Tài liệu Nghiên cứu quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ vẹm xanh

i LỜI CẢM ƠN ngoài sự nỗ lực học tập, rèn luyện của bả tập thể nhận đƣợc giúp đỡ của nhiều cá nhân và hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất đến: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại học Nha Trang. Ban chủ nhiệ . Tiến sĩ Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Quý thầy cô quản lý phòng thí nghiệm công nghệ chế biến, hóa sinh - vi sinh, công nghệ thực phẩm và công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt quá trình học tập cũng nhƣ hoàn thành đồ án tốt nghiệp này. Sinh viên Nguyễn Thị u ii LỜI CẢM ƠN................................................................................................................i ................................................................................................................... ii ................................................................................................. IV .................................................................................................... V DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .......................................................................... VI LỜI NÓI ĐẦU ..............................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................................................2 1.1.Tổng quan về vẹm xanh .........................................................................................2 1.1.1.Giới thiệu chung .............................................................................................2 1.1.2.Phân bố .............................................................................................................3 1.1.3.Thành phần hóa học và thành phần dinh dƣỡng của vẹm xanh ......................3 1.1.4.Tình hình nuôi nhuyễn thể ...............................................................................4 1 ất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại Việt Nam ...........................5 1.2.Tổng quan về enzyme ............................................................................................8 1.2.1.Định nghĩa ........................................................................................................8 1.2.2.Phân loại enzyme protease ..............................................................................8 1.2.3.Cơ chế xúc tác của enzyme .............................................................................9 1.2.4.Ứng dụng của enzyme protease trong công nghiệp ......................................10 ................................................................................................11 .........................................................................................11 .........................................................................................12 1.3.3.Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme trong quá trình thủy phân . ...................................................................................................................13 1.3.4. Sản phẩm thủy phân.....................................................................................14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................17 2.1.