Tài liệu Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ sâm dây (codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------------------- NGUYỄN ĐÌNH TRỌNG NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY (Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2015 1 BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM VÀ ĐÀO TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ---------------------- LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ SÂM DÂY (Codonopsis sp.) TRONG HỆ THÔNG BIOREACTOR Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 Học viên: Nguyễn Đình Trọng Hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2015 2 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá trın ̀ h nghiên cứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của PGS. TS. Chu Hoàng Hà cùng với cán bộ Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày trong luận văn này là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam đoan của mình trước hội đồng khoa ho ̣c. Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Đình Trọng 3 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lỏng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn, giúp đỡ tận tịnh tôi hoàn thành luận văn này: PGS. TS. Chu Hoàng Hà, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, Trưởng phòng Công nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài. TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học, người cô, người chị đã trực tiếp hướng dẫn, luôn theo sát thí nghiệm của tôi để đưa ra những lời khuyên bổ ích và kịp thời cho tôi ngay từ những ngày đầu tiên tôi bước vào phòng thí nghiệm. GS. TS. Lê Trần Bình, PGS. TS. Lê Văn Sơn, TS. Chu Nhật Huy, KS. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Nguyễn Phú Tâm và các cán bộ phòng Công nghệ tế bào thực vật đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về chuyên môn. Trong những năm học tập và nghiên cứu tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành của tập thể cán bộ phòng. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô giáo tại cơ sở Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập vừa qua. Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn này. Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Học viên Nguyễn Đình Trọng 4 MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ------------------------------------------------------------------------------------------------------ LỜI CẢM ƠN ------------------------------------------------------------------------------------------ MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------------------------------i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT -------------------------------------------------------------------- iii DANH MỤC BẢNG---------------------------------------------------------------------------------- iv DANH MỤC HÌNH ----------------------------------------------------------------------------------- v MỞ ĐẦU ------------------------------------------------------------------------------------------------ 1 1.1.Đặt vấn đề -----------------------------------------------------------------------------------------------------------1 1.2.Mục đích nghiên cứu--------------------------------------------------------------------------------------------2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát ------------------------------------------------------------------------------- 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể ----------------------------------------------------------------------------------- 2 1.3.Nội dung nghiên cứu --------------------------------------------------------------------------------------------3 1.4.