Tài liệu Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ……o0o…… TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH …..o0o….. TRẦN THỊ MỸ TRANG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH ĐƯỜNG RUỘT CHO HEO Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học TS. Trần Thanh Thủy Thành phố Hồ Chí Minh 2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng chân thành và biết ơn sâu sắc đến: Phòng Khoa học và Công nghệ sau đại học Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh, Sở Giáo dục và Đào tạo tỉnh Sóc Trăng, Ban giám hiệu Trường cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt khóa học. TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đễ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành tốt luận văn. Quý thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Sinh lý, Sinh hóa Trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh và Viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh đã hỗ trợ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện các thí nghiệm của đề tài. Gia đình anh Bùi Thủy Lâm và chị Ngũ Ái Nữ, 443/1 Ấp Đông Hải, xã Đại Hải, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng đã hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thí nghiệm chế phẩm. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến những người thân của tôi, gia đình và bạn bè luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Trần Thị Mỹ Trang MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ....................................................................................................... 3 MỤC LỤC ............................................................................................................. 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................. 7 DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................... 8 DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. 10 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ .............................................................................. 11 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 12 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 13 1.1. Giới thiệu về probiotic .......................................................................................... 13 1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic ......................................................................... 13 1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic ................ 13 1.1.3. Cơ chê tác động của probiotic ......................................................................... 14 1.1.4. Vai trò của probiotic ........................................................................................ 18 1.2. Vi khuẩn lactic ...................................................................................................... 22 1.2.1. Đặc điểm hình thái .......................................................................................... 22 1.2.2. Phân loại vi khuẩn lactic ................................................................................. 23 1.2.3. Quá trình lên men lactic .................................................................................. 24 1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của vi khuẩn lactic ...... 26 1.2.5. ứng dụng của vi khuẩn lactic trong sản xuất các chế phẩm sinh học phục vụ đời sống ..................................................................................................................... 29 1.3. Giới thiệu về heo con ............................................................................................ 30 1.3.1. Vị trí phân loại của heo. .................................................................................. 30 1.3.2. Đặc điểm sinh lý tiêu hóa ở heo con ............................................................... 