Tài liệu Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm có ích paecilomyces javanicus và metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng (peieris rapae) hại rau họ hoa thập tự.

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BẠCH THỊ ĐIỆP Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM CÓ ÍCH PAECILOMYCES JAVANICUS VÀ METARHIZIUM ANISOPLIAE TRONG PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (PEIERIS RAPAE) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : LTK8-CNSH Khóa : 2012-2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BẠCH THỊ ĐIỆP Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHẾ PHẨM NẤM CÓ ÍCH PAECILOMYCES JAVANICUS VÀ METARHIZIUM ANISOPLIAE TRONG PHÒNG TRỪ SÂU XANH BƯỚM TRẮNG (PEIERIS RAPAE) HẠI RAU HỌ HOA THẬP TỰ” KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Ngành : Công nghệ sinh học Khoa : CNSH - CNTP Lớp : LTK8-CNSH Khóa : 2012-2014 Giáo viên hướng dẫn : 1 PGS.TS. Phạm Thị Vượng 2. TS. Nguyễn Văn Duy Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Qua một thời gian nỗ lực học tập và nghiên cứu, tới nay em đã hoàn thành khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm có ích Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng(Peieris rapae) hại rau họ hoa thập tự”. Trong quá trình học tập và nghiên cứu, em đã nhận được sự dạy bảo tận tình của các thầy cô, đồng thời cũng nhận được sự giúp đỡ và động viên của gia đình, bạn bè. Trước hết, em xin gửi lời chân thành cảm ơn tới tất cả các quý thầy cô trong khoa CNSH - CNTP, Trường Đại học nông lâm Thái Nguyên. Cảm ơn Viện Bảo vệ thực vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu đề tài luận văn này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô PGS. TS. Phạm Thị Vượng, người đã tận tâm truyền đạt kiến thức cho em và hơn cả là tấm gương về lòng say mê nghiên cứu khoa học. Xin gửi lời cảm ơn tới thầy TS. Phạm Văn Duy, giảng viên khoa CNSH - CNTP đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn em hoàn thành khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn Th.s. Nguyễn Thị Chúc Quỳnh cùng toàn thể anh, chị trong nhóm nghiên cứu Nấm côn trùng, Trung tâm Đấu tranh sinh học đã truyền đạt cho em tính chính xác, nghiêm túc trong nghiên cứu khoa học cũng như tinh thần trách nhiệm với những công việc mình làm. Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu nặng tới những người thân trong gia đình, bố, mẹ, anh chị em đã động viên, giúp đỡ em cả về vật chất lẫn tinh thần trong quá trình học tập. Hà Nội, ngày 7 tháng 6 năm 2014 Sinh viên Bạch Thị Điệp MỤC LỤC Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ................................................ 3 1.3.1. Ý nghĩa khoa học .............................................................................. 3 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................... 3 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 4 2.1. Cơ sở khoa học việc sử dụng chế phẩm nấm có ích trong phòng trừ sâu hại ................................................................................................................... 4 2.2. Tình hình phát sinh, gây hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) .. 5 2.3. Sơ lược về Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae ............ 7 2.3.1. Sơ lược về Paecilomyces javanicus .................................................. 7 2.3.2. Sơ lược về Metarhizium anisopliae .................................................. 9 2.4. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm để phòng trừ sâu hại........................................................................................................... 12 2.5. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về sử dụng chế phẩm nấm có ích ................................................................................................................. 13 2.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước ................................................... 13 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................... 14 Phần 3. ĐỐI TƯƠNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 17 3.1. Đối tượng, vật liệu và phạm vi nghiên cứu........................................... 17 3.1.1. Đối tượng và vật liệu nghiên cứu ................................................... 17 3.1.2. Thiết bị thí nghiệm .......................................................................... 