Ý nghĩa khoa học -------------------------------------------------------------------------------------------------3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ---------------------------------------------------------- 4 1.1.Tổng quan về cây Sâm dây -----------------------------------------------------------------------------------4 1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý -------------------------------------------------------------------- 4 1.1.2. Phân loại------------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.3. Hình thái------------------------------------------------------------------------------------------- 4 1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây ----------------------------------------------------------- 5 1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây ------11 1.2.Nuôi cấy sinh khối rễ tơ – giải pháp tạo nguồn dược phẩm sạch phục vụ sức khoẻ cộng đồng ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 12 1.2.1. Giới thiệu về nuôi cấy nuôi cấy sinh khối tế bào -------------------------------------------12 1.2.2. Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phương pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật--------------------------------------------------------------------------------------------------------------13 1.2.3. Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật --------------------------------14 1.2.4. Nuôi cấy sinh khối rễ tơ------------------------------------------------------------------------17 1.2.5. Ứng dụng hệ thống bioreactor trong nuôi cấy sinh khối rễ tơ ----------------------------22 1.2.6. Ảnh hưởng của elicitor đến khả năng tích luỹ các chất thứ cấp --------------------------24 1.3.Một số phương pháp tách chiết, phương pháp định tính và định lượng saponin --26 1.3.1. Phương pháp tách chiết ------------------------------------------------------------------------26 1.3.2. Một số phương pháp định tính saponin ------------------------------------------------------27 1.3.3. Ứng dụng phương pháp quang phổ trong định lượng saponin tổng số------------------28 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU -------------------------- 29 2.1.Vật liệu nghiên cứu -------------------------------------------------------------------------------------------- 29 i Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 2.2.Thiết bị và hoá chất nghiên cứu-------------------------------------------------------------------------- 29 2.3.Phương pháp nghiên cứu ----------------------------------------------------------------------------------- 29 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật --------------------------------------------------29 2.3.2. Đánh giá các dòng chuyển gen bằng phương pháp PCR ----------------------------------30 2.3.3. Đánh giá khả năng tăng sinh của các dòng rễ tơ Sâm dây --------------------------------31 2.3.4. Xác định kích thước mẫu cấy phù hợp cho nuôi cấy --------------------------------------32 2.3.5. Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường thạch.--------32 2.3.6. Xác định loài môi trường lỏng thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ -----------------------------33 2.3.7. Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ chất khô trong rễ tơ Sâm dây--------------------------------------------------------------------------------------------------33 2.3.8. Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp --------------------------------------------34 2.3.9. Phương pháp nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor ------------------------34 2.3.10.Phương pháp tách chiết saponin từ sinh khối rễ tơ ---------------------------------------35 2.3.11.Phương pháp bán định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ ---------------35 2.3.12.Phương pháp tính toán ------------------------------------------------------------------------36 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN --------------------------------------------------- 37 3.1. Kiểm tra đánh giá các dòng rễ tơ chuyển gen bằng phương pháp PCR--------------- 37 3.2. Đánh giá tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây ----------------------------------- 39 3.3. Xác định kích thước mẫu phù hợp cho nuôi cấy ------------------------------------------------- 41 3.4.Xác định loại môi trường thích hợp cho nuôi cấy rễ tơ trên môi trường đặc -------- 42 3.5.Kết quả nuôi cấy rễ tơ trên các môi trường lỏng khác nhau -------------------------------- 43 3.6.