30 1.3.3. Các bệnh đường ruột ồ heo con ....................................................................... 31 1.3.4. Các biện pháp phòng và điều trị ...................................................................... 32 1.4. Sơ lược tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia súc, gia cầm ...... 34 1.4.1. Những nghiên cứu trong nước......................................................................... 34 1.4.2. Những nghiên cứu ở nước ngoài ..................................................................... 35 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 36 2.1. Vật liệu ................................................................................................................... 36 2.1.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 36 2.1.2. Hóa chất ........................................................................................................... 36 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 36 2.1.4. Môi trường ....................................................................................................... 37 2.2. Các phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 41 2.2.1. Khả năng sinh axit lactỉc của vi khuẩn lactic .................................................. 41 2.2.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sình lý, sinh hóa ..................................... 42 2.2.3. Phương pháp bảo quản giống vi khuẩn lactic ................................................. 46 2.2.4. Xác định gián tiếp mật độ tế bào bằng phương pháp đêm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch ................................................................................................ 47 2.2.5. Khảo sát sự sinh trưởng và và các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của vỉ khuẩn lactic bằng phương pháp đo mật độ quang .......................................... 47 2.2.6. Phương pháp tổ hợp giống vi khuẩn lactic ...................................................... 50 2.2.7. Tạo chế phẩm probiotic ................................................................................... 50 2.2.8. Thương pháp thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa ........................ 51 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 54 3.1. Tuyển chọn các chủng vỉ khuẩn lactic cố các đặc tính phù hợp vời yêu cầu tạo chế phẩm probiotic ...................................................................................................... 54 3.2. Khảo sát hoạt tính đề kháng vời các chất kháng sình của các chủng B,N4,L2 ........................................................................................................................................ 56 3.3. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vỉ khuẩn lactic được tuyển chọn ..................................................................................................................... 57 3.3.1. Các đặc điểm hình thái của chủng B, N4, L2 .................................................. 57 3.3.2. Các đặc điểm sinh ly, sinh hóa và phân loại chủng B, N4, L2 ....................... 58 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối tế bào của 3 chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................... 62 3.4.1. Ảnh hưởng cửa môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khôi của các chủng vi khuẩn lactic............................................................................................................ 62 3.4.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến sự tạo thành sinh khối của các chủng vi khuẩn lactic ................................................................................................. 65 3.5. Động thái quá trình tạo sinh khối tế bào của các chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện tối ưu ............................................................................................................. 