17 3.1.3. Hóa chất .......................................................................................... 17 3.1.4. Môi trường nuôi cấy ....................................................................... 17 3.1.5. Phạm vi nghiên cứu ........................................................................ 18 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ......................................... 18 3.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 18 3.4. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 18 3.4.1. Đánh giá khả năng ký sinh gây chết SXBT hại rau của một số nguồn nấm đã được phân lập tại Viện bảo vệ thực vật............................. 18 3.4.2. Phân lập lại, làm thuần và tuyển chọn dòng có độc lực cao ........... 19 3.4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae........................................................................ 21 3.4.4. Đánh giá hiệu quả gây chết sâu ở nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae ở các liều lượng khác nhau. ............................... 23 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi ............................................................................. 25 3.5. Tính toán và xử lý số liệu...................................................................... 25 Phần 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 26 4.1. Đánh giá khả năng ký sinh sâu hại của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật...................................................................... 26 4.2. Đánh giá tuyển chọn chủng nấm Metarhizium anisopliae và Peacylomyces javanicus có độc tính cao sau khi đã phân lập lại và làm thuần. ...................... 29 4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng của nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae................................................................................ 35 4.3.1. Xác định môi trường tối ưu nhân sinh khối nấm Paecilomyces javanicus ................................................................................................... 35 4.3.2. Xác định nhiệt độ thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm.............. 39 4.4. Nghiên cứu liều lượng diệt sâu thích hợp với nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng thí nghiệm và nhà lưới 41 4.4.1. Thí nghiệm trong phòng ................................................................. 42 4.4.2. Thí nghiệm ngoài nhà lưới.............................................................. 45 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................. 48 5.1. Kết luận ................................................................................................. 48 5.2. Kiến nghị ............................................................................................... 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 49 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Các ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải T0C Nhiệt độ A% Ẩm độ tương đối của không khí bt Bào tử VBVTV Viện Bảo vệ thực vật CT Công thức ĐC Đối chứng CS Cộng sự TB Trung bình SXBT Sâu xanh bướm trắng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1. Kết quả đánh giá khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật ............................................. 26 Bảng 4.2. Tỷ lệ ký sinh trở lại gây chết SXBT của một số nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật ............................................. 28 Bảng 4.3. Đặc điểm hình thái cơ bản của P. javanicus và M. anisopliae ký sinh trên sâu hại ................................................................................. 30 Bảng 4.4. Hiệu lực phòng trừ SXBT của các chủng nấm Peacilomyces javanicus đã tuyển chọn .................................................................... 33 Bảng 4.5. Hiệu lực phòng trừ SXBT của các chủng nấm Metarhizium anisopliae đã tuyển chọn ................................................................... 34 Bảng 4.6. Số lượng bào tử nấm P. javanicus sau 10 ngày nhân sinh khối trên các loại môi trường nhân sinh khối khác nhau .......................... 36 Bảng 4.7. Số lượng bào tử nấm M. anisopliae sau 10 ngày nhân sinh khối trên các loại môi trường nhân sinh khối khác nhau .......................... 