Ảnh hưởng của salicylic acid (SA) lên sinh trưởng và tích luỹ hợp chất thứ cấp trong rễ tơ Sâm dây ------------------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.7.Lựa chọn mô hình nuôi cấy bioreactor phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất tại Viện Công nghệ sinh học ----------------------------------------------------------------------------------------- 47 3.8.Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các mô hình bioreactor ------------------------------- 49 3.9.Kết quả bán định lượng hàm lượng saponin tổng số trong sinh khối rễ tơ, so sánh với sâm tự nhiên ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 52 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ --------------------------------------------------- 55 1.1.Kết luận------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55 1.2.Kiến nghị ----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------------------- 56 ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT A. rhizogenes : Agobacterium rhizogenes A. tumefaciens : Agrobacterium tumefaciens Aux : Auxin B5 : Gamborg B5, 1968 bp : Base pair DNA : Desoxyribonucleic acid GusA : β-glucuronidase kp : Kilobase pair LB : Left border MS : Murashige and Skoog, 1962 MeOH : Methanol RB : Right border Ri-plasmid : Root induction plasmid Rol : Root locus SA : Salicylic acid SH : Schenk và Hildebrandt, 1972 sp : Species ss T-DNA : Single strain T-DNA vir : Virulence genes JA : Jasmonic acid WPM : McCown’s Woody Plant, 1981 iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Cấ u trúc hóa ho ̣c 7 saponin trong Codonopsis lanceolata ------------------- 6 Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B ------------------ 8 Bảng 1.3. Một số loài thực vật được nuôi cấy rễ tơ để thu hoạt chất sinh học ------ 20 Bảng 2.1. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu --------------------------------------- 30 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR nhân gen rolA, rolB, rolC--------------------- 31 Bảng 3.1. Sự phát triển của các đoạn rễ tơ sâm dây có kích thước khác nhau ------ 41 Bảng 3.2. Sự phát triển của rễ tơ sâm dây trên các loại môi trường khác nhau ----- 42 Bảng 3.3. So sánh thành phần của các môi trường cơ bản MS, B5, WPM, SH ----- 43 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của SA đến sự sinh trưởng của rễ tơ Sâm dây ----------------- 45 Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên các hệ thống bioreactor khác nhau sau 4 tuần nuôi cấy ------------------------------------------------------------------------------- 51 Bảng 3.6. Kích thước củ Sâm dây 1 -3 tuổi thu thập ở Kon Tum --------------------- 52 Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saponin tổng số ------------------------------- 53 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây Sâm dây ------------------------------------------------------------------------ 4 Hın ̀ h 1.2. Cấ u trúc hóa ho ̣c saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) ----------- 6 Hình 1.3. Cơ chế chuyển gen chung của Agrobacterium ------------------------------- 15 Hình 1.4. Các hệ thống rễ tơ Sâm dây được nuôi cấy tại Viện Công nghệ sinh học 19 Hình 1.5. Hệ thống bioreactor sủi bọt dạng cầu ----------------------------------------- 24 Hình 3.1. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen rolA, rolB, rolC bằng kỹ thuật PCR -------------------------------------------------------------------------------------------------- 38 Hình 3.2. Kết quả khảo sát tốc độ sinh trưởng của các dòng rễ tơ Sâm dây --------- 40 Hình 3.3. Sự phân nhánh và kéo dài của các mẫu rễ tơ sau 2 tuần nuôi cấy trên các môi trường khác nhau.