74 3.6. Khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic sau khi đông khô ............... 76 3.7. Xác định tỷ lệ tổ hợp giống vi khuẩn lactic ........................................................ 77 3.8. Tạo chế phẩm probiotic........................................................................................ 78 3.9. Kiểm tra khả năng sống sót của các chủng vi khuẩn lactic trong chế phẩm PSPoi ............................................................................................................................. 78 3.10. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm PSP01 ............................................... 79 3.11. Bước đầu thử nghiệm chế phẩm PSP01 trên heo con sau cai sữa.................. 80 3.11.1. Tỷ lệ tiêu chảy ở heo con sau cai sữa ............................................................ 80 3.11.2. Tăng trọng ở heo con sau cai sữa .................................................................. 82 3.11.3. Hệ số tiêu tốn thức ăn .................................................................................... 83 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 85 Kết luận ......................................................................................................................... 85 Đề nghị .......................................................................................................................... 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................. 87 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ase Đuôi enzym B Lactobacillus agilis CFU Colony forming unit (mật độ tế bào) ĐC Đối chứng ETEC Enterotoxigenic E. coli G- Gram âm G+ Gram dương L2 MT Lactobacilus acidophilus Môi trường N4 Lactobacillus salivarius OD Optical density (mật độ quang) ose Đuôi cơ chất VK Vi khuẩn vsv Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước Bảng 1.2. Một số bacteriocin do VK lactic sinh ra Bảng 1.3. Ảnh hưởng của probiotic và axit lactic trên heo con và heo trưởng thành Bảng 1.4. Ảnh hưởng của probiotic lên vật nuôi Bảng 1.5. Nhu cầu axit amin của một số loài VK lactic Bảng 1.6. Nhu cầu vitamin cần cho sự phát triển của một số loài VK lactic Bảng 1.7. Thí nghiệm ở heo con Bảng 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm Bảng 3.1. Khả năng sinh axit lactic của các chủng VK lactic Bảng 3.2. Hoạt tính đối kháng của VK lactic đối với VK kiểm định Bảng 3.3. Hoạt tính đề kháng với các chất kháng sinh của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.4. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N 4 , L 2 theo nhiệt độ Bảng 3.5. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N 4 , L 2 ở những pH khác nhau Bảng 3.6. Khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng B, N 4 , L 2 ở những nồng độ muối khác nhau Bảng 3.7. Khả năng lên men các loại đường của các chủng VK lactic Bảng 3.8. Tổng hợp các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon đến sự tạo thành sinh khối của chủng B, N4, L2 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của các chủng B, N 4 , L 2 Bảng 3.16. Động thái quá trình tạo sinh khối, sinh axit lactic và độ pH của 3 chủng VK lactic Bảng 3.17. Tổng hợp các điều kiện để thu sinh khối tế bào của 3 chủng VK lactic Bảng 3.18. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK lactic theo thời gian bảo quản Bảng 3.19. Hoạt tính đối kháng của các tỷ lệ phối trộn với các chủng VK kiểm định Bảng 3.20. Sự biến động số lượng tế bào của 3 chủng VK trong chế phẩm PSPoi theo thời gian bảo quản Bảng 3.21. Tỷ lệ tiêu chảy trên heo con sau cai sữa (%) Bảng 3.22. Tăng trọng bình quân của heo con từ 28 đến 56 ngày tuổi Bảng 3.23. Hệ số tiêu tốn thức ăn trong thời gian thí nghiệm DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hoa (Salminen, 1998) Hình 1.2. L. acidophilus Hình 1.3. Sơ đồ chuyển hóa glucose thành axit lactic bằng con đường lên men lactic đồng hình (a) và lên men lactic