Đối tƣợng nghiên cứu...........................................................................................17 2.1.1.Vẹm xanh ......................................................................................................17 iii 2.1.2.Enzyme ...........................................................................................................17 2.2.Phƣơng pháp nghiên cứu......................................................................................18 2.2.1.Xác định thành phần hóa học của vẹm xanh .................................................18 2.2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến sản xuất sản phẩm thủy phân ................................20 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật trong quá trình thủy phân .. ...................................................................................................................21 2.2.4.Các phƣơng pháp phân tích ...........................................................................28 2.2.5.Phƣơng pháp xử lý số liệu .............................................................................29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................30 3.1.Kết quả xác định thành phần hóa học của Vẹm xanh..........................................30 3.2.Kết quả xác định các thông số kỹ thuậ ...............................................30 3.2.1.Kết quả xác định tỷ lệ enzyme Protamex so với nguyên liệu .......................30 3.2.2.Kết quả xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme so với nguyên liệu .................32 3.2.3.Kết quả xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp.............................................34 3.2.4.Kết quả xác định thời gian thủy phân thích hợp ...........................................36 3.3.Đề xuất quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân ..................................................39 3.3.1.Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân từ ............................39 ất lƣợng của sản phẩm thủy phân từ xanh ..........................................................................................................................42 3.4.1Khối lƣợng các sản phẩm thu đƣợc từ quá trình thủy phân ...........................42 3.4.2Chất lƣợng của dịch protein thủy phân ..........................................................43 3.4.3.Chất lƣợng của bột protein hòa tan ...............................................................44 3.4.4.Chất lƣợng của bột protein không tan ...........................................................47 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ........................................................................51 KẾT LUẬN ................................................................................................................51 ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ....................................................................................................51 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................53 PHỤ LỤC ...................................................................................................................54 iv Bả ỡng của Vẹm xanh ......................................................4 Bảng 1.2. Tình hình xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việ năm 2012. .....................................................................................................................7 Bảng 2.1. Điều kiện hoạt động tối thích của enzyme FlavourzymeTM. ....................18 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Protamex thích hợp. ..................23 Bảng 3.1. Thành phần hóa học củ ........................................................30 Bảng 3.2. Chất lƣợng cảm quan dịch protein thủy phân. ..........................................43 Bảng 3.3. Các chỉ tiêu hóa học của dịch protein thủy phân. .....................................44 Bảng 3.4. Chất lƣợng cảm quan bột protein hòa tan. ................................................44 Bảng 3.5. Các chỉ tiêu hóa học của bột protein hòa tan. ...........................................45 Bảng 3.6. Thành phần axit amin của bột protein hòa tan. .........................................46 Bảng 3.7. Chất lƣợng cảm quan bột protein không tan. ............................................47 Bảng 3.8. Các chỉ tiêu hóa học của bột protein không tan. .......................................48 Bảng 3.9. Thành phần axit amin của bột protein không tan. .....................................49 v ....................................................................................................2 Hình 2.2. Xác định thành phần hóa học của Vẹm xanh. ..........................................19 ủy phân protein từ Vẹm xanh. ...20 Hình 2.5. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme thích hợp. ............25 Hình 2.6. Bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp. ........................26 Hình 2.7. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp. .......................28 Hình 3.1. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến hàm lƣợng Nitơ trong dịch protein thủy phân. .......................................................................................................31 Hình 3.2. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Protamex đến tỷ lệ Naa/Nts trong dịch protein thủy phân. .......................................................................................................31 Hình 3.3. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme đến hàm lƣợng Nitơ trong dịch protein thủy phân. .......................................................................................................33 Hình 3.4. Ảnh hƣởng của tỷ lệ enzyme Flavourzyme đến tỷ lệ Naa/Nts trong dịch protein thủy phân. .......................................................................................................33 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lƣợng Nitơ trong dịch protein thủy phân. ...................................................................................................................35 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân đến tỷ lệ Naa/Nts trong dịch protein thủy phân. ...................................................................................................................35 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hàm lƣợng Nitơ trong dịch protein thủy phân. .......................................................................................................37 Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến tỷ lệ Naa/Nts trong dịch protein thủy phân. ...................................................................................................................37 Hình 3.9. Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân từ Vẹm xanh. ....................39 Hình 3.10. Bể ổn nhiệt. ..............................................................................................40 Hình 3.11. Dịch thủy phân sau khi bất hoạt enzyme. ................................................40 Hình 3.12. Máy ly tâm thể tích lớn. ...........................................................................41 Hình 3.13. Khối lƣợng các sản phẩm thu đƣợc từ quá trình thủy phân. ...................42 Hình 3.14. Dịch protein thủy phân.............................................................................43 Hình 3.15. Bột protein hòa tan. ..................................................................................44 Hình 3.16. Bột protein không tan...............................................................................47 vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT STT: Số thứ tự N/NL: Nƣớc trên nguyên liệu tg: Thời gian toC: Nhiệt độ g: Gam E: Enzyme En.Protamex/NL: Enzyme Protamex so với nguyên liệu En. Flavourzyme/NL: Enzyme Flavourzyme so với nguyên liệu opt: Optimal Epro/NLopt: Enzyme Protamex tối thích so với nguyên liệu E/NLopt: Enzyme tối thích so với