Tài liệu nghiên cứu sự lưu hành và đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (pcv2) ở lợn nuôi tại việt nam tt

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM HỒNG QUÂN NGHIÊN CỨU SỰ LƯU HÀNH VÀ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH: DỊCH TỄ HỌC THÚ Y MÃ SỐ: 9 64 01 08 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội, 2019 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Huỳnh Thị Mỹ Lệ Người hướng dẫn khoa học 2: PSG.TS. Phạm Công Hoạt Phản biện 1: GS.TS. Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại Học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Hữu Nam Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS. Bùi Nghĩa Vượng Viện Thú y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi …. giờ …. ngày….. tháng …. năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi lợn nói riêng đang ngày càng phát triển và chiếm vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp nước ta. Cùng với các tiến bộ kỹ thuật về giống, thức ăn, quản lý, thú y kết hợp với các biện pháp khuyến khích chăn nuôi của nhà nước làm cho ngành chăn nuôi lợn phát triển với tốc độ tương đối cao, mang lại hiệu quả kinh tế cho người dân đồng thời góp phần vào nền kinh tế quốc gia. Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn cũng có nhiều thách thức đó là sự gia tăng và diễn biến ngày càng phức tạp của dịch bệnh, trong đó Hội chứng bệnh do PCV2 được coi là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Tại Việt Nam, Hội chứng còi cọc ở lợn con sau cai sữa xuất hiện đầu tiên vào năm 2000 và gây ra những ảnh hưởng đáng kể cho ngành chăn nuôi lợn. Tuy nhiên các nghiên cứu về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số mầm bệnh khác đến nay còn hạn chế và mới chỉ tập trung theo vùng, miền. Xuất phát từ các vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm làm rõ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus trong điều kiện sản xuất thực tế của các cơ sở chăn nuôi lợn xuyên suốt ở cả ba miền Bắc – Trung – Nam trên cả nước. Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới và đề ra các biện pháp phòng chống bệnh do PCV2 có hiệu quả, nhất là công tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn nuôi trong nước. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI - Xác định sự lưu hành và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. - Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN, ARN virus ở lợn nuôi tại Việt Nam. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Mẫu được thu thập từ các trại nuôi lợn thuộc 14 tỉnh nghiên cứu đại diện 1 cho ba miền Bắc – Trung – Nam ở Việt Nam bao gồm: Thái Nguyên, Hà Nội, Hòa Bình, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Phòng, Hải Dương, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình Dương, Tiền Giang và Vĩnh Long. Thời gian thực hiện từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 6 năm 2018. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Xác định được tỷ lệ lưu hành và bổ sung đầy đủ thêm bức tranh dịch tễ về virus PCV2 đang lưu hành tại Việt Nam. - Đánh giá được sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus (PPV, TTV, PRRS, PCV3) ở lợn nuôi tại Việt Nam. - Trong quá trình thực hiện đề tài đã xác định thêm được sự lưu hành của loài virus mới PCV3 ở lợn nuôi tại Việt Nam. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học - Đây là một trong những nghiên cứu có hệ thống về sự lưu hành, đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus ở lợn nuôi tại Việt Nam. - Đây là nghiên cứu mới về Porcine circovirus 3 (PCV3), một loài virus mới lưu hành của ở đàn lợn nuôi tại Việt Nam. - Kết quả nghiên cứu của đề tài là tài liệu tham khảo tốt phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo về PCV. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn - Khuyến cáo cho việc sử dụng vắc xin phòng bệnh phù hợp với nhánh virus mới lưu hành trong thực tế ở mỗi khu vực nghiên cứu. - Kết quả nghiên cứu của đề tài giúp chủ động đề xuất được biện pháp phòng PCVAD có hiệu quả, hạn chế thiệt hại do dịch bệnh gây ra bởi PCV2 cho đàn lợn nuôi tại Việt Nam. - Trên cơ sở phát hiện của đề tài về một loài virus mới PCV3, mở ra hướng nghiên cứu sâu hơn về đánh giá sự lưu hành, cũng như vai trò gây bệnh và tác động của PCV3 tới sức sản xuất của đàn lợn để đưa ra các giải pháp phòng, chống có hiệu quả. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI LỢN TẠI VIỆT NAM Ngành chăn nuôi lợn của Việt Nam chủ yếu là chăn nuôi nhỏ lẻ ở qui mô hộ gia đình, môi trường chăn nuôi không đảm bảo vệ sinh thú y, phong tục tập quán của người Việt Nam mang nhiều yếu tố nguy cơ làm phát sinh và lây lan dịch bệnh ở lợn như: sử dụng thịt lợn tươi sống là chủ yếu, giết mổ nhỏ lẻ tại hộ gia đình, sử dụng cả thịt lợn mắc bệnh, buôn bán lợn nhỏ lẻ không qua kiểm dịch thú y, chăn nuôi lợn tận dụng nguồn thức ăn thừa từ các nhà hàng,... nên nhiều loại dịch bệnh ở lợn, trong đó có Hội chứng bệnh do PCV2 có thể tồn tại, lưu hành trong thời gian dài. 2.2. BỆNH DO PCV2 GÂY RA Ở LỢN NUÔI 2.2.1. Giới thiệu về PCV2 2.2.1.1. Phân loại PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae. Họ circoviridae gồm 2 giống: Giống Anellovirus, Giống Circovirus. 2.2.1.2. Hình thái, cấu trúc PCV mang bộ gen là ADN virus sợi đơn vòng chứa khoảng 1759 nucleotide (PCV1) và khoảng 1767 - 1768 nucleotide (PCV2). 2.2.1.3. Sức đề kháng PCV2 có khả năng sống được 15 phút ở nhiệt độ 70oC, bị bất hoạt ở pH= 3. Ở nhiệt độ phòng, khi bị tác động trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formaldehyde, iodine, vikon và cồn thì hiệu giá của virus giảm. 2.2.2. Dịch tễ học của bệnh do PCV2 2.2.2.1. Loài cảm thụ Tất cả các giống lợn đều mẫn cảm với bệnh, kể cả lợn nuôi và lợn hoang dã. 2.2.2.2. Chất chứa mầm bệnh Mầm bệnh có trong dịch bài xuất, bài tiết và trong huyết thanh, virus còn có thể bài thải qua tinh dịch, phân, nước tiểu, sữa non, sữa từ lợn nhiễm bệnh. 2.2.2.3. Phương thức truyền lây Sự lây lan của PCV2 từ lợn sang lợn, từ người sang lợn, từ động vật gặm nhấm sang lợn, từ ký sinh trùng sang lợn, từ môi trường chuồng trại sang lợn. Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua đường miệng - mũi. 3 2.2.3. Cơ chế sinh bệnh PCV2 gây suy giảm miễn dịch dẫn tới tác động đáng kể lên sức sản xuất ở lợn, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập và gây bệnh. 2.2.4. Triệu chứng và bệnh tích ở lợn mắc PCV2 2.2.4.1. Triệu chứng lâm sàng Hiện tượng xác gầy và sưng ở các hạch lympho, còi cọc, lông thô, khô xơ xác, ngoài ra có một tỷ lệ lớn lợn có triệu chứng về hô hấp và bị ỉa chảy. 2.2.4.2. Bệnh tích Hiện tượng sưng và xuất huyết ở các hạch lympho; ngoài ra, các tổn thương còn biểu hiện ở một số cơ quan như phổi có biểu hiện viêm ở các mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết. 2.2.5. Một số hội chứng ở lợn có liên quan đến sự nhiễm PCV2 Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa, Hội chứng viêm da và viêm thận, Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn, Hội chứng rối loạn hô hấp ở lợn, Hội chứng viêm ruột ở lợn, Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng. 2.2.6. Chẩn đoán Chẩn đoán lâm sàng, Chẩn đoán phân biệt, Chẩn đoán huyết thanh học, Chẩn đoán sinh học phân tử. 2.2.7. Phòng bệnh Thay đổi phương thức chăn nuôi, áp dụng các biện pháp an toàn sinh học, chuồng trại đảm bảo vệ sinh thú y, lợn mua về cần được kiểm dịch và chăm sóc nuôi dưỡng tốt. Phòng bệnh bằng vắc xin. 2.2.8. Điều trị Bệnh do virus nên không có thuốc điều trị đặc hiệu. 2.3. HIỆN TƯỢNG ĐỒNG NHIỄM DO PCV2 GÂY RA Trong thực tế có nhiều giả thuyết được đưa ra nhằm giải thích tại sao có nhiều căn nguyên kết hợp cùng với PCV2 trong hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa. Trước hết, có thể một số mầm bệnh có cùng cơ chế sinh bệnh gây ảnh hưởng đến hệ miễn dịch của cơ thể, khiến cho lợn nhiễm PCV2 có triệu chứng của PMWS (Darwich et al., 2003). Opriessnig et al. (2007) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong đàn có thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 – 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng. Có bốn yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là 4 cấu trúc và độc lực virus, giống lợn, sự đồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của cơ thể. Thử nghiệm lâm sàng đã chứng minh trong điều kiện thực nghiệm một mình PCV2 không gây bệnh mà kết hợp với một số virus như PRRS, PPV, TTV mới gây bệnh thể lâm sàng. Trong hầu hết các trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ khi được gây nhiễm đồng thời với một số mầm bệnh truyền nhiễm hoặc không truyền nhiễm (Rovira et al., 2002). Do đó PCV2 được coi là điều kiện cần nhưng chưa đủ để gây thành bệnh (Tomás et al., 2008). 2.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ PCV2 2.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới PCV2 được phát hiện năm 1991 tại Canada nhưng kết quả nghiên cứu của Jacobsen et al. (2009) khẳng định sự tồn tại của PCV2 ở lợn từ năm 1962 tại miền Bắc nước Đức. PCV2 có 4 genotype chính (PCV2a, PCV2b, PCV2c và PCV2d) và 8 nhánh di truyền (cluster) 2A-2E và 1A-1C được công nhận. PCV2b chủ yếu được phát hiện kể từ năm 2003. Điểm đặc biệt trong cơ chế sinh bệnh của PCV2 là hiện tượng đa nhiễm hoặc bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác. Các nghiên cứu cho thấy yếu tố đồng nhiễm như nhiễm đồng thời với các tác nhân gây bệnh liên quan đến sự phát triển của PCVAD (Hasslung et al., 2005; Opriessnig et al., 2012). 2.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Bằng chứng huyết thanh học cho thấy sự xuất hiện của PCV2 vào năm 2000 (Nguyễn Thị Thu Hồng và cs., 2006). Từ đó đến nay, các nghiên cứu về PCV2 được thực hiện đều khẳng định sự hiện diện và nguy cơ ngày càng lan rộng của PCV2 ở mọi quy mô chăn nuôi lợn. Tuy nhiên, các nghiên cứu mới chỉ tập trung theo vùng, miền (miền Bắc, miền Trung hoặc miền Nam), chưa có nghiên cứu nào thực hiện để làm rõ sự lưu hành và cập nhật về đặc điểm dịch tễ học phân tử, sự đồng nhiễm của PCV2 xuyên suốt ở cả 3 miền Bắc – Trung - Nam trên cả nước. Đề tài được thực hiện với mục đích làm sáng tỏ về sự lưu hành, hoàn thiện bức