dị hình (b) Hình 2.1. Phương pháp khoan lỗ thạch Hình 3.1. Khả năng sinh axit lactic của chủng L 2 và chủng B Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng với E. coli và s. typhỉmurỉum của chủng B, N 4 và L 2 Hình 3.3. Hoạt tính kháng neomicin, kanamicin, gentamicin của B, N 4 , L 2 Hình 3.4. (a) Hình thái khuẩn lạc của chủng B, N 4 và L 2 (b) Hình thái tế bào của chủng B, N 4 và L 2 được chụp trên kính hiển vi điện tử quét X15.000- 20.000 Hình 3.5. Các chủng B, N 4 và L 2 sau đông khô Hình 3.6. Chế phẩm PSP()1 trước và sau khi đóng gói DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng B Đồ thị 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng N 4 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự tạo thành sinh khối chủng L 2 Đồ thị 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N 4 Đồ thị 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành sinh khối của chủng L 2 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của pM ban đầu đến sự tạo thành sinh khối của chủng L 2 Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng B Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến sự tạo thành sinh khối của chủng N 4 Đô thị 3.9. Anh hưởng của nguôn nitơ đèn sự tạo thành sinh khôi của chủng L 2 Đồ thị 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men đến sự tạo thành sinh khối của chủng L 2 Đồ thị 3.11. Ảnh hưởng của nguôn cacbon đến sự tạo thành sinh khôi của chủng L 2 Đồ thị 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến sự tạo thành sinh khối của chủng L 2 Đồ thị 3.13. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng B Đồ thị 3.14. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng N 4 Đồ thị 3.15. Động thái quá trình tạo sinh khối trong điều kiện tối ưu của chủng L 2 Đồ thị 3.16. Tỷ lệ tiêu chảy giữa các lô thí nghiệm Đồ thị 3.17. Kết quả tăng trọng giữa các lô thí nghiệm Đồ thị 3.18. Hệ số tiêu tốn thức ăn giữa các lô thí nghiệm MỞ ĐẦU VK lactic được biết đến từ lâu với vai trò quan trọng đối với sức khoe con người cũng như các vật nuôi. Chúng có tác dụng cạnh tranh và đối kháng với các VSV gây bệnh, giúp cân bằng hệ VSV tự nhiên trong đường ruột, tiết các enzym tiêu hoa giúp tăng cường chuyển hoa thức ăn,... Ngoài ra, chúng còn làm giảm lượng cholesteron trong máu, chữa các bệnh rối loạn đường ruột, bệnh viêm dạ dày cấp tính và chống lại hiện tượng nhờn thuốc sau thời gian điều trị kháng sinh dài ngày, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng, ... [11]. Xuất phát từ cơ sở trên, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra nhiều chế phẩm sinh học khác nhau từ các VK lactic, chủ yếu là từ nhóm Lactobacillus, để bổ sung các vsv có lợi, nhằm tạo sự cân bằng cho hệ vsv đường ruột, mang lại sức khoe lâu bền cho vật nuôi. Hướng nghiên cứu này được gọi là vi trùng liệu pháp (bacteriotherapy) và các chế phẩm được sử dụng theo hướng chữa trị này được gọi là các chế phẩm probiotic. Hiện nay, bệnh đường ruột của heo con ở giai đoạn sau cai sữa đã ảnh hưởng đến năng suất nuôi và gây thiệt hại không nhỏ cho người nuôi. Việc sử dụng thuốc kháng sinh dài ngày để trị bệnh đường ruột cho heo sẽ tạo khả năng đề kháng với các chất kháng sinh của vsv gây bệnh. Vì vậy, việc phòng và trị bệnh bằng chế phẩm probiotic nhằm tăng cường khả năng tự đề kháng bệnh cho vật nuôi là cách làm có hiệu quả lâu dài và an toàn sinh học. Đây cũng chính là vấn đề mà các nhà nghiên cứu, người chăn nuôi đang hết sức quan tâm. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu là : "Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactỉc để sản xuất chế phẩm probiotic phòng và trị bệnh đường ruột cho heo”. Với mục tiêu : Nghiên cứu và sử dụng một số chủng VK lactic nhằm bổ sung vào bộ giống tạo chế phẩm phòng và trị bệnh đường ruột cho heo. Nội dung của đề tài bao gồm : - Tuyển chọn các chủng VK lactic có khả năng sinh axit lactic cao, có khả năng cạnh tranh và đối kháng với các vsv kiểm định, có khả năng đề kháng với các kháng sinh trị bệnh đường ruột của heo. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoa và phân loại các chủng VK lactic được tuyển chọn. - Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối tế bào của các chủng VK lactic được tuyển chọn. - Xác định tỷ lệ tổ hợp giống VK lactic trong chế phẩm. - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm probiotic trong phòng thí nghiệm. - Kiểm tra chất lượng chế phẩm. - Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trên heo con sau cai sữa. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về probiotic 1.1.1. Lược sử nghiên cứu probiotic Sự hiểu biết về probiotic của con người bắt nguồn từ sự hiểu biết về hệ VK đường ruột kháng bệnh ở người và vật nuôi. Khái niệm probiotic đầu tiên được mô tả như là hệ vsv trong thức ăn bổ sung cho người và vật nuôi. Năm 1925, Beach là người đầu tiên có những nghiên cứu thực nghiệm về thức ăn có chứa "Lactobacilius acidophilus" [46]. Năm 1965, thuật ngữ probiotic được đưa ra đầu tiên bởi Lilly và Stillwell, nhằm mô tả những vsv có khả năng kích thích sinh trưởng của một sô vật nuôi. Năm 1968, King đã nghiên cứu thành công trong việc kích thích sự tăng trưởng của heo bằng thức ăn có bổ sung Lactobacillus acidophilus [42], [46]. Năm 1989, Fuller (Anh) định nghĩa probiotic như là một thức ăn bổ sung vsv sống, có tác động có lợi đến vật chủ nhờ khả năng duy trì sự cân bằng hệ vsv đường ruột. Theo Lee (Singapore), Nomoto (Nhật), Salminen (Phần lan), Gorbach (Anh) (1999) thì “Probiotic là chế phẩm sinh học hay là thức ăn bổ sung có chứa tế bào VK sống hoặc những phần tử của VK mà nó ảnh hưởng có lợi cho sức khoe của vật chữ” [41], [42], [46]. 1.1.2. Thành phần và đặc điểm vi sinh vật được sử dụng trong probiotic Theo Lee, Nomoto, Salminen, Gorbach (1999), những VK lactic có lợi thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic như L. acidophilus, Lactobacillus deibrueckii subs, Lactobacillus casei, L. plantarum, L. bulgaricus, Bifidobacterium breve, Enterococcus faecium ... Theo Power và Moore (1994), trong probiotic ngoài các VK lactic có lợi còn có nấm men và nấm mốc như Saccharomyces cerevislae (nấm men), Aspergillus niger và Aspergillus oryzae (nấm mốc) Bảng 1.1 dưới đây giới thiệu một vài sản phẩm probiotic ở một số nước đã sử dụng VK lactic là nguồn vsv chính trong chế phẩm. Bảng 1.1. Sản phẩm probiotic ở một số nước [46], [56] Sản phẩm, nhà sản Chủng VK lactic xuất, xuất xứ sử dụng Chức năng Dạng sản phẩm Kích thích hệ thống miễn dịch Sữa lên men PAIGEN TWINU, L. bulgarỉcus L. CP-MEDI (Thái Lan) acidophilus Tăng cường sức khỏe Sữa lên men L. bulgaricus L. Tăng cường sức khỏe LCl,Nestlé (Mỹ, Pháp, L. bulgaricus Ý, Anh, Đức) L, ịohnsonìì Lactinex, Hynson (Mỹ) acidophilus Biol, Viện Sinh học L. acỉdophỉlus nhiệt đới TP. HCM (Việt Nam) Organic Green, Han L. acidophilus Poong (Nam Triều Tiên) Phòng chống các chứng rối loạn tiêu hoa, giảm tiêu hao thức ăn cho heo Phòng chống bệnh tiêu chảy cho heo Thuốc bột Bột Bột Các VK lactic trong chế phẩm probiotic có khả năng bám chặt vào màng nhầy của ruột, ức chế sự bám của vsv gây bệnh. Chúng sản xuất các axit lactic làm giảm pH đường ruột, tạo môi trường không thuận lợi cho vsv có hại phát triển. Ngoài ra, chúng còn sản xuất chất kháng sinh, sinh H 2 0 2 , sản xuất các enzym tiêu hoa (amylase, cellulase, lipase, protease), các vitamin (Bi, B 2 , B 6 , B 12 ), khử độc tố trong đường ruột [1], [42], [46]. Nấm men trong chế phẩm probiotic tạo ra sinh khối chứa axit amin, các vitamin nhóm B, hấp thu độc tố và bài thải ra ngoài. Chúng chuyển hoa glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các vsv có lợi hoạt động và sinh sản. Ngoài ra, chúng còn tiết các enzym tiêu hoa như amylase, protease,... Nấm mốc trong chế phẩm probiotic có vai trò tạo sinh khối chứa nhiều axit amin, sản xuất enzym amylase, protease nhằm làm tăng khả năng tiêu hoa thức ăn ở vật nuôi [1], [1 1], [42], [46]. 