37 Bảng 4.8. Số lượng bào tử nấm P. javanicus sau 10 ngày nuôi cấy ở các mức nhiệt độ không khí khác nhau ................................................... 39 Bảng 4.9. Số lượng bào tử nấm M. anisopliae sau 10 ngày nuôi cấy ở các mức nhiệt độ không khí khác nhau ................................................... 40 Bảng 4.10. Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm P. javanicus (PaeSXBT1) với các liều lượng khác nhau ............................................... 42 Bảng 4.11. Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm M. anisopliae (MaSXBT1) với các liều lượng khác nhau ............................................... 43 Bảng 4.12. Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm P. javanicus với các liều lượng khác nhau ................................................................................ 45 Bảng 4.13. Hiệu quả diệt sâu của chế phẩm nấm M. anisopliae với các liều lượng khác nhau ................................................................................ 46 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Bắp cải bị sâu xanh bướm trắng gây hại ........................................... 6 Hình 2.2. Khuẩn lạc Paecilomyces spp. (A) và bào tử nấm P. javanicus (B) (nguồn https://www.biotect.or.th) ................................................. 8 Hình 2.3. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae (A) và bào tử nấm Metarhizium anisopliae (B) (nguồn http://www.naro.affrc.go.jp) ... 10 Hình 4.1. Khả năng diệt sâu của một số nguồn nấm thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật. ................................................................................. 27 Hình 4.2. Tỷ lệ ký sinh trở lại trên SXBT của một số nguồn nấm thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật ........................................................... 28 Hình 4.3. Sâu nhiễm nấm M. anisopliae chuyển màu vàng xuất hiện vết đen (A) và bào tử có màu xanh lục (B) ............................................. 31 Hình 4.4. SXBT gây hại trên rau (A) và sâu bị nhiễm nấm P. javanicus (B)...... 31 Hình 4.5. Khuẩn lạc P. javanicus sau 3 ngày (A), 5 ngày (B) và 7 ngày (C) ... 31 Hình 4.6. Khuẩn lạc của nấm M. anisopliae đã phân lập, làm thuần sau 3 ngày (A) và 7 ngày (B) ...................................................................... 32 Hình 4.7. Bào tử của nấm Paecilomyces javanicus ........................................ 32 Hình 4.8. Bào tử nấm Metarhizium anisopliae ............................................... 32 Hình 4.9. Hiệu lực gây chết sâu của chủng nấm Paecilomyces javanicus đã tuyển chọn..................................................................................... 33 Hình 4.10. Hiệu lực gây chết sâu của các chủng nấm Metarhizium anisopliae đã tuyển chọn. .................................................................. 35 Hình 4.11. Sinh khối nấm P. javanicus sau 10 ngày trên môi trường khác nhau ... 36 Hình 4.12. Sinh khối nấm M. anisopliae sau 10 ngày trên 3 loại môi trường khác nhau ............................................................................... 38 Hình 4.13. Nhiệt độ thích hợp nhân sinh khối nấm P. javanicus. .................. 39 Hình 4.14. Nhiệt độ thích hợp cho nhân sinh khối nấm M. anisopliae. ......... 41 Hình 4.15. Liều lượng diệt sâu xanh bướm trắng của nấm P. javanicus sau các ngày phun .................................................................................... 42 Hình 4.16. Liều lượng diệt sâu xanh bướm trắng của nấm M. anisopliae sau các ngày phun.............................................................................. 44 Hình 4.17. Liều lượng diệt sâu SXBT của nấm P. javanicus sau các ngày phun .. 45 Hình 4.18. Liều lượng diệt sâu thích hợp của nấm M. anisopliae sau các ngày phun .......................................................................................... 