----------------------------------------------------------------------- 42 Hình 3.4. Đường cong sinh trưởng của rễ tơ sâm dây trên các môi trường khác nhau -------------------------------------------------------------------------------------------------- 44 Hình 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của SA đến sinh trưởng rễ tơ Sâm dây ----- 46 Hình 3.6. Hệ thống bioreactor mà TS. Nguyển Hữu Hổ sử dụng tại Viện Sinh học nhiệt đới --------------------------------------------------------------------------------------- 48 Hình 3.7. Hệ thống bioreactor PGS. TS. Dương Tấn Nhựt sử dụng tại Viện Sinh học Tây Nguyên ----------------------------------------------------------------------------------- 48 Hình 3.8. Hệ thống bioreactor trong ngành công nghiệp dược phẩm ở Hàn Quốc - 48 Hình 3.9. Hệ thống bioreactor đang được sử dụng tại Viện Công nghệ sinh học --- 49 Hình 3.10. Rễ tơ thu được sau 4 tuần nuôi cấy trên hệ thống bioreactor 5 lít ------- 50 Hình 3.11. Các mẫu củ Sâm dây thu thập tại Kon Tum -------------------------------- 52 v Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Sâm dây hay Đẳng sâm có danh pháp khoa học là Codonopsis sp., một loài thực vật lâu năm thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Chúng có nguồn gốc từ khu vực Đông Bắc châu Á và bán đảo Triều Tiên. Rễ của đẳng sâm được sử dụng trong y học cổ truyền từ xa xưa với tác dụng bổ ngũ tạng, tăng sức dẻo dai, tăng cường khả năng miễn dịch cho cơ thể, có tác dụng bổ huyết, chống mệt mỏi, giảm stress. Trong sâm dây chứa các hoạt chất chủ yếu như saponin, polysaccharide, triterpen, steroid… Do có nhiều công dụng trong y dược nên sâm dây có nguy cơ bị khai thác quá mức làm giảm khả năng tái sinh và phát triển. Cây Sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quí hiếm và được đưa vào sách đỏ vào năm 1996 ( theo Sách đỏ Việt Nam – phần Thực vật, NXB KHTNCN, 2007). Những giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được trong và ngoài nước công nhận, do đó việc khai thác, sử dụng và quản lý bền vững nguồn tài nguyên này cần được quan tâm triệt để. Những năm gần đây, cùng với xu hướng chung trên thế giới, ở nước ta hướng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất các sản phẩm thứ cấp đã bắt đầu được quan tâm đầu tư phát triển. Tuy nhiên trong quá trình nuôi cấy tạo sinh khối tế bào thực vật để làm giảm hoặc mất tính biệt hoá ở các mô tế bào nuôi cấy cần bổ sung các chất điều hoà sinh trưởng vào trong môi trường nuôi cấy. Vấn đề này là một trong những trở ngại lớn nhất do tồn dư của các chất điều hoà sinh trưởng trong sinh khối tế bào nuôi cấy. Điều này đã ảnh hướng trực tiếp đến sản phẩm cũng như sức khoẻ người tiêu dùng. Việc này hoàn toàn có thể khắc phục trong nuôi cấy sinh khối từ rễ tơ. Rễ tơ là một loại bệnh xuất hiện ở thực vật bậc cao do sự xâm nhiễm của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes gây ra. Đặc biệt, rễ tơ có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường không có chứa chất điều hòa sinh trưởng. Do khả năng sinh trưởng nhanh, kỹ thuật nuôi cấy đơn giản kết hợp hệ thống bioreactor, rễ tơ 1 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng đã và đang được ứng dụng nhằm thu nhận các hợp chất thứ cấp từ các loài thực vật có giá trị dược liệu cao. Các dược chất của sâm dây chủ yếu được tích lũy ở rễ nên rất thích hợp cho việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy sinh khối rễ tơ. Hướng nghiên cứu này cho khả năng thu nhận lượng lớn sinh khối rễ sâm dây tạo nguồn nguyên liệu ốn định đáp ứng nhu cầu làm thuốc hay thực phẩm chức năng. Bên cạnh đó còn góp phần bảo tồn đa dạng sinh học của loài Sâm dây ngoài tự nhiên. Nuôi cấy rễ tơ trong hệ thống bioreactor gặp một số vấn đề đó là hình thái rễ tơ của các loài thực vật khác nhau là hoàn toàn khác nhau, đặc điểm như độ dày, độ dài, độ phân nhánh của rễ bị ảnh hưởng bởi các loài thực vật và các chủng A. rhizogenes sử dụng cho cảm ứng tạo rễ tơ. Ngoài ra, sự tăng trưởng tế bào và sản xuất chất chuyển hóa là không đồng nhất trong rễ tơ đã làm khó khăn trong việc tối ưu hóa hệ thống bioreactor. Xuất phát từ các ưu điểm trên của hệ thống nuôi cấy rễ tơ và những tác dụng dược lý quý của cây Sâm dây, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy sinh khối rễ tơ Sâm dây (Codonopsis sp.) trong hệ thống bioreactor”. Công trình này được thực hiện tại phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1.2. Mục đích nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu cơ sở khoa học và thực nghiệm của việc tạo sinh khối cây Sâm dây làm nguyên liệu sản xuất dược phẩm và thực phẩm chức năng bằng công nghệ nuôi cấy rễ tơ. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể: - Lựa chọn dòng rễ tơ sâm dây sinh trưởng và phát triển ổn định. - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây. - Nuôi cấy nhân sinh khỗi rễ tơ trên các hệ thống bioreactor. - Bước đầu định lượng hàm lượng saponin trong sinh khối rễ tơ so với dược liệu tự nhiên. 2 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng 1.3. Nội dung nghiên cứu - Phân tích các dòng rễ tơ bằng phương pháp PCR - Đánh giá sinh trưởng của các dòng rễ tơ - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường đặc - Tối ưu môi trường nuôi cấy rễ tơ sâm dây trên môi trường lỏng - Nuôi cấy sinh khối rễ tơ trong hệ thống bioreactor - Tách chiết hoạt chất - Bước đầu định lượng saponin tổng số. 1.4. Ý nghĩa khoa học Làm cơ sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ cây Sâm dây cho mục đích làm nguyên liệu dược phẩm và thực phẩm chức năng. 3 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tổng quan về cây Sâm dây 1.1.1. Giới thiệu về phân bố địa lý Cây Sâm dây hay Đảng sâm có tên khoa học là Codonopsis sp. là loài cây dược liệu sử dụng củ. Cây thân leo, sống lâu năm, thường phân bố tại các vùng núi cao có khí hậu mát mẻ quanh năm. Cây sâm dây thuộc họ Hoa chuông (Campanulaceae). Đảng sâm phân bố nhiều ở vùng Đông Bắc Á. Ở Việt Nam, trong thời gian 1961-1985 viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm ở 14 tỉnh vùng núi phía Bắc; còn ở phía Nam chỉ thấy xuất hiện ở vùng Tây Nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng, Lâm Đồng. 1.1.2. Phân loại Giới : Plantae Phân giới : Tracheobionta Nhóm lớn : Spermatophyta Nhóm : Magnoliopsida Bộ : Campanulales Họ : Campanulaceae Loài : Codonopsis sp. Hình 1.1. Cây Sâm dây (Nguồn: http://www.rolv.no) 1.1.3. Hình thái Sâm dây là cây thảo sống lâu năm, có xu hướng leo bằng thân quấn, phân nhánh nhiều, phía dưới hơi có lông, phía ngọn nhẵn (Hình 1.1). Toàn thân có mủ trắng. Lá mọc đối, ít khi mọc so le; gốc lá hình tim; đầu lá nhọn, phiến lá mỏng hình trứng rộng, dài 3 - 8 cm, rộng 2 – 4 cm; mép nguyên lượn sóng hoặc hơi 4 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng khía răng cưa; mặt trên màu lục nhạt; mặt dưới màu trắng xám, nhẵn hoặc có lông rải rác. Hoa mọc riêng ở kẽ lá. Có cuống dài 2 – 6 cm. Đài có 5 phiến hẹp; tràng hình chuông, màu trắng hoặc hơi vàng, có vân tím ở họng; chia 5 thuỳ, nhị 5, chỉ nhị hơi dẹt; bao phấn dính gốc; bầu hình cầu có 5 ô. Quả nang hình cầu, có 5 cạnh mờ, đầu bẹt, phía trên có một núm nhỏ hình nón, đường kính 1 – 2 cm, có đài tồn tại; khi chín màu tím hoặc đỏ; hạt nhiều, màu vàng nhạt, bóng. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1 – 1,7 cm. Đầu rễ phình to, trên có nhiều vết sẹo lồi của thân cũ, phía dưới thường phân nhánh; mặt ngoài màu vàng nhạt, khi khô màu vàng xám (Đỗ Tất Lợi, 2005). 