nguyên liệu toopt: Nhiệt độ tối thích L: Lit Nts: Nitơ tổng số Naa: Nitơ axit amin Naa/Nts: Nitơ axit amin trên nitơ tổng số 1 LỜI NÓI ĐẦU Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển không ngừng của ngành công nghiệp chế biến thủy sản, công nghệ thủy phân bằng enzyme ngày càng phát triển. Là do: nguồn phế liệu tạo ra từ ngành chế biến thủy sản rất dồi dào, chiếm một tỷ lệ rất cao. Chúng có nguy cơ góp phần trực tiếp gây ô nhiễm môi trƣờng nếu chúng ta không có những biện pháp khắc phục kịp thời. Hiện nay, sản xuất các sản phẩm thủy phân có ý nghĩa kinh tế rất to lớn. Chúng tận dụng đƣợc nguồn phế liệu và các loài thủy sản kém giá trị tạo nên các sản phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao, có hàm lƣợng đạm dễ tiêu hóa cao cung cấp cho các loài động vật, với mục đích phát triển ngành chăn nuôi, tạo ra các sản phẩm thực phẩm cần thiết cho con ngƣời. Ngoài ra, ở các nƣớc có ngành công nghiệp phát triển công nghệ sản phẩm thủy phân đƣợc chú trọng, bằng việc tạo ra các loại bột đạm thực phẩm bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm dành cho con ngƣời nhƣ: pate, xúc xích, chả, giò, các loại bánh, các loại nƣớc uống… Với mục đích không ngừng tìm kiếm ra các loại sản phẩm thủy phân giàu protein cung cấp cho con ngƣời, dƣới sự hƣớng dẫn của TS.Nguyễn Thị Mỹ Hƣơng, tôi thực hiện đề tài:”Nghiên cứu quy trình sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ Vẹm xanh”. 2 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vẹm xanh 1.1.1. Giới thiệu chung [14] 1.1. . Tên tiếng Anh: Green mussel Tên khoa học: Perna Viridis, Mytilus spp., Modiolus spp. Nguồn nguyên liệu: khai thác, nuôi Mùa vụ khai thác: tháng 4 – 5, tháng 9 - 11 Vùng khai thác: vùng biển miền Bắc – Trung - Nam Ngƣ cụ khai thác: lƣới cào, xúc tay Kích thƣớc khai thác: 150 – 65 – 40mm Vẹm xanh là loại nhuyễn thể hai mảnh vỏ. Vỏ ọn t vỏ Trong m 3 -7 - 4 cm. C xanh xanh 1.1.2. Phân bố Vẹm – Indone xanh Hả ả ừa Thiên Huế ị ận, Kiên Giang (Hà Tiên, Phú Quốc) [8]. xanh – 30o/oo [14]. 1.1.3. Thành phần hóa học và thành phần dinh dƣỡng của vẹm xanh 1.1.3.1. Thành phần hóa học của vẹm xanh Vẹm xanh (Perna Viridis) là loài động vật thân mềm giàu protein, các loại khoáng chất sắt, kẽm, phospho… Ngoài ra, trong cơ thịt của chúng chứa hàm lƣợng axit béo omega–3 cao, hàm lƣợng lipit thấp và một số vitamin nhóm B rất cần thiết cho cơ thể [10]. 4 Theo phân tích thành phần dinh dƣỡng, trong thịt Vẹm xanh chứa 53,5% protein, 17,6% glucid, 8,6% chất tro [11]. 1.1.3.2. Thành phần dinh dƣỡng của vẹm xanh Vẹm xanh là loại thực phẩm có giá trị cao về mặt dinh dƣỡng và kinh tế. Thành phần protein của vẹm xanh có chứa gần nhƣ đầy đủ các axit amin không thay thế. Hàm lƣợng lipit chiếm tỷ lệ nhỏ, nhƣng trong chúng lại có hàm lƣợng và thành phần các axit không no, đặc biệt các axit béo thuộc Omega-3 rất cao, rất phù hợp cho ngƣời bị bệnh tim mạch. Bảng 1.1. dinh dƣỡng của Vẹm xanh [14] Thành phần dinh dƣỡng trong 100 g thực phẩm ăn đƣợc Thành phần chính Năng lƣợng Prôtein Kcal 53 Lipit Glucid 0,9 2 G 85,4 9,3 1.1.4. Tình hình nuôi nhuyễn thể 1.1.4.1. Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ trên thế giới [9] Theo FAO (2010) cho thấy: tổng sản lƣợng và giá trị sản lƣợng nhuyễn thể nuôi thế giới giai đoạn 1998-2008 tăng, với tốc độ bình quân 5,5%/năm về sản lƣợng và 6,5%/năm về giá trị là thấp hơn so với tốc độ tăng chung hằng năm của các loại thủy sản nuôi trên thế giới. Nếu so với sản lƣợng nuôi trồng thủy sản thế giới thì sản lƣợng nuôi năm 1998 chiếm 23,3%, năm 2003 là 22,6% và năm 2008 là 19,2%. Tuy nhiên, giá trị thì chiếm tỷ lệ thấp hơn, năm 1998 (16,9%), năm 2003 (16,1%) và năm 2008 (12,5%). Theo FAO (2010), mƣời quốc gia dẫn đầu về sản lƣợng nhuyễn thể nuôi giai đoạn 1998-2008 chủ yếu là các nƣớc