47 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Trong những năm gần đây, sản xuất nông nghiệp Việt Nam đang chuyển đổi theo hướng sản xuất hàng hóa, nhằm tạo ra khối lượng sản phẩm lớn, chất lượng cao, an toàn thực phẩm phục vụ tiêu dùng, cung cấp đủ nguyên liệu cho công nghiệp chế biến và xuất khẩu. Cây rau đã và đang trở thành cây trồng quan trọng trong cơ cấu cây trồng nông nghiệp. Những cây rau họ hoa thập tự (Crucirea) là nhóm thực phẩm quan trọng, chiếm 50% tổng sản lượng rau. Rau thập tự có thời gian sinh trưởng ngắn, nhóm rau này có thân lá mềm yếu và chứa nhiều chất dinh dưỡng [15]. Kết hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm, rau họ hoa thập tự ở nước ta bị nhiều loài sâu phá hại như sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh bướm trắng, muội, bọ nhảy…. Trong đó, sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) là đối tượng gây hại nguy hiểm nhất trên rau họ hoa thập tự nói chung và bắp cải nói riêng ở khắp các vùng trồng rau, đặc biệt là ở phía Bắc, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng rau [12]. Sâu xanh bướm trắng gây hại mạnh nhất từ tháng 10 năm trước đến tháng 5 năm sau và nặng nhất trong tháng hai trên bắp cải cuộn. Với đặc tính vòng đời ngắn, sinh sản nhiều, đặc biệt là tính kháng thuốc phát triển rất nhanh dẫn đến vấn đề dịch hại đã, đang nảy sinh nhanh chóng trên diện rộng, nhất là ở các vùng sản xuất rau tập trung, gây thiệt hại lớn về năng suất, chất lượng, kinh tế cho người nông dân. Công tác phòng trừ sâu hại gặp nhiều khó khăn. Để phòng trừ chúng, người nông dân đã thường xuyên sử dụng các loại thuốc hóa học bảo vệ thực vật trên đồng ruộng [9]. Hàng năm, có tới hàng ngàn trường hợp bị ngộ độc và nhiều trường hợp tử vong. Ngoài ra, việc lạm dụng thuốc hóa học còn làm giảm số lượng thiên địch, sinh vật có ích giảm 70 - 100%, sâu hại kháng thuốc 20 - 1000 lần so với bình thường, dẫn đến mất cân bằng sinh thái [12]. Việc lạm dụng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật của người dân đã và đang gây ra những hậu quả nghiêm trọng cho môi trường và sức khỏe con người…. Không những vậy, nhiều loại thuốc hóa học đã bị cấm sử dụng vẫn được nông dân sử dụng tràn lan trên đồng ruộng. Song song việc đối mặt với 2 tác hại của sâu bệnh trên đồng ruộng thì nông dân còn phải chịu tác động không nhỏ của sự ô nhiễm đất, nước, không khí. Cùng với việc các loại rau ăn hàng ngày tồn dư lượng thuốc hóa học cao gấp nhiều lần cho phép đã dẫn đến nhiều hậu quả nghiêm trọng với sức khỏe con người. Xây dựng những vùng rau sản xuất an toàn đã và đang là yêu cầu cấp bách đối với thực tiễn sản xuất nông nghiệp. Trong những hướng phòng trừ sâu bệnh hại rau thì việc áp dụng biện pháp sinh học là cơ sở để hình thành nên các vùng sản xuất rau an toàn. Do đó, biện pháp phòng trừ sinh học cần được ưu tiên sử dụng nhằm quản lý dịch hại bền vững, giảm thiểu số lượng sử dụng cũng như tác hại của thuốc bảo vệ thực vật. Rất nhiều chế phẩm sinh học đã và đang sử dụng trong phòng trừ sâu hại phổ biến trên các vùng trồng rau như: MPV, NPV, B.t, Delfin…. Trong đó, hướng sử dụng chế phẩm nấm có ích là hiệu quả, an toàn với môi trường và đáp ứng được nhu cầu cấp thiết. Vấn đề nghiên cứu sử dụng nấm có ích Peacilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm sinh học trừ sâu hại rau họ hoa thập tự đã có nhiều thành công và có ý nghĩa to lớn về kinh tế…. Việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu xanh bướm trắng là yêu cầu cấp thiết. Những năm gần đây, Viện Bảo vệ thực vật đã tuyển chọn được nhiều chủng nấm. Hai loài Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae đã nghiên cứu, ứng dụng trên rầy nâu hại lúa, sâu tơ, sâu khoang…. nhưng chưa có nhiều nghiên cứu trên đối tượng sâu xanh bướm trắng. Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng chế phẩm nấm có ích Peacilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae trong phòng trừ sâu xanh bướm trắng (Peieris rapae) hại rau họ hoa thập tự”. 1.2. Mục tiêu nghiên cứu Tuyển chọn chủng nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae có hoạt lực cao diệt sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) từ nguồn nấm đã thu thập được tại Viện Bảo vệ thực vật. Nghiên cứu sử dụng hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ sâu xanh bướm trắng (SXBT) hại rau họ hoa thập tự. 3 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Xác định một số đặc điểm sinh học, sinh thái chính của loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae làm cơ sở trong việc tạo chế phẩm sinh học trong phòng trừ SXBT (Pieris rapae) hại rau họ hoa thập tự. - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học cần thiết góp phần làm cơ sở cho việc xây dựng biện pháp sinh học phòng trừ SXBT có hiệu quả. - Đề tài là cơ sở khoa học, định hướng cho các nghiên cứu tiếp theo trong phòng trừ SXBT ngoài đồng ruộng. 