tranh về đặc điểm dịch tễ học phân tử và sự đồng nhiễm của PCV2 với một số virus ở lợn nuôi xuyên suốt tại ba miền Bắc – Trung – Nam của Việt Nam. Kết quả của đề tài là cơ sở khoa học quan trọng mở ra hướng nghiên cứu mới và công tác lựa chọn chủng virus phù hợp trong sản xuất vắc xin phòng bệnh cho đàn lợn trong nước. 5 PHẦN 3 NỘI DUNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Mẫu được lấy tại các trại chăn nuôi lợn thuộc 14 tỉnh tại Việt Nam. - Nghiên cứu được tiến hành tại khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; cùng với sự giúp đỡ của Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương. - Giải trình tự gen được thực hiện tại Công ty 1st BASE, Singapore. 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 6 năm 2015 đến tháng 3 năm 2019. 3.3. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Mẫu nghiên cứu được thu thập ở cả lợn ốm và lợn khỏe bình thường. - Các loại dụng cụ, sinh phẩm và hóa chất dùng: tách chiết ADN/ARN tổng số, phản ứng PCR/ Realtime PCR và giải trình tự gen. 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Xác định sự lưu hành của PCV2 ở lợn nuôi tại Việt Nam. - Xác định đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 lưu hành ở lợn nuôi tại Việt Nam. - Xác định sự đồng nhiễm của PCV2 với một số ADN virus (TTV, PPV, PCV3) và ARN virus (PRRS) ở lợn nuôi tại Việt Nam. 3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp tính toán dung lượng mẫu Để phát hiện tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn nuôi, thiết kế lấy mẫu bệnh phẩm nghiên cứu bằng phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên đơn giản, nhiều giai đoạn để thu thập mẫu bao gồm các tầng/giai đoạn như sau: Tính số lượng mẫu ở từng cấp độ, sử dụng công thức sau:   1    e2 Trong đó: n1: Số cơ sở/mẫu cần lấy; P: Là tỷ lệ lưu hành ước tính (dựa vào số liệu tổng quan các nghiên cứu từ năm 2000 – 2018 đã tổng hợp được tỷ lệ lưu hành ước tính ở từng cấp độ); z = 1.96, tương đương với độ tin cậy 95%; e = Sai số tuyệt đối giữa giá trị ước tính so với mức độ lưu hành thực tế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn sai số (e) = 10%. Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu được trình bày ở bảng 4.1. n1  z 2  6 Bảng 4.1. Tổng hợp tình hình lấy mẫu nghiên cứu TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Tỉnh Số xã cần lấy mẫu Bắc Ninh Hải Dương Hòa Bình Hà Nội Hải Phòng Hưng Yên Thái Nguyên Hà Tĩnh Quảng Trị Huế Quảng Nam Bình Dương Tiền Giang Vĩnh Long Tổng số (a) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 70 Số cơ sở cần lấy mẫu/1 xã (b) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 70 Số mẫu cần lấy/1 cơ sở (c) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 70 Tổng số mẫu xét nghiệm Mẫu gộp thí nghiệm 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 125 1.750 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 350 Ghi chú: (a) Giai đoạn 1: lựa chọn số xã; (b) Giai đoạn 2: lựa chọn số cơ sở nuôi; (c) Giai đoạn 3: tính số mẫu cần lấy. Tổng số mẫu xét nghiệm = Số xã cần lấy mẫu x Số cơ sở cần lấy mẫu/1 xã x số mẫu cần lấy/1 cơ sở. Với đặc điểm chăn nuôi lợn nhỏ lẻ chiếm đa số (trên 70%, theo số liệu thống kê của các tỉnh), do đó để tăng cơ hội phát hiện được bệnh, chúng tôi quyết định tại mỗi xã, lấy 25 mẫu tại 05 cơ sở, hộ chăn nuôi lợn, mỗi hộ tiến hành lấy 05 mẫu đủ để gộp thành 01 mẫu xét nghiệm. 