫn Tác giả luận án PGS. TS Phạm Xuân Đà Lê Thị Phương Thảo i LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án. Tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến các giáo viên hướng dẫn khoa học: GS. TS. Hà Duyên Tư - nguyên phó hiệu trưởng trường Đại học Bách Khoa Hà Nội và PGS. TS. Phạm Xuân Đà - Cục trưởng Cục công tác phía Nam; Các thầy cô: PGS. TS. Lê Thanh Mai, PGS. TS. Nguyễn Thị Xuân Sâm, PGS. TS. Nguyễn Thị Minh Tú, TS. Vũ Hồng Sơn đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình nghiên cứu và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy/Cô Bộ môn Quản lý chất lượng, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học - Thực phẩm đã đóng góp ý kiến và hướng dẫn tôi, các cán bộ phụ trách đào tạo - Viện đào tạo sau đại học - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi hoàn thành mọi thủ tục cần thiết trong quá trình làm nghiên cứu sinh. Tôi trân trọng cảm ơn PGS.TS. Lê Thị Hồng Hảo và các đồng nghiệp công tác tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu thập dữ liệu, cung cấp tài liệu cần thiết cho luận án, cũng như có những ý kiến đóng góp quý báu trong quá trình nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến PGS. TS. Phạm Anh Tuấn - Viện trưởng Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch đã tận tình giúp đỡ tôi về chuyên môn trong quá trình nghiên cứu. Tôi rất biết ơn những người thân trong gia đình đã quan tâm và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi học tập và nghiên cứu. Quá trình thực hiện luận án còn nhiều thiếu sót, tôi rất mong nhận được sự góp ý của Quý Thầy/Cô để bản thân có thể khắc phục những hạn chế và hoàn chỉnh luận án, đóng góp tích cực cho ngành. Trân trọng cảm ơn! Tác giả luận án ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ..................................... ix DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................... xii DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ ............................................................ xiv MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ................................................................................ 2 4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................................2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn..................................................................................................................3 5. Những đóng góp mới của luận án........................................................................... 3 6. Cấu trúc của luận án ............................................................................................... 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 5 1.1. Cây lạc ................................................................................................................. 5 1.1.1. Giới thiệu chung về cây lạc ..............................................................................................5 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ lạc trên thế giới và Việt Nam.........................................7 1.1.3. Quy định về mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc........................................... 11 1.2. Aflatoxin ............................................................................................................ 12 1.2.1. Tính chất hóa lý của aflatoxin ....................................................................................... 12 1.2.2. Ảnh hưởng của aflatoxin đối với sức khỏe .................................................................. 13 1.2.3. Các phương pháp lấy mẫu, phương pháp phân tích aflatoxin .................................... 15 iii 1.2.4. Tình hình nhiễm aflatoxin trên lạc................................................................................ 17 1.3. Aspergillus trên lạc ............................................................................................ 19 1.3.1. Tình hình nhiễm nấm mốc trên lạc ............................................................................... 19 1.3.2. Aspergillus flavus .......................................................................................................... 21 1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin của A. flavus ........... 23 1.4.1. Ảnh hưởng của độ ẩm và hoạt độ nước ....................................................................... 24 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................ 28 1.4.3. Ảnh hưởng của nấm mốc đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản .................... 29 1.4.4. Ảnh hưởng của tinh dầu tới sự phát triển và sinh aflatoxin của Aspergillus flavus .. 30 1.4.5. Ảnh hưởng của môi trường không khí đến chất lượng lạc trong quá trình bảo quản 33 1.5. Các biện pháp kiểm soát aflatoxin nhiễm trong lạc và nông sản khô sau thu hoạch trên thế giới và Việt Nam ......................................................................................... 35 1.5.1. Kiểm soát chất lượng sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản.............................. 35 1.5.2. Đóng gói điều biến khí quyển....................................................................................... 