nhƣ: Việt Nam, Trung Quốc, Mỹ, Thái Lan, Tây Ban Nha, New Zealand, Hàn Quốc, Nhật, Pháp và Chilê, chiếm 64% tổng sản lƣợng và 64,2% tổng giá trị. 5 Nhìn chung, sản phẩm nhuyễn thể ngày càng đƣợc ngƣời tiêu dùng ƣa chuộng và đƣợc thị trƣờng các nƣớc phát triển chú ý. Tuy nhiên, có rất nhiều nƣớc tham vọng sẽ phát triển sản xuất và xuất khẩu mặt hàng này, đây cũng là một thách thức lớn hiện nay trong việc xây dựng kế hoạch phát triển ngành hàng. 1.1.4.2. Tình hình nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại Việt Nam Nghề nuôi nhuyễn thể hai mảnh vỏ ở Việt Nam đã có cách đây khá lâu, tập trung chủ yếu ở các địa phƣơng ven biển nhƣ đầm Lăng Cô, đầm Nha Phu (Khánh Hòa)… - Khai thác: tổng sản lƣợng khai thác tự nhiên ở biển và ven biển các loài nhuyễn thể có vỏ thuộc lớp hai chân bụng và nhuyễn thể hai mảnh vỏ ƣớc đạt 300.000 – 350.000 tấn/năm [3]. - Nuôi: theo FAO (2010), trong 10 nƣớc dẫn đầu thế giới về sản lƣợng nuôi nhuyễn thể thì Việt Nam đứng thứ 8 nhƣng so về tốc độ tăng trƣởng bình quân hằng năm thì Việt Nam là nƣớc có tốc độ tăng trƣởng cao nhất (24,9%/năm). Năm 1998, sản lƣợng nhuyễn thể nuôi của Việt Nam chỉ đạt 21,3 nghìn tấn đến năm 2003 đạt đƣợc 100 nghìn tấn và năm 2008 đạt 170 nghìn tấn, với nhiều đối tƣợng khác nhau nhƣ: hàu, nghêu, trai ngọc, sò huyết, ốc hƣơng, bào ngƣ vành tai, vẹm xanh và tu hài. Hình thức nuôi cũng khá đa dạng: nuôi bãi triều, nuôi lồng bè, nuôi dàn. Nguồn con nuôi chủ yếu vẫn dựa vào tự nhiên. Nhƣng gần đây đã sản xuất nhân tạo thành công giống của một số loài nhƣ trai ngọc, điệp, bào ngƣ, vẹm xanh… [3] Trong các loài nhuyễn thể nuôi ở Việt Nam hiện nay, Vẹm xanh là một đối tƣợng nuôi đang phát triển mạnh và đƣợc nhiều địa phƣơng ven biển đặc biệt quan tâm. Nguyên nhân là do V V n , 1.1.5. . xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ tại Việt Nam Tại Việt Nam, tình hình xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ chủ yếu sang các thị trƣờng Mỹ, Canađa. Đây là hai thị trƣờng có mức tăng trƣởng ổn định và khả 6 quan nhất của nhuyễn thể hai mảnh vỏ Việt Nam. Tính đến hết tháng 9, Mỹ tăng hơn 29% và Canađa tăng hơn 30% về giá trị so với cùng kỳ năm 2010. Liên tiếp trong 9 tháng qua, Mỹ tăng nhập khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ từ Việt Nam từ 2 150% cả khối lƣợng và giá trị so với cùng kỳ năm trƣớc. Còn Canađa, thay thế Thụy Sỹ trong danh sách các thị trƣờng nhập khẩu lớn, tháng 4/2011, thị trƣờng này làm "sáng bừng" cả bức tranh XK nhuyễn thể Việt Nam khi tăng đến hơn 1.800% về khối lƣợng và gần 1.100% về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái. Điều này đã đƣa kết quả XK nhuyễn thể hai mảnh vỏ sang Canađa trong 9 tháng đầu năm tăng 30,3% so với cùng kỳ năm ngoái [13]. Nửa đầu tháng 1/2012, nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam đã có mặt tại 21 thị trƣờng khác nhau trên thế giới. EU là thị trƣờng nhập khẩu lớn nhất, chiếm 72,3% tổng giá trị. Nếu tốc độ xuất khẩu sang EU duy trì nhƣ hiện nay, có thể năm nay xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ sang thị trƣờng EU sẽ khả quan hơn năm trƣớc [13]. 7 Bảng 1.2. Tình hình xuất khẩu nhuyễn thể hai mảnh vỏ của Việt Nam 4 [9]. STT Thị trƣờng EU 1 Bồ Đào Nha 2 Tây Ban Nha 3 Pháp 4 Italy 5 Bỉ 6 Anh 7 Hà Lan 8 Đức 9 Đan Mạch 10 Romania 11 Hy Lạp 12 13 14 ASEAN 15 Singapore 16 Malaysia 17 Thái Lan Các TT khác 18 Hàn Quốc 19 Australia 20 Đài Loan 21 Canada 22 Thụy Sĩ 23 Israel 24 New Zealand 25 Honduras 26 Cộng hoà Đôminich 27 Cuba 28 Ai Cập 29 Mexico 30 Libăng 31 Jordan 32 New Caledoni 33 Reunion Giá trị Tỷ lệ giá (USD) trị (%) 16.339.809 4.087.069 3.486.213 3.092.703 2.216.606 1.781.334 477.272 470.047 434.239 279.069 12.800 2.456 2.002.805 1.713.368 609.043 628.569 344.807 239.095 44.668 1.639.906 699.661 462.902 201.356 127.468 54.070 24.486 22.912 10.800 10.000 7.440 6.075 6.000 1.550 1.446 1.300 1.147 71,25 17,82 15,20 13,49 9,67 7,77 2,08 2,05 1,89 1,22 0,06 0,01 8,73 7,47 2,66 2,74 1,50 1,04 0,19 7,15 3,05 2,02 0,88 0,56 0,24 0,11 0,10 0,05 0,04 0,03 0,03 0,03 0,01 0,01 0,01 0,005 8 34 Nam Phi 35 Ucraine TỔNG CỘNG 734 561 22.933.499 0,003 0,002 100,00 VASEP (theo số liệu Hải quan Việt Nam) Tổng quan về enzyme 1.2. 