3.5.2. Phương pháp điều tra hồi cứu Khi giải trình tự gen và phân tích cây phát sinh loài của virus PCV2, điều tra ngược lại các mẫu đã được xét nghiệm trong phòng thí nghiệm. 3.5.3. Phương pháp thu thập mẫu Sử dung phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu dịch hầu họng và mẫu phủ tạng. 3.5.4. Phương pháp chiết tách ADN/ARN Sử dụng bộ kit TacoTM DNA/RNA Extraction Kit, máy chiết tách nucleic acid tự động TacoTM và theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 7 3.5.5. Phương pháp Realtime PCR Áp dụng theo phương pháp Realtime PCR của Trung tâm chẩn đoán Thú y Trung ương đã được công nhận ISO/IEC 17025:2005. 3.5.6. Phương pháp PCR Sử dụng kít PCR thương mại (i-StarMaster) và theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Đối với sản phẩm PCR phục vụ giải trình tự gen (nhân lên bởi cặp mồi CV1/CV2, CV3/CV4), sản phẩm PCR được tinh sạch bằng sạch bằng QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen). 3.5.7. Phương pháp giải trình tự và hoàn thiện trình tự gen Thực hiện tại công ty 1st BASE (Singapore). 3.5.8. Phương pháp phân tích trình tự gen Sử dụng Chương trình MEGA 6 để dựng cây phát sinh chủng loại. 3.5.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại Sử dụng phần mềm MEGA6 để xây dựng cây phả hệ được dựa trên trình tự gen mã hóa capsid protein (gen ORF2). 3.5.10. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học phân tử theo không gian - thời gian Sử dụng các phần mềm Quantum GIS, phần mềm BEAST, SpreaD3. 3.5.11. Phương pháp đo lường tính đa dạng về di truyền Sử dụng phương pháp Principal Coordinate Analysis (PCoA). 3.5.12. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý bằng phần mềm MS Excel 2010; so sánh sự sai khác giữa các yếu tố bằng phép thử χ2 (phần mềm Minitab 14.0) và phép thử Fisher Exact Test (phần mềm SAS 9.1). PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. SỰ LƯU HÀNH PCV2 Ở LỢN NUÔI TẠI VIỆT NAM 4.1.1. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành PCV2 theo địa phương Nghiên cứu này đã lấy mẫu để nghiên cứu sự lưu hành PCV2 đồng thời ở ba miền Bắc - Trung - Nam và trong khoảng thời gian từ 2015-2018 được trình bày ở hình 4.1 và bảng 4.1. 8 A 2006 B 2012 C 2015 D 2018 E 2018 F 2015-2018 Phạm vi lấy mẫu của các nghiên cứu trước đây: (A) Nguyễn Thị Thu Hồng và cs. (2006), (B) Huỳnh Thị Mỹ Lệ và cs. (2012), (C) Bùi Trần Anh Đào và cs. (2015), (D) (Phạm Hoàng Sơn Hưng và cs. (2018), (E) Lê Thị Thu Phương và cs. (2018). Phạm vi lấy mẫu của đề tài này (F). Hình 4.1. Kết quả so sánh về phạm vi lấy mẫu phát hiện PCV2 Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở lợn nuôi tại 14 tỉnh đại diện cho ba miền Bắc – Trung – Nam được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.2. Bảng 4.1. Kết quả xác định sự có mặt của PCV2 từ các địa phương TT Tỉnh 1 Bắc Ninh 2 Hải Dương 3 Hòa Bình 4 Hà Nội 5 Hải Phòng 6 Hưng Yên 7 Thái Nguyên 8 Hà Tĩnh 9 Quảng Trị 10 Thừa Thiên Huế 11 Quảng Nam 12 Bình Dương 13 Tiền Giang 14 Vĩnh Long Tổng hợp Số mẫu xét nghiệm 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 350 Số mẫu dương tính 8 6 10 22 4 8 5 13 14 9 13 11 14 7 144 9 Tỷ lệ (%) dương tính (95%CI) 32,00 (14,95 – 53,50) 24,00 (9,36 – 45,13) 40,00 (21,13 – 61,33) 88,00 (68,78 – 97,45) 16,00 (4,54 – 36,08) 32,00 (14,95 – 53,50) 20,00 (6,83 – 40,70) 52,00 (31,31 – 72,20) 56,00 (34,93 – 75,60) 36,00 (17,97 – 57,48) 52,00 (31,31 – 72,20) 44,00 (24,40 – 65,07) 56,00 (34,93 – 75,60) 28,00 (12,07 – 49,39) 41,14 Hình 4.2. Tỷ lệ dương tính với PCV2 tại các địa phương thu mẫu Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở Việt Nam là 41,14%. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra PCV2 lưu hành ở tất cả các tỉnh nghiên cứu (14/14) với tỷ lệ không nhỏ dao động từ 16% - 88%, trong đó tỷ lệ mẫu kiểm tra dương tính với PCV2 cao nhất ở Hà Nội là 88%, thấp nhất ở Hải Phòng là 16%. 4.1.2. Kết quả xác định sự lưu hành PCV2 theo quy mô chăn nuôi Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 theo quy mô đàn được trình bày ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn theo các quy mô chăn nuôi Số mẫu Tỷ lệ (%) dương tính Quy mô đàn Tổng số mẫu kiểm tra dương tính (95%CI) (con) 1 <100 con 110 46 41,82 (32,48 – 51,61) 2 100 - 300 62 17 27,42 (16,85 – 40,23) 3 300 - 500 98 43 43,88 (33,87 – 54,27) 4 >500 80 38 47,50 (36,21 – 58,98) Tổng hợp 350 144 41,14 Ở các đàn lợn nuôi có quy mô khác nhau thì tỷ lệ dương tính với PCV2 khác nhau, cụ thể những đàn lợn có quy mô lớn hơn 500 con thì tỷ lệ dương TT tính trung bình là 47,50%, tỷ lệ dương tính thấp nhất ở quy mô 100-300 con là 27,42%. Ở những trại có mức quy mô đàn phổ biến từ 300 – 500 con và nhỏ hơn 100 con thì tỷ lệ lưu hành PCV2 khá cao, lần lượt trung bình là 43,88% và 41,82%. Tuy tỷ lệ dương tính với PCV2 giữa các quy mô đàn có 10 vẻ khác nhau lớn nhưng kiểm định χ2 cho biết trên phương diện thống kê, các tỷ lệ này không khác nhau vì trị số p = 0,4085 > 0,05. 4.1.3. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở đàn lợn thuộc các lứa tuổi Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 của lợn ở các lứa tuổi khác nhau được trình bày ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả xác định tỷ lệ lưu hành PCV2 ở các lứa tuổi lợn Tỷ lệ (%) dương tính Tổng số mẫu Số mẫu TT Nguồn gốc mẫu kiểm tra dương tính (95%CI) 96 38 39,58 (29,75 – 50,08) 1 Lợn con theo mẹ 2 Lợn thịt 186 84 45,16 (37,87 – 52,61) 3 Lợn nái 68 22 32,35 (21,51 – 44,79) 144 41,14 Tổng hợp 350 Mẫu bệnh phẩm lợn dương tính với PCV2 ở bất cứ nhóm tuổi nào, tỷ lệ dương tính thấp nhất là lợn nái đạt 32,35%; thấp hơn so với hai lứa tuổi lợn con theo mẹ và lợn thịt lần lượt là 39,58% và 45,16%. Tuy tỷ lệ dương tính với PCV2 ở các lứa tuổi lợn có vẻ khác nhau lớn nhưng kiểm định χ2 cho biết trên phương diện thống kê, các tỷ lệ này không khác nhau vì trị số p = 0,4704 > 0,05. 4.1.4. Kết quả nghiên cứu sự lưu hành của bệnh do PCV2 gây ra Kết quả theo dõi triệu chứng lâm sàng của một số lợn nghi mắc PMWS trong quá trình thu mẫu tại các địa phương như còi cọc, chậm lớn, lông thô, triệu chứng hô hấp, tiêu chảy và viêm da được ghi nhận. Trong quá trình thu mẫu, một số lợn nghi mắc PMWS được mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể. Kết quả cho thấy nhìn chung hiện tượng sưng to và phân thùy ở các hạch lympho (đặc biệt hạch bẹn nông và hạch màng treo ruột) là phổ biến. Ngoài ra, các tổn thương còn biểu hiện ở một số cơ quan như phổi có biểu hiện viêm ở các mức độ khác nhau, gan, thận, ruột, lách xuất huyết. 4.2. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PCV2 Đến thời điểm hiện tại, các nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 ở Việt Nam mới tập trung theo vùng miền nhất định. Nhằm có kết luận một cách toàn diện về đặc điểm di truyền cũng như đặc điểm dịch tễ học phân tử của PCV2 lưu hành trên lãnh thổ Việt Nam, nghiên cứu này đã tiến hành giải trình tự gen của PCV2 tại 3 miền Bắc- Trung- Nam. Kết quả nghiên cứu cũng cung cấp cơ sở khoa học cho việc lựa chọn chủng PCV2 trong nghiên cứu vắc 11 xin và đánh giá hiệu quả của vắc xin trong phòng chống PMWS ở lợn. 4.2.1. Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 Kết quả 14 trình tự gen được xác định và công bố tại Genbank được ký hiệu: MH470219, MH470220, MH470221, MH470222, MH470223, MH470224, MH470225, MH470226, MH470227, MH470228, MH470229, MH470230, MH470231, MH470233. 4.2.2. Phân loại genotype PCV2 lưu hành ở Việt Nam Để có cơ sở đối chiếu và so sánh, nghiên cứu này cũng thu thập và phân tích trình tự gen PCV2 của Việt Nam đã được công bố trước đây, chúng tôi sử dụng các trình tự gen của 20 tỉnh, thành phố đại diện cho cả ba miền Bắc – Trung – Nam, gồm trình tự gen được xác định trong nghiên cứu này (hình 4.3). Việt Nam 2016 2013 2011, 2012, 2014, 2016 2009, 2011, 2016 PCV2b: 1A/1B PCV2b: CRF B 100% 2004, 2008, 2009, 2010, 2011,2013 82,94% 2012, 2014, 2015, 2016, 2017 PCV2d 2011, 2013, 2015 2008 99,98% 99,98% PCV2a: 2A-2E PCV2c PCV1 A (A) Để dễ quan sát, các vị trí có chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam được đánh dấu bằng màu xanh, đi kèm năm phân lập.Giá trị bootstrap ở mỗi nút (node) được hiển thị cho cách phân nhánh chính. Trình tự gen ORF2 của PCV1 được dùng làm outgroup. (B) Sơ đồ đính kèm đánh dấu 20 tỉnh (màu vàng cam) có mẫu được phân tích. Hình 4.3. Cây phát sinh chủng loại của các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam 12 4.2.3. Tính đa dạng di truyền của PCV2 lưu hành ở Việt Nam Đa dạng di truyền còn được thể hiện trực quan bằng phân tích PCoA (hình 4.4). Trên trục tọa độ hình chiếu 1 (coordinate 1), PCV2b: CRF được đánh giá gần gũi về mặt di truyền với PCV2d và khác biệt rõ với PCV2b: 1A/1B. Trên trục tọa độ hình chiếu 2 (coordinate 2), PCV2d được đánh giá gần gũi về mặt di truyền với PCV2b: 1A/1B và khác biệt rõ với PCV2b: CRF. Phân tích PCoA còn cho thấy các chủng PCV2 lưu hành ở Việt Nam từ 2004 đến 2017, tại 20 tỉnh/ thành phố phân chia thành 3 nhóm tách rời nhau (giới hạn bởi đường nét đứt). Tuy nhiên, các điểm tọa độ biểu thị cho mỗi chủng phân lập ở mỗi nhóm (các điểm giới hạn trong đường nét đứt) phân bố phân tán. Đặc biệt, có 6 chủng phân lập nằm tách rời khỏi phân nhóm 1, 2 và 3. Kết quả này phản ánh sự đa dạng di truyền ngay trong một genotype/ cluster của PCV2 tại Việt Nam. KM042410_2008 JX099786_2008 1 Trục hình chiếu 2 (Coordinate 2) KM042412_2009 KM042405_2011 JQ181588_2011 JQ181595-2011 2 3 Trục hình chiếu 1 (Coordinate 1) PCV2b: 1A/1B PCV2b: CRF PCV2d Hình 4.4. Hệ tọa độ 2 chiều biểu diễn mối quan hệ gen giữa các chủng PCV2 phân lập ở Việt Nam 4.2.4. Sự lưu hành của các genotype PCV2 theo không gian và thời gian Kết quả ở hình 4.5 cho thấy, tại một số tỉnh có sự lưu hành của các nhóm di truyền khác nhau. Ví dụ, từ năm 2009-2016 đều phát hiện được PCV2 nhóm 1A/1B, CRF và PCV2d lưu hành ở đàn lợn nuôi tại Hà Nội. Về mặt thời gian, nhóm tái tổ hợp CRF có mặt ở Việt Nam ít nhất từ năm 2004 cho tới 2013, genotype PCV2d xuất hiện ít nhất từ 2008 cho tới nay (năm 2017). 13 2004 2009 14 2008 2011 2010 2013 2012 2015 2014 2016 Hình 4.5. Phân bố các nhóm di truyền của PCV2 ở Việt Nam theo không gian và thời gian 14 (Năm) 2017 4.2.5. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2b được mô tả như hình 4.6. Trung Qu?c Pháp Nhánh 1 Nhánh 2 Ghi chú: Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia được dự đoán. Các chủng của Việt Nam được đánh dấu màu xanh Hình 4.6. Nguồn gốc, sự phát tán theo không gian và thời gian của genotype PCV2b lưu hành ở Việt Nam Kết quả phân tích trình bày ở hình 4.6 còn dự đoán mặc dù PCV2b lưu hành ở Pháp là nguồn gốc tiên phát của các chủng virus thuộc nhóm này trên thế giới, nhưng các chủng PCV2b lưu hành ở Trung Quốc (nhánh màu tím, hình 4.6) mới là nguồn gốc trực tiếp của PCV2b lưu hành tại nhiều quốc gia trên thế giới (trong 15 đó có Việt Nam). Đối với các chủng PCV2b lưu hành ở Việt Nam, phần lớn các chủng (34/39 chủng) được dự đoán bắt nguồn từ virus lưu hành ở Trung Quốc. PCV2b thuộc nhánh 1 là nhóm di truyền có nhiều chủng PCV2 thực địa lưu hành ở Việt Nam nhiều nhất. Các chủng này được dự đoán bắt nguồn trực tiếp từ chủng virus lưu hành ở Trung Quốc (hình 4.7). Trong đó, kết quả phân tích dự đoán có ít nhất 2 đợt xâm nhập vào nước ta: đợt 1 vào khoảng năm 1992 và đợt 2 vào khoảng năm 2002 (hình 4.7). Các chủng này sau khi xâm nhập vào nước ta đã tiếp tục lưu hành và và có thể đã tạo thành nhánh riêng biệt của Việt Nam và lây lan tiếp ra các tỉnh khác (đánh dấu đường màu đen). Trung Quốc Trung Quốc Trung Quốc hi chú: Các chủng của Việt Nam được đánh dấu màu xanh Hình 4.7. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 1 xâm nhập vào Việt Nam Ngoài các chủng PCV2 thuộc nhánh 1, chỉ quan sát được một số chủng virus lưu hành ở Việt Nam thuộc các nhánh còn lại. 16 Trung Quốc Hàn Quốc Ghi chú: Các chủng của Việt Nam được đánh dấu màu xanh Hình 4.8. Sự phát tán theo không gian và thời gian của chủng PCV2b nhánh 2 xâm nhập vào Việt Nam Kết quả phân tích vẫn dự đoán Trung Quốc là nguồn gốc của các chủng virus này ở Việt Nam (hình 4.8). Tuy nhiên, có 2 chủng PCV2 phân lập năm 2009 được dự đoán có nguồn gốc từ Hàn Quốc. 4.2.6. Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam Đến thời điểm hiện tại, có hai sự chuyển dịch genotype của PCV2 (genotypic shift) đã được biết: (i) PCV2a sang PCV2b diễn ra trên phạm vi toàn cầu từ năm 2003 (Cortey et al., 2011, Dupont et al., 2008), (ii) từ 2012 trở lại đây có sự chuyển dịch genotype lưu hành phổ biến sang PCV2d (Xiao et al., 2015). Ở 17 Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu về đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d lưu hành ở Việt Nam. A B Trung Quốc (A) Cây phát sinh chủng loại với các nhánh được đánh dấu bằng màu tương ứng với quốc gia được dự đoán và chiều dài được căn chỉnh tương ứng với trục thời gian được dự đoán. (B) Những đường phát tán của PCV2d với mức tin cậy cao nhất (Bayes Factor > 150). Hình 4.9. Kết quả phân tích sự phát tán theo không gian và thời gian của PCV2d Nghiên cứu này đã dự đoán nhanh và chính xác nhánh chính của cây phát sinh chủng loại (với các nút được đánh màu đỏ, hình 4.9) có nguồn gốc từ Trung Quốc. Trong đó, ở mức tin cậy cao nhất (Bayes factor > 150) là con đường phát tán từ Trung Quốc tới các nước/ vùng lãnh thổ như: Braxin, Đức, Italy, Đài Loan và Việt Nam. Nhận xét này về nguồn gốc của genotype PCV2d ở Trung Quốc cũng phù hợp với một số công bố trước đây (Guo et al., 2010, Franzo et al., 2015). Đặc điểm dịch tễ học phân tử của genotype PCV2d ở Việt Nam được làm rõ ở hình 4.10. 18