38 1.5.3. Các loại bao bì dùng trong bảo quản lạc ...................................................................... 40 1.5.4. Bảo quản hoặc giảm nhiễm aflatoxin bằng phương pháp hóa học ............................ 41 CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 43 2.1.1. Nguyên vật liệu .............................................................................................................. 43 2.1.2. Hóa chất sử dụng ........................................................................................................... 43 2.1.3. Thiết bị sử dụng chính ................................................................................................... 43 2.1.4. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 44 2.2. Phương pháp lấy mẫu ........................................................................................ 45 2.3. Phương pháp phân tích hóa lý ........................................................................... 45 2.3.1. Xác định độ ẩm .............................................................................................................. 45 iv 2.3.2. Xác định hàm lượng aflatoxin ...................................................................................... 47 2.3.3. Đánh giá về mặt cảm quan của các mẫu lạc thu thập mùa thu năm 2013 ................. 50 2.4. Phương pháp phân tích sinh học ........................................................................ 51 2.4.1. Xác định tổng số bào tử nấm men - mốc ..................................................................... 51 2.4.2. Phân lập nấm mốc sinh độc tố từ lạc ............................................................................ 52 2.4.3. Định danh nấm mốc Aspergillus flavus ....................................................................... 52 2.4.3. Chuẩn bị dịch bào tử Aspergillus flavus với hàm lượng khác nhau ........................... 54 2.5. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc ..................................... 55 2.5.1. Đánh giá trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập tại Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An vào mùa hè .................................................................................................. 55 2.5.2. Đánh giá mức nhiễm AF, nấm mốc trên lạc củ và lạc nhân vào mùa thu ................ 55 2.6. Phương pháp công nghệ ................................................................................................... 56 2.6.1. Điều chỉnh độ ẩm của lạc thí nghiệm ........................................................................... 56 2.6.2. Thiết kế thí nghiệm: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của Aspergillus flavus ................................................................................. 56 2.6.3. Thiết kế thí nghiệm nghiên cứu các giải pháp và đề xuất một số quy trình nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc ......................................................................................................... 62 2.7. Xử lý số liệu....................................................................................................... 63 2.8. Sơ đồ nghiên cứu ............................................................................................... 66 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................................... 67 3.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang ..................................................................................................... 67 3.1.1. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trên lạc nhân, lạc củ và lạc rang húng lìu thu thập vào mùa hè .................................................................................................. 67 3.1.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm mốc và AF trong lạc trên địa bàn huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang vào mùa thu ........................................................................................................... 75 v 3.1.3. Phân lập và xác định chủng sinh aflatoxin trên lạc...................................................... 79 3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh AF trên lạc của Aspergillus flavus BG1 ........................................................................................................................... 85 3.2.1. Đánh giá sự thay đổi độ ẩm của các mẫu lạc trong các loại bao bì khác nhau .......... 85 3.2.2. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển và sinh AF của chủng Aspergillus flavus BG1 trên lạc.............................................................................................................................. 86 3.2.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và sinh AF của Aspergillus flavus BG1 trên lạc....................................................................................................................................... 92 3.2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến sự sinh AF trên lạc ................................... 