1.2.1. Định nghĩa [4] Proteaza là enzyme xúc tác sự thủy phân các liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử protein, polypeptide đến các sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển axit amin. H2N-CH-CO-NH-CH-CO-…-NH-CH-COOH + (n-1)H2O R1 Protease R2 Rn H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH +…+ H2N-CH-COOH R1 1.2.2. Phân loại enzyme protease [11] R2 Rn Enzyme protease đƣợc chia làm hai loại: endopeptidaza và exopeptidaza. Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidaza đƣợc chia làm hai loại: Aminopeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino axit. Cacboxypeptidaza: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một amino axit. Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidaza đƣợc chia thành 4 nhóm: Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin. Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhƣ chymotrypsin, trypsin, 9 elastase. Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn nhƣ subtilisin, carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thƣờng hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tƣơng đối rộng Cysteine proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cysteine proteinase bao gồm các proteinase thực vật nhƣ papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cysteine proteinase thƣờng hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. Aspartic proteinase: hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin, nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa nhƣ: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thƣờng hoạt động mạnh ở pH trung tính. Metallo proteinase: là nhóm proteinase đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng nhƣ các sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thƣờng hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dƣới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease đƣợc phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm: Protease axit : pH = 2 – 4 Protease trung tính: pH = 7 – 8 Protease kiềm: pH = 9 - 11 1.2.3. Cơ chế xúc tác của enzyme Quá trình tạo thành phức hợp enzyme cơ chất và cự biến đổi của phức hợp này thành sản phẩm, giải phóng enzyme tự do thƣờng trải qua ba giai đoạn theo sơ đồ sau: E+S Trong đó: E: enzyme S: cơ chất ES: phức hợp enzyme – cơ chất P: Sản phẩm ES P+E 10 Giai đoạn 1: enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi năng lƣợng hoạt hóa thấp. Các loại liên kết chủ yếu đƣợc tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là: tƣơng tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tƣơng tác Van der Waals. Giai đoạn 2: xảy ra sự biến đổi cơ chất dẫn tới sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản ứng. Giai đoạn 3: tạo thành sản phẩm, còn enzyme đƣợc giải phóng ra dƣới dạng tự do. 1.2.4. Ứng dụng của enzyme protease trong công nghiệp Enzyme protease đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dƣợc, nông nghiệp… Trong công nghiệp thịt, protease đƣợc dùng để làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần potein trong thịt, làm cho thịt có một độ mềm thích hợp và tăng hƣơng vị cho thịt. Các loại protease thƣờng dùng: protease thực vật (papain, bromelin, fixin) và protease vi sinh vật (từ nấm mốc, xạ khuẩn). Trong công nghiệp sữa, protease đƣợc dùng để sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Có thể dùng renin, pepsin, một số protease vi sinh vật có hoạt tính làm đông tụ sữa đƣợc tách từ nấm mốc hoặc vi khuẩn. Trong công nghiệp da, protease đƣợc sử dụng với mục đích tách lông trên da và làm mềm da nhờ sự thủy phân sơ bộ lông, tách các mô liên kết phía ngoài ra, chỉ còn một lớp collagen tạo lớp mỏng và mềm da. Trong công nghiệp dệt: protease đƣợc sử dụng để xử lý bên ngoài các sợi tơ, làm nhiệm vụ kết dính các sợi tơ. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein, serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm do đó làm giảm lƣợng hóa chất để tẩy trắng. Trong chế biến thủy sản, tăng lƣợng nƣớc mắm nhờ thủy phân protein thành các acid amin làm tăng hiệu suất thu hồi đạm của nƣớc mắm. Một số ứng dụng khác: 11 - Điều chế các dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dƣỡng, chất điều vị trong thực phẩm và bổ sung cho thức ăn gia súc. Từ Streptomyces fradiae tách đƣợc chế phẩm keratineza thủy phân đƣợc keratin rất có giá trị để sản xuất bột đạm từ da, lông vũ. - Điều chế môi trƣờng dinh dƣỡng của vi sinh vật để sản xuất vacsin, kháng sinh… - Sản xuất keo động vật, chất giặt tổng hợp để tẩy các chất bẩn protein, sản xuất mỹ phẩm. - Sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, nhƣ bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thƣơng. 1.3. . Thuỷ phân protein bằng con đƣờng hoá học hoặc con đƣờng enzyme có thể cho ra đa dạng sản phẩm. 1.3.1. Thuỷ phân hoá học là phƣơng pháp cổ điển. Thuỷ phân có thể thực hiện trong môi trƣờng acid (HCl hoặc H2SO4) hoặc trong môi trƣờng kiềm (NaOH). Điều kiện thuỷ phân khá tốn kém: nhiệt độ cao (1000C) và thƣờng là trong môi trƣờng áp suất thấp. Thuỷ phân axit có bất lợi là phá huỷ một phần axit amin và đặc biệt là phá huỷ hoàn toàn tryptophane. Cho nên cần thiết bổ sung vào dịch thuỷ phân những axit amin này. Thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm bằng xút sẽ phá huỷ cystein, cystine, arginin và methionin. Đặc biệt, thuỷ phân trong môi trƣờng kiềm là nguyên nhân gây ra sự chuyển đổi L-axit amin thành D-axit amin con ngƣời không hấp thụ đƣợc, điều này làm giảm giá trị dinh dƣỡng của sản phẩm. 12 1.3.2. Thuỷ phân enzyme có thuận lợi là dễ kiểm tra hơn thuỷ phân hoá học, cho phép giữ giá trị dinh dƣỡng của nguyên liệu ban đầu và không cần xử lý hoá học để loại bỏ tác nhân thuỷ phân sau khi thuỷ phân (enzyme dễ dàng bị bất hoạt bởi nhiệt độ tƣơng đối). Trong thuỷ phân enzyme, những proteasa sẽ cắt liên kết peptit của 2 axit amin kế tiếp nhau trong đoạn ban đầu của protein tạo thành ít nhất 2 peptit. Cắt đứt liên kết peptit sẽ giải phóng proton H+. Sự giải phóng này sẽ làm cho môi trƣờng có tính axit. Quy luật này buộc quá trình thuỷ phân xảy ra trong điều kiện pH môi trƣờng lớn hơn 6.5 để cho mức độ điện li của ion -R-N+H3 đƣợc đủ. Khi pH nhỏ hơn thì phản ứng xảy ra theo chiều ngƣợc lại và do đó ion OH- đƣợc giải phóng. H O R2 ... R1 N + ... OH2 enzyme H + ... R1 H H H R2 + H N H R2 O + ... H N O H H H R2 ... H H ... H N + + H H Sự khác nhau trong quá trình chuẩn bị thuỷ phân chính là nguồn gốc enzyme thƣơng mại (enzyme ngoại bào), đƣợc thêm vào trong quá trình chuẩn bị để thúc đẩy quá trình thuỷ phân. Quá trình thuỷ phân đƣợc thúc đẩy bằng một enzyme duy nhất hay hỗn hợp proteasa thƣơng mại có rất nhiều thuận lợi nhƣ kiểm tra đƣợc quá trình thuỷ phân và thông số thuỷ phân và sử dụng nhiệt độ xúc tác tƣơng đối. Những enzyme đƣợc sử dụng có thể chia thành 3 dạng : 1. Enzyme có nguồn gốc thực vật : papain (quả đu đủ), ficin (cây vả), bromelin (quả dứa). 2. Enzye có nguồn gốc động vật : trypsin, chymotrypsin, pepsin (thành dạ dày). 