1.1.4. Tác dụng dược lý của cây Sâm dây Tác dụng dược lý của cây Sâm dây đã được công bố rộng rãi trên thế giới thông qua nhiều đề tài nghiên cứu khoa học về điều trị bệnh tiểu đường, khả năng tăng cường sức khoẻ, tác dụng với hệ tiêu hoá, tác dụng với hệ tim mạch, tác dụng đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hoà huyết áp, chống mệt mỏi, chống oxy hoá, kháng ung thư, kháng khuẩn và tăng cường hệ thống miễn dịch (Ueda et al., 2002; Li et al., 2004; Chan et al., 2009; Wang et al., 1996; Luo et al., 2007; Liu et al., 1988; Yongxu et al., 2008; He et al., 2015; He et al., 2014). Các dược tính của Codonopsis sp. có thể là do các thành phần hợp chất có trong cây có khả năng cải thiện sức khoẻ con người, bao gồm: cacbohydrates, glycosides, steroids, alkaloids, terpenes… Theo C. G. Fu và cs (2007) ở loài Codonopsis lanceolata có 6 flavonoids, 4 alkaloids, 12 triterpenes và sterol, 10 loại hợp chất dễ bay hơi, 12 nguyên tố vi lượng và 17 acid amin (Fu et al., 2007). Dịch chiết Codonopsis sp. có thể ngăn ngừa và bảo vệ tế bào gan chống lại tổn thương do rượu (Bai et al., 2008; Zhang et al., 2007), và có tác dụng chống đột biến, chống oxy hoá, chống lão hoá, cải thiện khả năng miễn dịch, chống mệt mỏi, buồn ngủ, giảm đau , hạ huyết áp… (Peng et al., 2009). 5 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Thành phầ n saponin đã làm nên công du ̣ng chın ́ h của Đảng sâm cũng như các vi ̣thuố c sâm khác. Theo Ichikawa và cs (2009) khi phân tı́ch HPLC pha đảo kế t hơ ̣p đầ u dò khố i phổ ion hóa tia điê ̣n phát hiê ̣n trong rễ Codonopsis lanceolata chứa 7 saponin gồ m: lancemaside A, lancemaside B, lancemaside C, lancemaside E, lancemaside G, Foetidissimoside A và aster saponin Hb. Hàm lươ ̣ng lancemaside A thay đổ i từ 2,65 đế n 3,64 mg/g rễ khô đố i với mẫu Codonopsis Hàn Quố c, nhưng chı̉ đa ̣t 0,101 mg/g đố i với mẫu có nguồ n gố c từ Nhâ ̣t Bản (Ichikawa et al., 2009) Hın ̀ h 1.2. Cấ u trúc hóa học saponin trong sâm dây (Ichikawa et al., 2009) Bảng 1.1. Cấ u trúc hóa học 7 saponin trong Codonopsis lanceolata (Ichikawa et al., 2009) Hơ ̣p chất Aglycone R1 R2 Lancemaside A I β-GlcA β–Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara Lancemaside B I β-GlcA β-Xyl-(13)-β–Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13)-Glc-β Lancemaside C I β-GlcA β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-αAra-(13)-Glc-β Lancemaside E I βGlc(13)β-GlcA β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13) Lancemaside G II β-GlcA β-Xyl-(13)-β-Xyl-(14)-αRha-(12)-α-Ara-(13) Foetidissimoside A I β-GlcA β-Xyl-(14)-α-Rha-(12)-α-Ara aster saponin Hb I β-GlcA α-Rha-(12)-α-Ara 6 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Joh và cs (2010) cho thấy Lancemaside A có khả năng tăng tính kháng viêm gây ra bởi các lipopolysaccharide ở trên chuột thử nghiệm. Lancemaside A làm giảm sự hoạt động của các tác nhân gây viêm, bên cạnh đó, nhóm tác giả cho thấy hoạt chất này có khả năng kháng viêm dựa trên cơ chế kết hợp với tác nhân gây viêm là lipopoly saccharide và TLR4 (một protein tham gia vào quá trình phát hiện tác nhân gây bệnh ở người và động vật) (Joh et al., 2010). Kim và cs (2014) cho thấy Lancemaside A tách chiết từ rễ cây Codocopsis lanceolata có khả năng điều khiển cơ chế đáp ứng viêm gián tiếp qua bạch cầu và đại thực bào (Kim et al., 2014). Ngoài khả năng, tăng khả năng kháng viêm ở động vật thử nghiệm, năm 2013 Hyam và cs cho thấy Lancemaside A có khả năng gây ức chế đối với TNBS- một tác nhân gây viêm ruột kết ở chuột thí nghiệm (Hyam et al., 2013). Bên cạnh các saponin, rễ Codonopsis sp. còn chứa các polysaccharide có dược tính quý trong điều trị một số bệnh ở người, tính gây độc đối với các khối u, tăng cường khả năng miễn dịch ở người. Hoạt động chống khối u: Polysaccharide từ C. pilosula có thể ức chế sự hoạt động của các tế bào ung thư dạ dày người và các tế bào ung thư gan (Yang et al., 2011). Một pectic polysaccharide ở rễ Codonopsis sp. có khả năng gây độc với tế bào ung thư phổi người (Yang et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro sử dụng tế bào HO- 8910 (ung thư buồng trứng) cho thấy một polysaccharide có tính axit có nguồn gốc từ rễ C. pilosula có thể làm giảm sự xâm nhập và di căn của các tế bào khối u thông qua việc giảm biểu hiện CD44 (Xin et al., 2012). Khả năng gây ức chế sự phát triển khối u đã được ghi nhận ở những con chuột được tiêm tế bào khối u và uống 50 hoặc 100mg/kg một trong hai polysaccharides của C. pilosula sẽ làm ức chế khoảng 22,86 - 56,73 % sự phát triển của khối u (Xu et al., 2012). 