1.1.3. Cơ chê tác động của probiotic 1.1.3.1. Cạnh tranh và đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh Khi cung cấp thường xuyên các vsv có lợi dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô cho người và động vật với liều lượng thích hợp (1,2 tỉ CFU/ kg thức ăn/ ngày), chúng sẽ phát triển, chiếm ưu thế và cạnh tranh với các vsv có hại về vị trí bám, về hấp thu chất dinh dưỡng, về khối lượng các chất sinh ra bởi VSV[15],[41],[42],[46]. Chẳng hạn, khi cho heo Large White sử dụng L. fermentum 14 kết hợp với S. salivarius 312, sẽ làm giảm số lượng lớn E. coli trong dạ dày và tá tràng. Khi chỉ dùng L. fermentum 14, cũng có tác dụng làm giảm số lượng E. coli trong dạ dày [46]. 1.1.3.2. Sản xuất các chất kháng khuẩn Tiêu chuẩn quan trọng để chọn VK lactic sử dụng trong chế phẩm probiotic là khả năng tạo ra điều kiện bất lợi cho sự phát triển của VK gây bệnh. Tác nhân ức chế VK gây bệnh không chỉ là axit lactic mà còn bởi những chất ức chế đặc hiệu khác như axit hữu cơ, ethanol, H 2 0 2 , diacetyl, ...[11], [46], [48]. * Kháng khuẩn do sinh axit hữu cơ và ethanol Trong khi các VK lactic lên men đồng hình chủ yếu sần sinh axit lactic thì nhóm VK lactic lên men dị hình tạo ra cả những axit hữu cơ khác như axit acetic, axit formic, axit propionic, ... Những sản phẩm này làm giảm pH của môi trường và khi pH đạt đến một mức nào đó sẽ đủ để loại trừ những vsv gây hại trong đường ruột. Chẳng hạn như các vsv gây thối hỏng thực phẩm (B. subtilis, p. vulgaris, B. mensenterium, Clostridum), các vsv gây bệnh như E. coli (gây viêm ruột ở động vật non và trẻ em), Salmonella typhimurium, Salmonella cholerasuis (gây sốt thương hàn), ... Ngoài ra, một số VK lactic lên men dị hình còn tạo ra ethanol, có vai trò ức chế một số loài VK cạnh tranh, dù đó là sản phẩm chiếm tỉ lệ thấp trong quá trình lên men [1], [8], [l1], [15]. * Kháng khuẩn do sinh H 2 0 2 Một số chủng Lactobacillus như Lactococcus ỉactis, Leuconostoc cremoris có thể sản sinh H 2 0 2 (hydrogen peroxide) khi chuyển từ môi trường kị khí sang hiếu khí. Vì VK lactic không có catalase nên trong điều kiện có oxygen, chúng sẽ sinh ra H 2 O 2 . Năm 1951, Whater và đồng nghiệp đã chứng minh khả năng ức chế Staphylococus aureus của Lactobacillus lactis nhờ khả năng sinh ra H 2 0 2 [1], [l1]. * Kháng khuẩn do sinh diacetyl Diacetyl được sinh ra bởi nhiều loài VK lactic. Đây là chất có khả năng ức chế sự phát triển nhiều vsv gây bệnh. Hoạt tính ức chế này tăng lên trong môi trường axit, ức chế mạnh hơn đối với VK G" và nấm mốc, đặc biệt với M. turberculosis (VK gây bệnh lao). Tuy nhiên, nồng độ tối thiểu cổ tác dụng của chúng thường cao hơn mức thường thấy trong thực phẩm. Vì vậy, tác dụng của riêng diacetyl không thể giải thích cho khả năng kháng khuẩn của VK lactic [1], [l1]. 1.1.3.3. Kháng khuẩn do sinh bacteriocin Theo Maria E.c. Bruno và cộng sự : "Bacteriocin của VK lactic là các phân tử protein mang điện dương, kích thước nhỏ (từ 30 - 60 axit amin), trung tính, có điểm đẳng điện cao và có khả năng ức chế các VK có quan hệ chủng loại gần với chủng VK sinh bacteriocin đổ Bacteriocin của VK lactic thực sự là một phát hiện có giá trị trong bảo quản thực phẩm lên men cũng như không lên men. Bacteriocin thường có phổ kháng khuẩn hẹp. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy một số bacterỉocin có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng ức chế cả VK G+ và G. Bacteriocin của VK lactic được chia làm 3 nhóm : + Nhóm I : bao gồm những bacteriocin có khối lượng phân tử nhỏ hơn 30 Kdal, chịu nhiệt độ cao như lactacin từ L. Acidophilus 11088, pediocin PA-1 từ p, acidilactici. + Nhóm II : là những bacteriocin có khối lượng phân tử lớn hơn 30 Kdal, không bền nhiệt, mất hoạt tính khi xử lý ở 100°c trong 30 phút như helveticin J từ L. helveticus, lactacin B từ L. acidophilus N2. + Nhóm HI : bao gồm các polypeptit chứa axit