96 3.2.5. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1................................................................................................................... 100 3.2.6. Phân tích mối quan hệ của các yếu tố đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của A. flavus BG1 ......................................................................................................................... 102 3.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của tinh dầu hồi, quế đến khả năng ức chế sự phát triển của A. flavus................................................................................................................................... 108 3.3. Khảo nghiệm và đề xuất quy trình bảo quản nhằm tránh nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc .................................................................................................................. 117 3.3.1. Khảo nghiệm quy trình bảo quản lạc nhân bằng giải pháp kiểm soát chất lượng trước khi bảo quản ........................................................................................................................... 117 3.3.2. Quy trình bảo quản lạc bằng đóng gói hút chân không............................................. 120 3.3.3. Quy trình bảo quản lạc nhân bằng cách sử dụng tinh dầu hồi, quế .......................... 123 3.3.4. Đề xuất quy trình bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm aflatoxin trong lạc ........... 127 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................. 130 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN................. 132 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 133 vi PHỤ LỤC 1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ NHIỄM NẤM MỐC VA ̀ AFLATOXIN TRONG LẠC...................................................................................... 1 1.1. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân thu thập vào mùa hè tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An............................................................................1 1.2. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa hè tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An ..................................................................................3 1.3. Kết quả phân tích nấm men-mốc và aflatoxin của lạc rang húng lìu thu thập tại các tỉnh Bắc Giang, Thanh Hóa và Nghệ An ..........................................................................................5 1.4. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và AF trong lạc nhân thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang .........................................................................................................7 1.5. Tổng hợp tình trạng mẫu, độ ẩm, mức nhiễm nấm mốc và aflatoxin của lạc củ thu thập vào mùa thu tại Bắc Giang .........................................................................................................9 PHỤ LỤC 2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ SINH AF TRÊN LẠC CỦA A. FLAVUS BG1 ....................................................................................................... 11 2.1. Ảnh hưởng của độ ẩm ...................................................................................................... 11 2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ ................................................................................................... 12 2.3. Ảnh hưởng của điều kiện hút chân không ...................................................................... 13 2.4. Ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus đến khả năng sinh Aflatoxin trên lạc ................ 14 2.5. Ảnh hưởng của tinh dầu quế đến khả năng phát triển của A. flavus trên đĩa thạch ...... 15 PHỤ LỤC 3. XỬ LÝ SỐ LIỆU................................................................................ 18 3.1. Phần mềm xử lý số liệu R 3.4.1 ....................................................................................... 18 3.2. Đánh giá mức độ nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc....................................... 19 3.2.1. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc nhân giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang ................................................................................................. 19 3.2.2. So sánh mức nhiễm nấm men-mốc và Aflatoxin trên lạc củ giữa các tỉnh Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang ................................................................................................. 20 vii 3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của A. flavus và sinh AF trên lạc 21 3.3.1. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của độ ẩm............................................... 21 3.3.2. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của nhiệt độ............................................ 22 3.3.3. Phân tích hồi quy tuyến tính ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus ....................... 