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Nghiên cứu sử dụng chế phẩm Paecilomyces javanicus, Metarhizium anisopliae trong phòng trừ SXBT, giảm sử dụng thuốc trừ sâu hóa học, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái. - Kết quả nghiên cứu góp phần nâng cao hiệu quả kinh tế kỹ thuật của biện pháp phòng trừ sinh học trong hệ thống quản lý tổng hợp sâu hại rau họ hoa thập tự (IPM), bảo vệ môi trường, thiên địch trên đồng ruộng, tạo sản phẩm rau an toàn cho người tiêu dùng, chế biến và xuất khẩu. 4 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cơ sở khoa học việc sử dụng chế phẩm nấm có ích trong phòng trừ sâu hại Trong sinh quần nông nghiệp có nhiều tác nhân sinh học là nhân tố điều hòa tự nhiên, duy trì cân bằng sinh thái của quần thể sinh vật trên đồng ruộng [6]. Trong số các tác nhân sinh học gây chết sâu hại cây trồng, nấm ký sinh côn trùng chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng. Bằng quá trình đấu tranh sinh học, các nấm diệt sâu trong thiên nhiên đã làm được nhiệm vụ điều hoà và tiêu diệt một lượng lớn các côn trùng gây hại [16]. Nước ta là một nước khí hậu nhiệt đới gió mùa, với khí hậu nóng ẩm quanh năm, độ ẩm cao nên rất thuận lợi có sự phát sinh và lây nhiễm của nấm bệnh. Thành phần nấm ký sinh trên các sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng và phong phú. Trong đó, có hai loài nấm Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae. Nấm Spicaria javanica (tên cũ của nấm Paecilomyces javanicus) lần đầu tiên được tác giả Friederichs và Bally - Meded phát hiện, ghi nhận vào năm 1923 trên sâu non bộ cánh vẩy. Đến năm 1957, tác giả A.H.S. Brown. và G. Smith, đưa vào hệ thống chi Paecilomyces và đặt tên là Paecilomyces javanicus. Sau đó tên của nấm đã được thay đổi 3 lần vào các năm: 1959 với tên khoa học là Spicaria formosensis (tác giả Sowoda người Đài Loan), 1993 là Cordyceps scarabaeicola (tác giả Liang Z. Q, Trung Quốc) và vào năm 2005 là Isaria javanicus (Samson và Hywel). Tuy nhiên, danh pháp Paecilomyces javanicus vẫn là tên nấm được dùng thông dụng và phổ biến nhất hiện nay [25; 30; 37]. Nấm Paecilomyces javanicus đã được ứng dụng để phòng trừ nhiều loại côn trùng bộ cánh vảy (Lepidoptera) và bộ hai cánh (Diptera) hại cây trồng như sâu tơ Plutella xyllostella, sâu khoang (Spodoptera litura), sâu ăn lá (Trilocha varians) và một số loại côn trùng thuộc bộ hai cánh [20; 27; 37]. Nấm Metarhizium anisopliae là loài phổ biến, chúng phân bố và có phổ ký chủ rất rộng. Vào năm 1879, tác giả Metchnikov đã phân lập được loài nấm trên từ bọ cánh cứng Anisopliae austrinia và ông đặt tên là Entomophtora anisopliae và khuyến cáo nên sử dụng nấm này để phòng trừ 5 các loại côn trùng hại cây trồng. Năm 1883, tác giả Sorokin đổi lại nấm này thành tên Metarhizium anisopliae Sorokin. Vì nấm có màu lục hoặc xanh lục nên người ta thường gọi là nấm lục cương hay nấm xanh. Năm 1976, nhà khoa học Tulloc đã phân loại nấm và rút ra kết luận trong chi Metarhizium chỉ có hai loài nấm đó là Metarhizium anisopliae và Metarhizium flavoviride, trong đó loài Metarhizium anisopliae chiếm khoảng 70%. Sau đó, tác giả đặt lại tên cho loài nấm gây bệnh côn trùng Metarhizium anisopliae là nấm Mertarhizium album và Mertarhizium brunneum. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thành công thuốc nấm Metarhizium anisopliae với số lượng lớn và đã sử dụng rộng rãi để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại cây trồng đạt hiệu quả cao [13]. Vấn đề sử dụng nấm có ích trong phòng trừ sinh học được quan tâm nghiên cứu. Người đi tiên phong trong lĩnh vực này chính là nhà khoa học người Nga Ilya Ilich Mechnikov (1884). Ông cùng người học trò của mình là nhà côn trùng học Isac Krasirsik đã tiến hành sản xuất bào tử nấm Metarhizium anisopliae thuần khiết, trộn với đất bột để rải ra đồng ruộng diệt sâu non và trưởng thành bọ đầu dại hại củ cải đường (Bothinoderes punctiventris) và đã đạt được hiệu quả gây chết đến 55 - 80% sau 10 - 14 ngày. Tiếp đó, rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng nấm có ích phòng trừ sâu hại cây trồng. Do có sự phân bố rộng rãi với phổ ký chủ rộng, nấm M. anisopliae và P. javanicus đã được ứng dụng hiệu quả trong phòng trừ sinh học đối với côn trùng có hại [30; 34]. 