amin dị thường lanthionin nhưnisin [41], [42], [45], [46]. * Cơ chê tác động của bacteriocin Bacteriocin gây ra hiện tượng suy yếu hoặc phá vỡ lực đẩy proton (PMF : proton motive force) trong các bào quan sinh năng lượng như liposome và trong toàn bộ tế bào của vsv nhạy cảm với bacteriocin đó. Lực đẩy proton đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi năng lượng của tế bào nên sự phá vỡ hoặc làm suy giảm lực này sẽ dẫn đến tình trạng thiếu hụt ATP trong tế bào, khả năng vận chuyển các chất dinh dưỡng cũng như duy trì các cofactor như K+, Mg2+ bị ức chế và cuối cùng dẫn đến giết chết tế bào vsv nhạy cảm với bacteriocin đó. Cơ chế tác động của bacteriocin có thể tóm tắt như sau : bacteriocin được hút bám trên màng tế bào vsv nhạy cảm với nó, tác động lên màng tế bào này và làm giảm thế năng của màng nguyên sinh chất, gây những thương tổn không thể khắc phục được. Sau đó, bacteriocin dễ dàng xâm nhập vào tế bào, làm thay đổi pH nội bào, dẫn đến phá vỡ hoặc làm suy giảm động lực proton, đồng thời gây ra sự thoát các axit amin tiền tích tụ trong tế bào và các thành phần nội chất khác của tế bào ra ngoài môi trường thông qua các lỗ thủng trên màng tế bào. Cuối cùng, tế bào chết do mất năng lượng [41], [42], [46], [48]. Bảng 1.2. Một số bacíeriocin do VK lactic sinh ra [46] 1.1.3.4. Điều hòa phản ứng miễn dịch Probiotic có thể ảnh hưởng lên lympho bào B. Chẳng hạn, khi cho chuột sử dụng L. plantarum ATCC 14917 và L. fermentum YIT 0159, chúng sẽ kích thích sự đồng hoa 3H-thymidine trong tế bào lách ở chuột. Chúng cũng có thể tăng cường bổ thể và kháng huyết thanh ở thỏ. Điều này chứng tỏ chúng kích thích hoạt động trên lympho bào B của tế bào lách [41], [46]. 1.1.3.5. Tăng cường hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn đường ruột Khi chúng ta sử dụng L. rhamnosus dưới dạng sữa lên men, sẽ kích thích hoạt động enzym của VK đường ruột và khả năng biến dưỡng của VK đường ruột [41], [46]. 1.1.3.6. Cân bằng hệ vi khuẩn trong ruột người Khi cho bệnh nhân rối loạn dạ dày, ruột sử dụng L. acidophilus, B. bifidum và B. breve sẽ làm gia tăng số lượng của Lactobacillus và giảm số lượng của E. coli trong ruột. Còn khi cho bệnh nhân bệnh bạch cầu sử dụng Bifidobacterium sp. và L. acidophilus, hệ VK đường ruột và nấm men sẽ được phục hồi. Vì khi sử dụng thuốc chữa trị bệnh bạch cầu sẽ làm chết một số vsv có lợi trong đường ruột [46]. 1.1.4. Vai trò của probiotic Hiện nay trên thế giới có nhiều loại chế phẩm được bào chế từ các chủng vsv sống, chúng được chế biến dưới nhiều dạng khác nhau như dạng lỏng, dạng đông khô, dạng viên nén,... Mục đích chung của các chế phẩm này là tăng cường sức khỏe, chống bệnh tật, nhất là phòng và trị các bệnh về đường tiêu hóa. Trên cơ sở đó, người ta hướng vào việc phân lập và chọn chủng vsv đưa vào đường tiêu hóa nhằm khôi phục lại sự hoạt động bình thường của hệ vsv ở đó [15], [41], [46]. 1.1.4.1. Vai trò của probiotic đối với sức khỏe con người a. Phòng ngừa, chữa trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng vi khuẩn ở dạ dày, ruột Những trẻ em bị nhiễm Rotavirus sẽ bị tiêu chảy do Rotavirus nhân đôi trong tế bào hình trụ, làm cho phần đỉnh của nhung mao bị bào mòn dẫn đến một phần màng nháy của ruột bị phá hủy. Nghiên cứu cho thấy sử dụng Lactobacillus acidophỉlus và L. reuteri sẽ làm giảm 1/2 số trẻ bị nhiễm và giúp tăng cường hệ thống miễn dịch IgA của cơ thể (IgA là kháng thể sản sinh nhờ tế bào B trong niêm mạc ruột, đường hô hấp và thực hiện chức năng chống VK trên bề mặt niêm mạc) ...