23 3.3.4. Phân tích mô hình hồi quy tuyến tính đa biến......................................................... 24 PHỤ LỤC 4. MỘT SỐ SẮC ĐỒ PHÂN TÍCH AFLATOXIN ............................... 26 4.1. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm....................................... 26 4.2. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ.................................... 27 4.3. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện hút chân không ....... 27 4.4. Sắc đồ phân tích AF trong nghiên cứu ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus BG1 ..... 28 viii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Chú giải Tiếng Việt Tiếng Anh AF Aflatoxin Aflatoxin ALARA Thấp ở mức có thể đạt được as low as reasonably achievable AN Acetonitrin Acetonitrile ADN Acid deoxyribonucleic AIC Tiêu chuẩn thông tin Akaike Akaike Information Criterion AOAC Hiệp hội các nhà hóa phân tích Association of Official Analytical Chemists ATCC Bộ sưu tập chủng của Mỹ American Type Culture Collection ATP Adenosine Triphosphate BIC Tiêu chuẩn thông tin Bayesian Bayesian Information Criterion BLAST Công cụ BLAST Basic Local Alignment Search Tool BMA Mô hình trung bình Bayes Bayesian Model Average BYT Bộ Y tế CE Cặp điện cực Calliper Electronic CFU Đơn vị khuẩn lạc Colony Forming Unit CZA Thạch Czapeck Dox Czapek Dox Agar DG Dichloran Glycerol Dichloran Glycerol ĐHBKHN Đại học Bách khoa Hà Nội ECD Bộ phát hiện bắt điện tử Electron Capture Detector EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid Ethylenediaminetetraacetic acid ELISA Hấp thụ miễn dịch liên kết Enzyme-linked enzyme assay FAO Tổ chức nông lương thế giới Food and Organization FP Sự phân cực huỳnh quang Fluorescence Polarization GC Sắc ký khí Gas Chromatography HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao High Performance Chromatography ix immunosorbent Agriculture Liquid HSCAS Thuỷ hợp natri canxi nhôm Hydrated sodium silicat aluminosilicate ITS Vùng đệm trong được sao mã ISO Tổ chức tiêu chuẩn hóa thế International Organization giới Standardization KEBS Văn phòng tiêu chuẩn Kenya KPH Không phát hiện KQĐ Không quy định LOD Giới hạn phát hiện Limit of Detection LOQ Giới hạn định lượng Limit of Quantitation MEA Thạch chiết xuất malt Malt Extract Agar MeOH Methanol Methanol MIC Nồng độ ức chế tối thiểu Minimum Concentration MIP In dấu phân tử polymer Molecularly Imprinted Polymer MIR Giữa hồng ngoại Mid-infrared ML Giới hạn tối đa Maximum limit MS Khối phổ Mass spectrometry NAFDAC Cơ quan hành chính và kiểm National Agency for Food and soát thuốc và thực phẩm Drug Administration and Control NCBI Trung tâm thông tin công National Center for Biotechnology nghệ sinh học quốc gia Information NIR Hồng ngoại gần Near-infrared OD Mật độ quang Optical density OPP Bao bì màng phức hợp Oriented Polypropylene polypropylene PCR “Phản ứng chuỗi trùng hợp” Polymerase Chain Reaction hay “phản ứng khuếch đại gen” PDA Môi trường thạch khoai tây Potato Dextrose Agar dextrose PE Polyethylene Polyethylene PP Polypropylene Polypropylene PVC Vinylchoride Vinylchoride QCVN Quy chuẩn Việt Nam x calcium Internal Transcribed Spacer for Kenya Bureau of Standards Inhibitory QĐ Quyết Định SDA Thạch Sabouraud Dextrose SĐH Sau Đại Học SDS Natri dodecyl sulfate Sodium dodecyl sulfate SPE Chiết pha rắn Solid Phase Extract RF Quang phổ hồng ngoại Red Fluorescent TCVN Tiêu Chuẩn Việt Nam TLC Sắc ký lớp mỏng Thin layer chromatography USDA Phòng nông nghiệp Hoa kỳ United States Agriculture UV Cực tím Ultra Violet YEP Chiết xuất Phosphate YPD Chiết xuất nấm men Peptone Yeast Extract Peptone Dextrose Dextrose nấm Sabouraud Dextrose Agar Department men Yeast Extract Phosphate xi of DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. 1. Diện tích, sản lượng và lượng tiêu thụ lạc của Việt Nam .............................. 8 Bảng 1. 2. Quy định mức tối đa cho phép nhiễm aflatoxin trong lạc ............................ 12 Bảng 2. 1. Chương trình gradient phân tích aflatoxin .................................................. 47 Bảng 3. 1. Số lượng mẫu nhiễm nấm men-mốc và aflatoxin trong lạc nhân ................ 68 Bảng 3. 2. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc nhân ............. 69 Bảng 3. 3. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ ........................................ 70 Bảng 3. 4. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc củ ................. 71 Bảng 3. 5. Số mẫu nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang húng lìu ...................... 72 Bảng 3. 6. Phân tích so sánh tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc và AF trong lạc rang ............. 73 Bảng 3. 7. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc nhân ........................... 76 Bảng 3. 8. Tỉ số nguy cơ nhiễm AF với tình trạng của mẫu lạc củ ............................... 78 Bảng 3. 9. Nồng độ DNA sau khi tách chiết của các chủng.......................................... 82 Bảng 3. 10. Kết quả tìm kiếm trên ngân hàng gen quốc tế............................................ 83 Bảng 3. 