7 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Bảng 1.2. Khả năng ức chế khối u ở chuột của CPPW1 và CPPW1B (Xu et al., 2012) Tỷ lệ ức chế (%) Trọng lượng lá lách tương đối (mg/g) Trọng lượng tuyến ức tương đối (mg/g) 6,01 2,16 TT Trọng lượng khối u (g) NC 2,45 ± 0,24 PC 0,89b 63,67 5,12 1,90 CL 1,64b 33,06 7,34b 2,45a CH 1,06b 56,73 8,46b 2,61b CBL 1,89a 22,86 6,14 2,24 CBH 1,56b 36,33 6,35 2,31 NC: Đối chứng âm; PC: đối chứng dương; CL: CPPW1 (50 mg/kg); CH: CPPW1 (100 mg/kg); CBL: CPPW1B (50 mg/kg); CBH: CPPW1B (100 mg/kg); aP<0,05 và bP<0,01. Tác dụng trên hệ miễn dịch, chống viêm: Zhang và Wang thấy rằng 6 ngày uống polysaccharide (800 mg/kg/ngày) từ C. pilosula có tác dụng trên chuột suy giảm miễn dịch gây ra bởi cyclophosphamide, bao gồm tăng cường hoạt động các tuyến ức, lách và các hoạt động thực bào của các đại thực bào phúc mạc và phục hồi hoạt động của α - naphthyl - acetate esterase trong tế bào lympho ngoại vi. Trong một nghiên cứu miễn dịch in vitro, một polysaccharide tan trong nước ở liều 50, 100 và 200 mg/mL có thể tăng sinh tế bào lympho kích thích bởi concanavalin A- hoặc lipopolysaccharide (LPS) (Sun, 2009). Ngoài ra, chiết xuất methanol của C. pilosula gây ức chế cảm ứng nitric oxide synthase và oxy hóa protein trong quá trình kích thích LPS ở dòng tế bào đại thực bào chuột RAW 264.7 (Yoo et al., 2013). Một nghiên cứu in vitro khác cho thấy, một polysaccharide từ C. pilosula có thể kích thích sự biệt hóa của tế bào lách trong chống viêm kích thích bởi LPS (Yongxu et al., 2008). Vai trò chống viêm còn được chứng minh khi một polysaccharide từ C. pilosula biểu hiện tăng sản xuất kháng nguyên khi dùng chung với một loại vắc-xin, cho thấy polysaccharide này có thể được sử dụng như một chất bổ trợ (Sun, 2009). Một nghiên cứu đánh giá 8 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng hoạt động của các đại thực bào thực bào cho thấy một polysaccharide có khả năng tăng hoạt động thực bào, sau khi uống 50 hoặc 100mg/kg dịch chiết C. pilosula mỗi ngày, có thể làm tăng khả năng thực bào tương ứng là 15,6% và 28,7% (Xu et al., 2012). Trong kết quả nghiên cứu về hiệu quả tác dụng chống oxi hóa của dịch chiết các cây Panax quinquefolium, Panax notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis của nhóm tác giả T.B. Ng và cs (2004) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis pilosula và Glehnia littoralis có tác dụng cao nhất trong việc ức chế hiện tượng huyết tán. Các kết quả cũng cho thấy nếu chỉ quan tâm đến hoạt động chống oxi hóa thì các cây Panax notoginseng, Codonopsis pilosula, Pseudostellaria heterophylla và Glehnia littoralis là các đối tượng thay thế rẻ hơn cây nhân sâm. Nghiên cứu của Chen và cs (2013) cho thấy dịch chiết từ cây Codonopsis javanica có khả năng làm giảm dần hiện tượng insulin cao và quá trình peroxide hóa ở những con chuột kháng insulin được nuôi bằng fructose. Yang và cs (2013), đã tách chiết và xác định được cấu trúc một pectic polysaccharide (CPP1b) từ cây Codonopsis pinocuda. Theo nghiên cứu này, CPP1b được tách chiết bằng phương pháp sắc kí cột cellulose DEAE, phân tử này có khối lượng khoảng 1,45x 105 Da. Pectic CPP1b có khả năng kháng khối u do pectic này thể hiện tính gây độc với các tế bào ung thư phổi A549 (Yang et al., 2013). Khi thử nghiệm đánh giá hiệu quả chống lại bệnh béo phì của cây Codonopsis lanceolata ở những con chuột bị béo phì. Các kết quả nghiên cứu gợi ý rằng cây Codonopsis lanceolata có một tiềm năng lớn để ứng dụng trong việc chống lại bệnh béo phì vì nó giảm sự hình thành và tích lũy quá mức các chất béo. Cây Codonopsis lanceolata có tiềm năng là thực phẩm chức năng có thể sử dụng trong kiểm soát và điều trị bệnh béo phì (Choi et al., 2013) Các nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính của các loài Codonopsis được thực hiện chủ yếu trên đối tượng rễ củ tự nhiên. Hiện chỉ có 9 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng một số ít nghiên cứu thành phần hoạt chất trên đối tượng là sinh khối tế bào