[l1], [41], [46]. Khi sử dụng Lactobacilius rhamnosus dưới dạng sữa lên men hoặc dạng đông khô thì khoảng 95% trẻ em được sử dụng sẽ giảm thời gian tiêu chảy trong 1 ngày. Anh hưởng của Lactobacillus rhamnosus rõ ràng sau ngày đầu tiên chữa trị. Bệnh nhân khi dùng Lactobacillus rhamnosus sẽ ít nôn mửa hơn là dùng các chế phẩm khác mà không có VK lactic. Bệnh nhân sẽ không còn tiêu ra máu sau ngày thứ hai chữa trị [41], [42], [46]. b. Ảnh hưởng lên sự tiêu hóa lactose và protein trong sữa Trong cơ thể, đường lactose dưới tác dụng của enzym p-galactosidase sẽ bị phân giải thành glucose và galactose. Các loại đường này sẽ dễ dàng được hấp thu qua ruột non vào máu. Khi thiếu hệ thống enzym này đường lactose không được tiêu hóa sẽ được chuyển xuống ruột già. Tại đây, lactose sẽ bị tấn công bởi những VK đường ruột dẫn đến hội chứng tiêu chảy, đầy hơi, đau bụng. Điều này gây bất lợi cho việc tiêu hóa sữa. Nhưng nếu thay sữa bằng sữa lên men, lượng lactose sẽ giảm đi, đồng thời enzym Pgalactosỉdase được tăng cường bởi VK lactic, sẽ làm giảm đi những triệu chứng của bệnh này. Vì vậy, sự hấp thu lactose ở những người sử dụng yaourt tốt hơn những người sử dụng sữa [41], [42], [46]. c. Phòng và trị một số bệnh khác Khảo sát trên 34 bệnh nhân táo bón sử dụng BBG (chủng B. breve của Yakult) kết hợp với TOS (Transgalactosyl Oligosaccharide). Kết quả là có 19 bệnh nhân khỏi bệnh (56%) [41], [46]. Sử dụng yaourt với liều lượng thích hợp, hàm lượng cholesterol trong cơ thể sẽ giảm. Ảnh hưởng này xuất hiện chậm và kéo dài khoảng 6 ngày sau khi ngừng sử dụng yaourt. Cơ chế này có liên quan đến sự tổng hợp protein điều hòa. Tác nhân này có thể là hydroxymethyl glutarate [41], [46]. Đối với một số bệnh nhân bị các bệnh về gan mãn tính. Có thể sử dụng L. acidophilus để cải thiện tình trạng bệnh của họ [41], [42]. Những bệnh nhân nhiễm trùng đường hô hấp và đường niệu thường có hàm lượng cao Candida ở trong phân (l05tế bào/g phân). Khi bệnh nhân uống Bifidobacterium, hàm lượng Candida sẽ giảm đáng kể và sự nhiễm trùng cũng giảm [41], [42], [46]. Các VK lactic trong chế phẩm probiotic còn có khả năng kháng các tác nhân gây ung thư thông qua việc làm giảm các enzym nitroreductase, azoreductase là những tác nhân hoạt hóa chất tiền ung thư thành chất gây ung thư [l1], [46]. Khi cho bệnh nhân ung thư cổ tử cung và bệnh nhân ung thư bàng quang sử dụng L. casei Shirota với một liều thích hợp, chúng sẽ giúp tăng cường thoái hóa khối u trong sự điều trị phóng xạ, giúp kéo dài sự sống, ngăn chặn giảm bạch cầu trong thời gian chữa trị, ngăn chặn sự tái trở lại của khối u [41], [46], [48]. Bên cạnh đó, probiotic còn có khả năng ngăn chặn bệnh tiểu đường và bệnh cao huyết áp. Kết quả nghiên cứu trên chuột cho thây, khi cho chuột sử dụng L. casei sẽ làm giảm tỷ lệ tiểu đường của chuột ; nhưng L. casei (LEx) không ảnh hưởng trên chuột bình thường [46]. Tóm lại, VK lactic trong chế phẩm probiotic được sử dụng để kiểm soát hầu hết các chứng rối loạn đường ruột, chứng không dung nạp lactose, chứng viêm ruột cấp tính do Rotavirus. Probiotic còn giúp ngăn cản sự phát triển của các mầm bệnh trong ruột, làm giảm hậu quả do điều trị phóng xạ, trị táo bón, ... Đó là những bệnh liên quan đến sự mất cân bằng của hệ VK đường ruột và các mức độ viêm niêm mạc ruột làm cho tính thấm của ruột tăng. Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy VK lactic còn có khả năng làm giảm lượng cholesterol trong máu, chữa những bệnh về gan và sự nhiễm trùng đường niệu, kéo dài sự sống cho những bệnh nhân ung thư, đồng thời tạo ra các thức ăn bổ sung khoáng, vitamin cho người bệnh, cho những người ăn kiêng,... Hình 1.1. Tác động của probiotic trong điều trị các chứng rối loạn đường tiêu hóa (Salminen, 1998) 1.1.4.2. Vai trò của probiotic đối với vật nuôi a. Cải thiện tỷ lệ tăng trưởng và hệ số chuyển hóa thức ăn Sử dụng probiotic trong chăn nuôi gia súc và gia cầm sẽ làm tăng hiệu quả kinh tế cho người sản xuất. Phần lớn chế phẩm probiotic đều bao gồm một hay nhiều chủng VK latic có chức năng cải thiện khu hệ VSV đường ruột, nâng cao chất lượng sản phẩm, tận dụng thức ăn, … Nghiên cứu sử dụng probiotic trên heo con 4 tuần tuổi và heo trưởng thành với 4 lô thí nghiệm. Kết quả thu được thật đáng khích lệ Bảng 1.3. Ảnh hưởng probiotic và axit lactic trên heo con và heo trưởng thành