11. Khả năng sinh AF của ba chủng phân lập từ lạc ........................................ 84 Bảng 3. 12. Sự thay đổi độ ẩm của mẫu lạc nhân trong các bao bì khác nhau ............. 85 Bảng 3. 13. Ảnh hưởng của độ ẩm đến sự phát triển của A. flavus BG1 và sinh AF.... 86 Bảng 3. 14. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự phát triển của nấm mốc A. flavus BG1 .......... 92 Bảng 3. 15. Ảnh hưởng của lượng nấm mốc đến sự phát triển của A. flavus BG1 ....... 96 Bảng 3. 16. Ảnh hưởng của áp lực hút chân không đến sự phát triển của A. flavus BG1 .....................................................................................................................................100 Bảng 3. 17. Mối liên quan giữa mức độ sinh trưởng của A. flavus BG1 và hàm lượng AF ................................................................................................................................ 103 Bảng 3. 18. Bốn mô hình tối ưu và các thông số ......................................................... 106 Bảng 3. 19. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường PDA với nồng độ tinh dầu quế khác nhau ...................................................................109 Bảng 3. 20. Đường kính trung bình (cm) của khuẩn lạc A. flavus BG1 trên môi trường PDA với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau ...................................................................111 xii Bảng 3. 21. Mức nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian ....................................................................................................................... 113 Bảng 3. 22. Mức nhiễm AF trên lạc có nồng độ tinh dầu quế khác nhau theo thời gian .....................................................................................................................................114 Bảng 3. 23. Mức độ nhiễm nấm mốc trên lạc với nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian ....................................................................................................................... 115 Bảng 3. 24. Mức nhiễm AF trên các mẫu có nồng độ tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian .............................................................................................................................. 116 Bảng 3. 25. Hàm lượng AFB1 (µg/kg) của lạc nhân bảo quản bằng kiểm soát quá trình .....................................................................................................................................119 Bảng 3. 26. Kết quả hàm lượng aflatoxin B1 (µg/kg) của lạc nhân đóng gói hút chân không ........................................................................................................................... 122 Bảng 3. 27. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu quế khác nhau theo thời gian ....................................................................................................................... 124 Bảng 3. 28. Mức nhiễm AFB1 (g/kg) trên lạc với lượng tinh dầu hồi khác nhau theo thời gian ....................................................................................................................... 125 Bảng 3. 29. Tinh chi phí có và không sử dụng tinh dầu trong bảo quản lạc ...............126 xiii DANH MỤC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Hình 1. 1. Tổng diện tích/sản lượng lạc thế giới từ năm 2012 đến 2016 ....................... 8 Hình 1. 2. Hình minh họa giống lạc L14 ........................................................................ 9 Hình 1. 3. Cấu trúc hóa học của AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, AFM1 và AFM2 ............ 13 Hình 1. 4. Sự đồng hóa aflatoxin trong gan................................................................... 14 Hình 1. 5. Màu sắc của Aspergillus flavus: a-trên hạt; b-trên môi trường thạch Czapek Dox ................................................................................................................................ 21 Hình 1. 6. Hình ảnh cuống bào tử Aspergillus flavus ................................................... 22 Hình 1. 7. Hình ảnh bào tử Aspergillus flavus............................................................... 22 Hình 1. 8. Đẳng nhiệt hút ẩm của thực phẩm ................................................................ 24 Hình 1. 9. Hoạt độ nước và sự ổn định của thực phẩm ................................................ 25 Hình 1. 10. Cân bằng hoạt độ nước và hàm lượng nước .............................................. 26 Hình 1. 11. Độ ẩm không khí trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 ....................................................................................................................................... 27 Hình 1. 12. Nhiệt độ trung bình theo tháng đo tại một số trạm vào năm 2013 ............ 29 Hình 1. 13. Cơ chế tác động của tinh dầu lên tế bào vi sinh vật .................................. 31 Hình 2. 1. Sắc đồ phân mảnh của các aflatoxin............................................................. 48 Hình 2. 