2.2. Tình hình phát sinh, gây hại của sâu xanh bướm trắng (Pieris rapae) Sâu xanh bướm trắng có tên khoa học là Pieris rapae, thuộc họ Pieridae, bộ Lepidoptera gây hại chủ yếu trên rau họ hoa thập tự, đặc biệt trên bắp cải [26]. Đối với ruộng rau mới trồng, sâu thường chui vào phần ngọn cây để phá hại làm các lá khi lớn bị cong queo, thủng lỗ chỗ. Với bắp cải đã cuốn, sâu non đục sâu vào trong bắp và thải phân loang lổ, làm giảm chất lượng, mẫu mã sản phẩm. Sâu xanh bướm trắng phát sinh gây hại quanh năm, trong đó có 2 đợt gây hại chính trên rau xuân (tháng 3 - tháng 6) và rau đông (tháng 10 - tháng 11) [38]. 6 Nghiên cứu về tình hình gây hại của các đối tượng sâu hại trên rau đã được nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm. Ở Việt Nam, kết quả điều tra 3 năm 1995 - 1997 ở vùng Đồng Bằng Sông Hồng của Lê văn Trịnh đã xác định được 31 loài côn trùng gây hại trên rau thập tự, trong đó 3 đối tượng quan trọng nhất là: sâu tơ, sâu khoang và sâu xanh bướm trắng. Sâu xanh bướm trắng tập trung gây hại chủ yếu trên bắp cải, su hào, súp lơ [15]. Theo số liệu thống kê, nông dân vùng ngoại thành thành phố Hồ Chí Minh phải phun thuốc bảo vệ thực vật 20 - 30 lần trong một vụ bắp cải [10]. Còn ở vùng ngoại thành Hà Nội nông dân phun trung bình từ 9,7 đến 15,1 lần thuốc/vụ rau với lượng phun cao gấp 1,7 đến 2,4 lần so với khuyến cáo. Hơn nữa, người nông dân phải sử dụng hỗn hợp 2 - 3 loại thuốc với hy vọng thuốc mới có phổ tác động rộng, trừ được nhiều loại sâu bệnh, nâng cao hiệu quả của thuốc. Có đến 80% nông dân các vùng trồng rau sử dụng hỗn hợp hai loại thuốc với nhau và 6,6 - 12,2% hỗn hợp trên 3 loại thuốc [9]. Nhưng do những hạn chế về hiểu biết nên hỗn hợp thuốc không có tác dụng hỗ trợ nhau mà ngược lại làm giảm tác dụng và là nguyên nhân gây nên tính kháng thuốc của sâu, ngộ độc thực phẩm và ô nhiễm môi trường [5; 9]. Hình 2.1. Bắp cải bị sâu xanh bướm trắng gây hại (nguồn https://www.udkhcnbinhduong.vn) 7 2.3. Sơ lược về Paecilomyces javanicus và Metarhizium anisopliae 2.3.1. Sơ lược về Paecilomyces javanicus 2.3.1.1. Vị trí phân loại của Paecilomyces javanicus Theo Samson (1974), Paecilomyces có vị trí phân loại dựa vào cấu trúc cơ quan sinh sản hữu tính thì chi nấm Paecilomyces thuộc giới (Kingdom) Fungi, ngành (Phylum) nấm túi Ascomycota, ngành phụ Pezizomycotina, lớp (Class) Eurotiomycetes, bộ (Order) Eurotiales, họ (Family) Trichocomaceae, chi (Genus), Paecilomyces, loài (Species) Paecilomyces sp. [30]. 2.3.1.2. Đặc điểm, độc tố và cơ chế lây nhiễm, gây bệnh của nấm Paecilomyces javanicus trên cơ thể côn trùng Đặc điểm hình thái Kết quả nghiên cứu của tác giả Samson R. A. (1974, 2004) [29; 30] cho thấy, nấm Paecilomyces javanicus phát triển tương đối tốt trên môi trường Malt - Agar. Đường kính khuẩn lạc đạt trên 3 cm sau 14 ngày nuôi cấy ở 250C. Bề mặt khuẩn lạc có dạng bột ghồ ghề đến bông xốp, ban đầu có màu trắng sau chuyển màu kem rồi chuyển màu tím xám. Sợi nấm mịn, ngăn vách, trong suốt, đường kính 0,5 - 2,2 µm. Cành bào tử mọc trực tiếp từ sợi nấm dinh dưỡng hoặc sợi nấm khí sinh với chiều dài lên đến 50 µm. Trên cành bào tử hình thành các điểm sinh thể bình, tại mỗi điểm có khoảng 2 - 3 thể bình. Thể bình có kích thước 8 - 14 x 2 - 2,8 µm. Thể bình có hình dạng thuôn nhọn tại đỉnh, đầu thuôn nhọn nhỏ tới 0,7 - 1,4 µm. Bào tử đính đa số hình trụ, đôi khi hình thoi, mịn, trong suốt, kích thước 3,2 - 5,6 × 1,6 - 2,8 µm. Trên côn trùng, nấm thường có dạng bột trắng tím và hình thành nhiều cành bào tử phân sinh. Cành bào tử phân sinh thường tăng về chiều cao, với thể bình gần như hình cầu. Các bào tử khi nuôi cấy trên môi trường agar có thể sinh bào tử nhỏ, hình thoi với kích thước từ 3 - 3,5 x 1,2 - 1,7 µm [29; 30]. Khuẩn lạc P. javanicus trên môi trường MEA (Malt Extract Agar) phát triển chậm, đường kính khoảng 30 mm trong 14 ngày ở 250C. Bào tử trần thường có hình trụ điển hình, trong suốt và có kích thước 5 - 7,4 x 1,4 - 1,7 µm [2]. 8 A B Hình 2.2. Khuẩn lạc Paecilomyces spp. (A) và bào tử nấm P. javanicus (B) (nguồn https://www.biotect.or.th) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces spp. nói chung cần nhiều dưỡng chất, nếu thiếu chất dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với côn trùng. Nhiệt độ và ẩm độ ảnh hưởng đến quá trình hình thành và phát triển của bào tử nấm Paecilomyces spp. [29]. Theo Tạp chí Bảo vệ thực vật, Lê Thị Kim Oanh (2002), nấm Paecilomyces javanicus thích hợp ở nhiệt độ 280C và ẩm độ trong phạm vi 80 - 90%. Độ ẩm cao có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, độ ẩm thấp lại có lợi cho sự duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces spp. có khả năng sống lâu trong điều kiện độ ẩm từ 0 - 34% hơn là ẩm độ 75%. Nấm côn trùng nói chung rất cần ánh sáng cho sự phát triển và nấm Peacilomyces spp. cũng không ngoại lệ. Vì vậy, ánh sáng là nhân tố không thể thiếu trong sự hình thành bào tử nấm Peacilomyces spp. [9]. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của Paecilomyces javanicus Nấm Paecilomyces sp. có một cơ chế lây nhiễm duy nhất là tấn công vào xoang máu thông qua lớp biểu bì hoặc có thể thông qua đường miệng côn trùng. Côn trùng chết là sự kết hợp từ các yếu tố như tổn thương mô cơ do sự xâm chiếm, suy giảm nguồn dinh dưỡng và nhiễm độc tố do nấm tiết ra khi ở trong cơ thể côn trùng. Quá trình bám vào cơ thể côn trùng là một quá trình thụ động với sự giúp đỡ của gió và nước [20]. 9 Bào tử nấm được phát tán trong tự nhiên, rơi trên thân côn trùng và dính chặt vào da côn trùng theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào bào tử. Lớp kỵ nước này xuất hiện đặc biệt ở giai đoạn bào tử. Độ bám dính của các bào tử trên bề mặt biểu bì là nhờ lớp kỵ nước. Lectins, một loại cacbohydrate glycoprotein được phát hiện trên bào tử, giúp cho việc bám vào bề mặt biểu bì của bào tử. Sau 24 giờ, gặp điều kiện thuận lợi bào tử nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm qua vỏ kitin và các lỗ thông hơi của côn trùng. Trong quá trình đó, sợi nấm tiết ra phức hệ enzym phân huỷ protein, lipit, kitin của côn trùng. Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipase, chitinases và chitobiases. Trong đó, chitinases và endoprotease là hai emzym giữ vai trò quan trọng nhất [31]. Sau đó, sợi nấm phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện tế bào nấm đầu tiên. Ở giai đoạn này, lympho của côn trùng chứa đầy sợi nấm, các hồng cầu bị phá vỡ, dinh dưỡng bị đình trệ. Đồng thời, độc tố nấm tác động vào hệ thần kinh và làm tê liệt hoạt động của côn trùng. Các ngoại độc tố với bản chất hóa học là destruxin A (C29H47O7N5) và destruxin B (C30H51O7N5) và Boverixin (C45H57O9N3), gây hiện tượng tê liệt thần kinh, phá huỷ quá trình hô hấp, làm cho côn trùng có những thay đổi về bệnh lý và chết. Sau khi côn trùng chết, nấm vẫn tiếp tục sinh trưởng phát triển trên xác của vật chủ, vì đây là nguồn cơ chất giàu hữu cơ [36]. 2.3.2. Sơ lược về Metarhizium anisopliae 2.3.2.1. Vị trí phân loại của Metarhizium anisopliae Xếp theo hệ thống phân loại nấm của G.C. Anisworth, 1966, 1970, 1971 thì loài nấm Metarhizium anisopliae thuộc giới nấm Fungi hay Mycota, ngành nấm thật Eumycota, ngành phụ Mastigomyedina, ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, chi Metarhizium, loài Metarhizium anisopliae [13]. 2.3.2.2. Đặc điểm, độc tố, cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của nấm Metarhizium anisopliae Đặc điểm hình thái của Metarhizium anisopliae Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi dày đặc. Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử 10 xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục. Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ [33]. Nấm Metarhizium anisopliae có khuẩn lạc màu xanh, đôi khi có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế, chúng phát triển chậm trên môi trường không có peptone, ví dụ như PDA, Czapek - Dox và thích hợp trên môi trường có peptone như Sabouraud, nấm phát triển tốt trong điều kiện 250C, ẩm độ 80% sau 7 - 10 ngày nuôi cấy đường kính khuẩn lạc đạt 4 - 6 cm [33]. A B Hình 2.3. Khuẩn lạc Metarhizium anisopliae (A) và bào tử nấm Metarhizium anisopliae (B) (nguồn http://www.naro.affrc.go.jp) Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của M. anisopliae Metarhizium anisopliae không sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, nơi tích lũy nhiều CO2 và thiếu O2 có biên độ về độ ẩm rộng, có thể sống đến 445 ngày. Ở nhiệt độ dưới 100C và trên 450C nấm thường không hình thành bào tử. Nhiệt độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử nấm từ 25 - 300C và bào tử chết khi ở 49 - 550C, nhiệt độ nấm Metarhizium anisopliae phát triển tốt nhất là 250C. Độ pH có thể dao động khoảng 3,3 - 8,5 và pH thích hợp cho nấm phát triển là 6. Nấm M. anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, xenluloza và kitin của côn trùng gây hại cây trồng. Nấm có thể đồng hóa được nhiều nguồn thức ăn cacbon khác nhau và chúng phát triển tốt trên môi trường chứa glucogen và lipit. Để tạo bào tử, nấm M. anisopliae đòi hỏi độ ẩm không khí khá cao trên 80% [14]. 