Codonopsis sp. Trong nghiên cứu sự cảm ứng tạo rễ bất định và tách chiết chất Codonopside từ Codonopsis lanceolata của Krishna và cs (2007). Theo nhóm tác giả này việc tạo rễ trực tiếp từ mẫu lá của cây Codonopsis lanceolata trên môi trường MS với 30 g/L sucrose và các nồng độ khác nhau của các chất điều hòa sinh trưởng IAA, IBA thì môi trường cơ bản với 3 mg/L IBA đạt được kết quả mọc rễ tối đa là 100%. Các rễ này tiếp tục được nuôi trên các môi trường lỏng B5, SH, MS để thiết lập môi trường nuôi cấy rễ tối ưu. Kết quả là môi trường B5 với nồng độ IBA 0,5 mg/L có hiệu quả lớn nhất đối với sự sinh trưởng của rễ bất định trong bình nuôi cấy 250 ml cũng như nuôi cấy bioreactor. Trọng lượng rễ tươi là 6,19 gam tương đương với 0,81 gam trọng lượng khô ở bình nuôi cấy thể tích 250 ml, ở bình nuôi cấy bioreactor thể tích 2 lít là 48,56 gam trọng lượng tươi và 8,26 trọng lượng khô, sau thời gian nuôi cấy một tháng. Các rễ thu được trong điều kiên nuôi cấy này cũng dày hơn, cứng cáp hơn rễ tơ và phát triển được trong môi trường có sục khí mạnh. Thành phần saponin ở các rễ nuôi cấy này được tách chiết và phân tích bằng dự liệu phổ, dữ liệu này khớp với các dữ liệu đã được công bố trước đó. Nhóm tác giả cũng đã phát triển được một phương pháp đơn giản và hiệu quả để sản xuất được các Codonopside từ rễ bất định của Codonopsis lanceolata (Krishna et al., 2007). Codonopside có tác dụng cảm ứng chết theo chương trình của các tế bào bạch cầu hạt non trong điều trị bệnh ung thư máu ở người (Lee et al., 2005). Do đó, việc nuôi cấy rễ tơ cây Codonopsis lanceolata trong bioreactor có thể coi là nguồn nguyên liệu thay thế cho việc tách chiết hoạt chất sinh học có giá trị cao. Theo các nghiên cứu khoa học ở Việt Nam, sâm dây có tác dụng tăng cường sức khoẻ, chống mệt mỏi và tăng sự thích nghi của động vật thử nghiệm trong môi trường nhiệt độ cao. Đối với hệ tiêu hóa, sâm dây có tác dụng tăng cường trương lực của hồi tràng và cường độ co bóp càng tăng nếu tăng nồng độ thuốc. 10 Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Đình Trọng Đối với hệ tim mạch, sâm dây làm tăng cường độ co bóp của tim, tăng lượng máu cho não, chân và nội tạng, còn đối với máu và hệ thống máu: sâm dây có tác dụng làm tăng số lượng hồng cầu, huyết sắc tố, làm giảm số lượng bạch cầu. Ngoài ra, sâm dây còn có tác dụng hạ huyết áp, tăng cường miễn dịch của cơ thể, có tác dụng kháng viêm, hóa đàm, giảm ho, kháng khuẩn... Công trình “Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của vị thuốc Đảng sâm Việt Nam” của Hoàng Minh Chung và cs (2002) là nghiên cứu lần đầu tiên công bố các thành phần hóa học của cây Đảng sâm Việt Nam. Bằng một số phương pháp định tính và định lượng trên các mẫu củ sâm tươi và cao sâm, nhóm tác giả này đã đưa ra một số kết luận về đặc điểm thực vật của cây sâm dây mọc ở Sapa; các thành phần có trong rễ sâm dây khô và tươi: đường khử, acid amin, chất béo và saponin; thành phần và hàm lượng của các loại acid amin có trong rễ sâm dây. Nhóm tác giả này cũng đã công bố kết quả những nghiên cứu về hợp chất saponin có trong sâm dây. Loại saponin chủ yếu là saponin triterpenoid, hàm lượng saponin vào khoảng 3,12 ± 0,08 %. Các nghiên cứu trong nước trên cây Sâm dây còn rất hạn chế, mới chỉ dừng lại ở phân tích thành phần hóa học, các tác dụng dược lý và nhân nhanh giống cây sâm dây bằng phương pháp nuôi cấy mô. 1.1.5. Tính cấp thiết của việc nghiên cứu, bảo tồn và sản xuất bền vững cây Sâm dây Do giá trị y dược quý của cây Sâm dây hiện nay đã được nhiều người biết đến và giá trị kinh tế cao nên sâm dây bị khai thác quá mức làm giảm khả năng tái sinh và phát triển của cây, dẫn đến cạn kiệt và có nguy cơ tuyệt chủng. Cây sâm dây đã được đưa vào chương trình bảo tồn các loài cây quý hiếm ở Việt Nam. Trước tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị của cây Sâm dây ở Việt Nam, phân tích dược tính để đưa ra những hướng dẫn chiết xuất, sử dụng tốt nhất phục vụ sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh 11