2. Sắc đồ các điểm chuẩn Aflatoxin B1 ........................................................... 49 Hình 2. 3. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB1 ............................................................... 49 Hình 2. 4. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFB2 ............................................................... 49 Hình 2. 5. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG1 ............................................................... 50 Hình 2. 6. Sắc đồ đường nền và chuẩn AFG2 ............................................................... 50 Hình 2. 7. Mô phỏng quá trình pha loãng dịch bào tử A. flavus.................................... 54 Hình 2. 8. Mô phỏng quá trình cấy dịch bào tử pha loãng trên đĩa thạch ..................... 54 Hình 2. 9. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của độ ẩm tới sự phát triển và sinh AF ...... 58 Hình 2. 10. Mẫu lạc thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển và sinh AF . 59 Hình 2. 11. Mẫu thí nghiệm ảnh hưởng của mức nhiễm A. flavus B1 .......................... 59 Hình 2. 12. Mẫu thí nghiệm điều kiện hút chân không ................................................. 60 Hình 2. 13. Mô hình thực nghiệm hút chân không ........................................................ 60 xiv Hình 2. 14. Đo kích thước đường kính A. flavus ........................................................... 61 Hình 2. 15. Thí nghiệm ảnh hưởng của tinh dầu trên lạc thí nghiệm ............................ 62 Hình 2. 16. Mô phỏng phát hiện lạc nhiễm AF bằng đèn UV ở bước sóng 365 nm ..... 63 Hình 2. 17. Sơ đồ nghiên cứu ........................................................................................ 66 Hình 3. 1. Tỉ lệ nhiễm nấm men-mốc trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang ...................................................................................................................... 74 Hình 3. 2. Tỉ lệ nhiễm AF trong lạc thu thập tại Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc Giang . 74 Hình 3. 3. Các đĩa nuôi cấy: a) không có nấm mốc; b) và c) có nấm mốc và nấm men ....................................................................................................................................... 75 Hình 3. 4. Mặt trước (a) và mặt sau (b) của đĩa nuôi cấy sau 3 ngày............................ 79 Hình 3. 5. Hình thái khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường SDA ................... 80 Hình 3. 6. Chủng phân lập từ lạc (a, b) và ATCC 204304 (c) cấy điểm trên SDA sau 5 ngày................................................................................................................................ 80 Hình 3. 7. Bọng nấm hình chùy đến cầu, thể bình 1 lớp (a), thể bình hai lớp (b); Bào tử nấm hình cầu đến gần cầu, màu xanh (c,d) ................................................................... 81 Hình 3. 8. Ảnh hiển vi điện tử quét chủng nấm A1....................................................... 81 Hình 3. 9. Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn ITS; (+): Đối chứng A. flavus ATCC 204304, (-): Đối chứng âm ............................................................................................ 83 Hình 3. 10. Mẫu lạc nhiễm A. flavus BG1 phát huỳnh quang sau 10 ngày nuôi cấy ở 25 o C ................................................................................................................................... 84 Hình 3. 11. Sắc đồ AFB1 của chuẩn (a) và mẫu (c); sắc ký đồ AFB2 của chuẩn (b) và mẫu (c) ........................................................................................................................... 85 Hình 3. 12. Màu sắc của A. flavus BG1 phát triển trên lạc ........................................... 89 Hình 3. 13. Biểu đồ AFB1 và AF tổng số trong các mẫu có độ ẩm khác nhau; AFB110% (mẫu có độ ẩm 10 %); AFs-10% (mẫu có độ ẩm 10%); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ................................ 90 Hình 3. 14. Aflatoxin nhiễm trong các mẫu ở nhiệt độ khác nhau; AFB1-25 (AFB1 trong mẫu ở điều kiện 25oC); AFs-25 (AF tổng số ở điều kiện 25 oC); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ......... 94 Hình 3. 15. Xác suất phân phối mật độ cho biến nhiệt độ (Tem) .................................. 95 xv Hình 3. 16. Kết quả phân tích AF trong thí nghiệm ảnh hưởng mức nhiễm A. flavus theo tuần; AFB1-10^1 (AFB1 trong mẫu nhiễm 101 CFU A. flavus/g); AFs-10^1 (AF tổng số trong mẫu nhiễm 101 CFU A. flavus/g); ML-AFB1 (Ngưỡng cho phép của AFB1); ML- AFs (Ngưỡng cho phép của AF tổng số) ................................................ 99 Hình 3. 17. Kết quả phân tích AFB1 theo tuần trong thí nghiệm điều kiện hút chân không ........................................................................................................................... 102 Hình 3. 18. Biểu đồ mối tương quan giữa các biến (Thời gian – Week, Độ ẩm – Moi, Nhiệt độ - Tem, Mức nhiễm A. flavus – Flavus, AFB1 và AF tổng số - AFTotal) .....105 Hình 3. 19. Các mô hình được BMA lựa chọn............................................................ 107 Hình 3. 