3. Enzyme có nguồn gốc vi sinh vật : pronase (streptomyces griseus), protamex, monzym (bacillus subtilis) v.v. 13 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme trong quá trình thủy phân [2] a. Ảnh hƣởng của nồng độ enzyme cơ chất Giống nhƣ các phản ứng enzyme, tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ enzyme. Khi nồng độ enzyme quá cao, nếu tiếp tục thêm enzyme thì sự biến đổi của tốc độ thủy phân là không đáng kể. Vì vậy, tốt hơn là sử dụng nồng độ enzyme thích hợp để đạt hiệu quả thủy phân cực đại và giảm giá thành. Trong các phản ứng do enzyme xúc tác trƣớc hết tạo thành phức trung gian giữa enzyme và cơ chất. Sau đó, phức này chuyển hóa tiếp tục tạo thành sản phẩm cuối cùng và enzyme tự do, enzyme lại kết hợp với phân tử cơ chất khác. Nếu nồng độ cơ chất đủ thích hợp với lƣợng enzyme sẽ làm cho quá trình thủy phân diễn ra đều đặn nhanh chóng b. Ảnh hƣởng của các chất kìm hãm các chất hoạt hóa Chất kìm hãm hay còn gọi là các chất ức chế là những chất mà khi trong phản ứng có sự hiện diện của chúng, enzyme có thể bị giảm hoặc mất hoạt tính. Các chất này có thể là các ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ. Các chất kìm hãm thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hoặc không cạnh tranh. Với mỗi enzyme ta có các chất kìm hãm khác nhau. Các chất hoạt hóa là những chất có tác dụng làm tăng tính hoạt tính enzyme. Các chất này có bản chất hóa học khác nhau, có thể là ion kim loại, anion hoặc các chất hữu cơ. c. Ảnh hƣởng của nhiệt độ Vì enzyme có bản chất protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ đều ảnh hƣởng đến hoạt động của enzyme. Thật vậy, mỗi enzyme chỉ hoạt động trong vùng nhiệt độ xác định. Phần lớn enzyme hoạt động thích hợp ở khoảng nhiệt độ 40 oC ÷ 50oC và vô hoạt hóa ở 70oC. Trong vùng nhiệt độ thích hợp nếu nhiệt độ tăng 10oC thì tốc độ thủy phân tăng 1,5 ÷ 2 lần. Nhiệt độ thích hợp của enzyme có thể thay đổi khi có sự thay đổi về pH, cơ chất. d. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng 14 Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi pH môi trƣờng. Mỗi enzyme chỉ hoạt động ở vùng pH nhất định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính, chỉ có một số enzyme hoạt động tối thích nằm trong vùng acid mạnh hay kiềm mạnh. e. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân Thời gian thủy phân kéo dài hoặc rút ngắn đều ảnh hƣởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lƣợng của sản phẩm. Thời gian tác dụng kéo dài thì enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để. Nhƣng nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức dẫn đến vi sinh vật thích nghi và hoạt động mạnh tạo ra các sản phẩm cấp thấp nhƣ NH3, H2S, indol, skatol… đồng thời khi thời gian kéo dài hiệu quả kinh tế sẽ kém. Ngƣợc lại, thời gian thủy phân rút ngắn, sự phân giải protein chƣa triệt để, hiệu suất thủy phân không cao và gây lãng phí nguyên liệu. f. Ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc Nƣớc là môi trƣờng thuận lợi của enzyme và vi sinh vật hoạt động. Các kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện để các loại enzyme và vi sinh vật hoạt động đƣợc là môi trƣờng phải có hàm lƣợng nƣớc tự do tối thiểu là 15%. Do vậy, nếu trong quá trình thủy phân ta bổ sung lƣợng nƣớc quá thấp thì nó hạn chế đƣợc sự hoạt động của vi sinh vật nhƣng đồng thời nó cũng ức chế hoạt động của enzyme làm giảm hiệu suất thủy phân. Nhƣng nếu bổ sung hàm lƣợng nƣớc quá cao thì chính nƣớc là môi trƣờng thuận lợi để vi sinh vật hoạt động và phát triển tạo ra các sản phẩm cấp thấp nhƣ: indol, skatol, NH3, H2S… làm giảm chất lƣợng sản phẩm. 1.3.4. Sản phẩm thủy phân 1.3.4.1. Dịch đạm thủy phân Dịch đạm thủy phân là sản phẩm của quá trình thủy phân. Khi cô đặc thì chúng sẽ thành dịch đạm cô đặc. Thành phần chủ yếu của dịch đạm thủy phân là các axit amin, các peptit. Ngoài ra, trong dịch đạm thủy phân còn chứa một lƣợng nhỏ khoáng và lipit.