11 Độc tố của nấm Metarhizium anisopliae Gồm một số ngoại độc tố Destruxin A, B, C, D, E, các ngoại độc tố là sản phẩm thứ cấp, vòng peptit, L - leucine, anhydride, L - prolyn - L - valine anhydride và Desmethyl Destruxin B. Độc tố Destruxin A có công thức nguyên là C29H47O7N5, có điểm sôi là 1880C. Độc tố Destruxin A có bản chất hóa học là D - 2 hydroxy - 4 pentenoy - L - prolyl - L - isoleucyl - N - methyl - L- valyl - N - methyl - L alanyl - β - alanyl lacton. Đây là những Depxipeptit vòng. Độc tố Destruxin B có công thức nguyên là C30H51O7N5, có điểm sôi là 2340C, có bản chất hóa học là D - α - hydroxy - γ - methylvaleryl - L - prolyl - L isoleucyl - N - methyl - L - valyl - N - methyl - L - alanyl - β - alanyl lacton. Destruxin A và B thường gây ra triệu chứng tê liệt thần kinh trên một số sâu non của côn trùng hại cây trồng. Hai độc tố này chỉ độc đối với côn trùng hại cây trồng khi chúng ăn phải mà không độc khi xâm nhập qua da [28]. Độc tố Destruxin E có tác động như một chất ức chế miễn dịch ngăn cản phản ứng phòng vệ tế bào và thể dịch của một số côn trùng hại bộ hai cánh Diptera và độc tố này có hiệu quả hơn loại A và B. Destruxin E có tác dụng như một chất kháng sinh. Nấm lục cương M. anisopliae có thể tạo ra các enzyme phân hủy protein độc và các chất ức chế phản ứng kháng men protease trong tế bào máu của côn trùng. Ngoài ra, còn tạo ra Chytochalasin có tác dụng ngăn cản sự kéo dài sợi actin (protein cấu thành sợi lông côn trùng) [14]. Cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh của M. anisopliae Metarhizium anisopliae, tên khoa học cũ là Entomophthora anisopliae, là một loại nấm mọc tự nhiên trong đất trên toàn thế giới và gây bệnh ở loài côn trùng bằng cách ký sinh. Trong tự nhiên, khi bào tử nấm M. anisopliae rơi vào cơ thể côn trùng, gặp điều kiện thời tiết thích hợp. Những bào tử vô tính (gọi là conidia) của nấm tiếp xúc với cơ thể của ký chủ côn trùng 24 giờ thì sẽ nảy mầm tạo ống mầm xuyên qua vỏ kitin côn trùng, sau đó phân nhánh tạo nên mạng sợi nấm chằng chịt bên trong cơ thể côn trùng. Côn trùng phải huy động các tế bào bạch huyết để chống đỡ nhưng nấm M. anisopliae tiết ra các độc tố Destruxin A, B… có chứa protease và một số chất khác, chúng phá hủy 12 tế bào bạch huyết, cuối cùng gây chết côn trùng. Nếu độ ẩm môi trường xung quanh đủ cao, mốc trắng sau đó sẽ phát triển trên xác côn trùng và tạo nên màu xanh lá cây do bào tử được sản xuất. Nấm M. anisopliae rất cần các điều kiện nhiệt độ, ánh sáng… thích hợp cho quá trình bệnh lý và sự hình thành, phát triển của các loại độc tố [13]. 2.4. Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm để phòng trừ sâu hại Hiện nay, có 2 công nghệ chính được sử dụng rộng rãi để nhân sinh khối nấm đó là công nghệ lên men chìm và công nghệ lên men xốp. Mỗi công nghệ có những lợi thế khác nhau tùy vào quy mô sản xuất, điều kiện trang thiết bị, nguồn nguyên liệu sẵn có và sản phẩm cần đạt. Công nghệ lên men chìm có thể sản xuất chế phẩm ở quy mô lớn, tuy nhiên đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại. Đồng thời với một quy trình tự động khép kín nên dễ dàng chuyển sang sản xuất trong nhà máy sản xuất chế phẩm sinh học với quy mô lớn nhưng nhược điểm là chỉ thu được chế phẩm ở dạng bào tử chồi (Plastospore) có cấu trúc không bền vững nên có thời gian sống ngắn. Công nghệ lên men xốp thu nhận được chế phẩm nấm dạng đính bào tử (Conidiospore), ổn định và bền vững hơn dạng bào tử chồi (Plastospore), vì vậy công nghệ này đã được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong phòng trừ sâu hại cây trồng. Trong quy trình nhân sinh khối nấm thì việc lựa chọn và tạo được một thành phần dinh dưỡng thích hợp có ý nghĩa quan trọng: làm tăng độc tính diệt sâu của nấm và tăng số lượng bào tử nấm [12]. Nhóm tác giả Ma J. và CS., (2007) [27] cũng đã thử nghiệm một số môi trường lên men xốp để nhân sinh khối nấm P. javanicus, đó là các môi trường gạo, ngô có bổ xung pepton. Kết quả thử nghiệm cho thấy, nấm phát triển tốt trên cả hai môi trường gạo và ngô có bổ xung pepton 0,2%, lượng bào tử đạt tương ứng 8,72 x 1012 bt/kg và 8,35 x 1012 bt/kg cao hơn rất nhiều so với công thức không bổ xung pepton. Kết quả thử nghiệm lên men chìm nhân sinh khối sợi nấm, trong 2 loại môi trường là Potato Dextrose Agar (PDA) bổ xung 0,5% pepton và môi trường Czapek - Dox bổ xung 0,5%