20. Khuẩn lạc phát triển trên các đĩa thạch: a) đối chứng - không bổ sung tinh dầu; b) bổ sung tinh dầu Quế 0,0125 %; c) bổ sung tinh dầu Quế 0,025%; d) bổ sung tinh dầu Hồi 0,2 %; e) bổ sung tinh dầu Hồi 0,4 %; f) bổ sung tinh dầu Hồi 0,8 % ...108 Hình 3. 21. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu quế .....110 Hình 3. 22. Biểu đồ phát triển của khuẩn lạc trên đĩa thạch bổ sung tinh dầu hồi ......112 Hình 3. 23. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng kiểm soát quá trình ......118 Hình 3. 24. Quy trình khảo nghiệm bảo quản lạc nhân bằng đóng gói hút chân không .....................................................................................................................................121 Hình 3. 25. Quy trình bảo quản lạc nhân có sử dụng tinh dầu ....................................123 Hình 3. 26. Quy trình bảo quản lạc đề xuất .................................................................127 Hình 3. 27. Mô hình băng tải kiểm tra phát hiện AF trong lạc ...................................128 Hình 3. 28. Máy đóng túi hút chân không ...................................................................129 xvi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Aflatoxin là độc tố vi nấm có thể bị nhiễm trong nhiều lương thực thực phẩm. Tổ chức nghiên cứu ung thư thế giới xếp aflatoxin vào nhóm chất có độc tính gây ung thư loại 1, là nguyên nhân chính gây ung thư gan, giảm miễn dịch và tình trạng còi cọc ở trẻ. Aflatoxin nhiễm trong thực phẩm ảnh hưởng đến kinh tế và thương mại trong mọi giai đoạn trên thị trường tiêu thụ và xuất khẩu. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, đặc biệt là nấm mốc sinh độc tố aflatoxin [16, 104]. Trong số nấm mốc đã được phân loại có 30-40 % có thể sinh độc tố với liều lượng khác nhau. Nhiều loài nấm mốc khác nhau có thể sinh ra cùng một loại độc tố. Một loài nấm mốc cũng có thể sinh ra nhiều độc tố khác nhau tùy thuộc vào điều kiện môi trường và cơ chất [4]. Lạc là cơ chất thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin [35, 110]. Cây lạc là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới. Lạc được dùng rộng rãi trong chế biến thực phẩm, nông nghiệp, công nghiệp và là nguồn nguyên liệu cho các ngành phụ trợ khác. Việt Nam có sản lượng lạc xếp thứ 15 trong số 118 nước trồng lạc [62] và có sản lượng lạc xuất khẩu đứng thứ 10 trên thế giới [126]. Lạc cũng là một trong những loài cây lương thực quan trọng đối với đời sống và kinh tế của Việt Nam. Sau thu hoạch lạc được bảo quản và tích trữ để phục vụ cho sản xuất và chế biến các sản phẩm trong công nghiệp, nông nghiệp và thực phẩm quanh năm. Lạc có thể bị nhiễm nấm mốc và aflatoxin xuất phát từ: nhiễm trong quá trình trồng trọt, sơ chế và bảo quản. Các điều kiện ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh độc tố của nấm mốc bao gồm: nhiệt độ, độ ẩm, môi trường không khí và tình trạng nhiễm nấm mốc ban đầu của lạc. Ngoài ra, khả năng sinh aflatoxin trong lạc còn phụ thuộc vào loài nấm mốc bị nhiễm trong lạc. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu và khảo sát về tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc nhưng chưa có nghiên cứu nào định danh đến chủng cụ thể để từ đó tìm giải pháp bảo quản hạn chế sự phát triển và sinh độc tố của chủng phân lập 1 được. Đề tài này đã thực hiện nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin trong lạc, phân lập và định danh nấm mốc sinh độc tố, sau đó tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin, nghiên cứu một số giải pháp bảo quản nhằm giảm nhiễm aflatoxin trên lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc sau thu hoạch. Xuất phát từ những phân tích trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu mức độ nhiễm aflatoxin và đề xuất một số giải pháp công nghệ bảo quản lạc sau thu hoạch ở các tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam". 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trên lạc tại một số tỉnh miền Trung và Bắc Việt Nam. - Đề xuất được giải pháp công nghệ bảo quản lạc có hiệu quả ngăn ngừa nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc. 3. Nội dung nghiên cứu Để đánh giá được thực trạng và các yếu tố ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc, từ đó đề xuất quy trình bảo quản lạc có hiệu quả ngăn ngừa nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc, đề tài đã nghiên cứu các vấn đề liên quan có nội dung chính như sau: - Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc, aflatoxin trong lạc và một số yếu tố liên quan tại miền Bắc (Bắc Giang) và miền Trung (Thanh Hóa, Nghệ An). Phân lập chủng sinh độc tố aflatoxin từ lạc. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và sinh aflatoxin trên lạc của chủng nấm phân lập được. - Khảo nghiệm và đề xuất quy trình giải pháp bảo quản lạc có hiệu quả ngăn nhiễm aflatoxin. 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 4.1. Ý nghĩa khoa học - Qua các số liệu khảo sát và phân tích, đề tài đã đánh giá được thực trạng nhiễm nấm mốc và aflatoxin trong lạc ở 3 vùng trồng lạc: Nghệ An, Thanh Hóa và Bắc 2