Tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học hai loài Sơn trà (Eriobotrya Lindl) và một loài Cau chuột (Pinanga Blume) của Việt Nam (TT)

1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng một vai trò ngày càng quan trọng trong cuộc sống, đặc biệt là trong lĩnh vực y dược nhằm nâng cao sức khỏe, phòng và chống các căn bệnh hiểm nghèo. Nhiều loại thảo dược, các sản phẩm thiên nhiên được sử dụng trực tiếp làm thuốc chữa bệnh, hoặc được dùng làm tiền chất cho tổng hợp hóa dược, hoặc cấu trúc của chúng được sử dụng như các chất dẫn đường để tìm kiếm các dẫn xuất mới, có hoạt tính cao phục vụ việc phát triển thuốc chữa bệnh. Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) là một chi nhỏ thuộc họ Hoa hồng (Rosaceae), có xuất xứ từ Đông và Đông nam Châu Á. Kết quả nghiên cứu một vài loài Eriobotrya đã phát hiện ra nhiều hợp chất có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú. Cau chuột (Pinanga Blume) là một chi thực vật quan trọng của họ Cau (Arecaceae), có nhiều loài đặc hữu của Việt Nam. Một số loài thuộc chi Pinanga được ứng dụng trong y học cổ truyền và cho đến nay, hầu như chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các cây trong chi này. Những cơ sở khoa học và thực tiễn nêu trên đã định hướng cho chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học hai loài Sơn trà (Eriobotrya Lindl.) và một loài Cau chuột (Pinanga Blume) của Việt Nam”. 2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Sơn trà poilane (Eriobotrya poilanei), loài Sơn trà nhật bản (Eriobotrya japonica) và loài Cau chuột núi (Pinanga duperreana) để tìm kiếm các hợp chất có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học lý thú nhằm khai thác tốt hơn nguồn tài nguyên thực vật này. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án o Thu hái mẫu thực vật, xác định tên khoa học và xử lý mẫu; o Điều chế các cặn chiết từ các mẫu thực vật thu hái được; 2 o o o o Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết; Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được; Chuyển hóa hóa học hợp chất phân lập được có hàm lượng lớn; Thử hoạt tính sinh học của các chất phân lập và các dẫn xuất chuyển hóa. 4. Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án đã đóng góp những kết quả nghiên cứu mới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 2 loài Sơn trà (Eriobotrya) và loài Cau chuột núi (Pinanga duperreana) của Việt Nam, cùng một số dẫn xuất bán tổng hợp từ axit ursolic. Các kết quả của luận án tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chi Sơn trà và chi Cau chuột nhằm khai thác và ứng dụng có hiệu quả các hoạt tính quý báu của chúng trong lĩnh vực y dược. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài Eriobotrya poilanei và Pinanga duperreana ở Việt Nam và trên thế giới. - Trong số các chất phân lập được từ 2 loài Eriobotrya có 7 chất lần đầu tiên tìm thấy trong chi này, gồm có 5 tritecpen: axit arjunic (125); metyl 2α,3β-dihydroxyolean-12-en-28-oat (132); metyl 2α,3β-dihydroxyurs-12-en28-oat (133); axit 2-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-trans-coumaroyl) alphatolic (134) và axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-axetyl-cis-coumaroyl) alphatolic (135); 1 flavolignan: catiguanin B (128) và 1 ancol béo: hexatetracontan-1-ol (129). - Dẫn xuất N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin (145) và 3-succinoylurs-12-en-28-amit (146) là hai chất mới. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 144 trang, trong đó có 75 hình, 13 bảng. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); Chương 2: Thực nghiệm (26 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (59 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang). Phần Danh sách các hợp chất phân lập từ 3 cây nghiên cứu và các dẫn xuất chuyển hóa từ axit ursolic (9 trang); Danh mục các công 3 trình khoa học đã công bố trong khuôn khổ luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (11 trang) với 103 tài liệu cập nhật đến năm 2011. Ngoài ra còn có 35 trang phần Phụ lục với các hình phổ. II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần Mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Sơn trà (Eriobotrya), họ Hoa hồng (Rosaceae) 1.2. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Cau chuột (Pinanga), họ Cau (Arecaceae) 1.3. Các hợp chất tritecpen thiên nhiên khung oleanan và ursan 1.4. Chuyển hóa hóa học của axit ursolic Chương 2 – THỰC NGHIỆM Phần Thực nghiệm trình bày về nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu, quá trình chiết tách, đặc điểm hóa lý và số liệu phổ của các chất được phân lập từ lá cây E. poilanei, E. japonica, thân cây P. duperreana và các chất chuyển hóa được từ axit ursolic. Nguyên liệu: Mẫu cây Eriobotrya poilanei được thu hái tại rừng quốc gia Bì Dúp, Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng vào tháng 3 năm 2009; mẫu cây E. japonica được thu hái tại Tam Đảo, thuộc tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 8 năm 2010; mẫu cây Pinanga duperreana được thu hái tại Ba Vì, tỉnh Vĩnh Phúc vào tháng 8 năm 2009. Các mẫu thực vật được TS. Nguyễn Tiến Hiệp và CN. Ngô Văn Trại xác định tên khoa học. Quy trình chiết: Mẫu thực vật được làm sạch, sấy khô ở nhiệt độ 4 40 0C, xay nhỏ và ngâm chiết bằng hỗn hợp dung môi metanol/nước (85/15) ở nhiệt độ phòng sau đó chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexan, etyl axetat (diclometan), n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các cặn chiết tương ứng. Phân lập các chất: Tinh chế các cặn chiết thu được bằng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex LH20 và các hệ dung môi thích hợp. Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC…). Phương pháp thử hoạt tính sinh học: * Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định gồm 3 chủng vi khuẩn gram (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa) ATCC 15442, Escherichia coli (Ec) ATCC 25922, Salmonella enterica (Se); 3 chủng vi khuẩn gram (+): Staphylococcus aureus (Sa) ATCC 13709, Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633, Lactobacillus fermentum N4 và 1 chủng nấm Candida albicans (Ca) ATCC 10198. * Hoạt tính gây độc tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC, gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7). Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Các chất phân lập từ cây Eriobotrya poilanei J. E. Vid. Từ lá cây E. poilanei, 12 chất đã được phân lập gồm 7 tritecpen, 2 flavonoid, 2 phytosterol và 1 ancol béo. Trong khi tinh chế cặn chiết etyl axetat, có nhiều phân đoạn chứa hỗn hợp các chất có Rf sát nhau, rất khó khăn cho việc phân lập. Do vậy, để tăng khả năng phân tách, phản ứng axetyl hóa các phân đoạn đó đã được tiến hành. Vì vậy, trong số các chất phân lập được từ cặn chiết etyl axetat, có 4 chất thu được ở dạng sản phẩm axetyl. 5 3.1.1. Các hợp chất tritecpen  Khung ursan Chất 5 93 120 121 123 124 Cấu tạo R1 = R2 = R4 = H R3 = OH và R5 = COOH R1 = R2 = R4 = H R3 = OAc và R5 = COOH R1 = R2 = R4 = H R3 = OH và R5 = CHO R1 = R2 = H; R3 = OAc; R4 = OH và R5 = COOH R1 = R3 = OAc; R2 = O; R4 = OH và R5 = COOH R1 = R2 = R3 = OAc R4 = OH và R5 = COOH  Axit ursolic (5): Chất 5 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ FT-IR của nó cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl tại 3448 và nhóm cacboxyl tại 1691 cm-1. Phù hợp với số liệu phổ IR, phổ 1H và 13C-NMR cho thấy phân tử chất 5 có chứa 1 nhóm axit (C = 178,23), 1 tín hiệu của nhóm hydroxymetin (H = 2,98 m, C = 76,85 d), 1 nối đôi dạng >C=CH- [H = 5,11 (1H, t, J = 3,4), C = 138,17 s; 124,57 d] và 7 nhóm metyl, bao gồm 5 nhóm metyl bậc ba thể hiện qua các tín hiệu singlet ở H = 0,66; 0,73; 0,85; 0,88; 1,02 và 2 nhóm bậc 2 thể hiện qua các tín hiệu doublet ở H = 0,79 (3H, d, J = 6,4), 0,89 (3H, d, J = 8,7). Ngoài các tín hiệu kể trên, phổ 13C-NMR, DEPT còn cho thấy sự có mặt của 9 nhóm CH2, 3 nhóm CH cũng như 6 cacbon không gắn trực tiếp với hydro trong phân tử. Với các số liệu phổ như đã phân tích có thể đưa ra công thức phân tử của chất 5 là C30H48O3 và cấu trúc của nó được xác định là axit ursolic nhờ so sánh với số liệu đã công bố.  Andehid ursolic (120): Công thức phân tử của chất 120 là C30H48O2 được rút ra từ pic ion phân tử tại m/z = 441,37346 [M+H]+ trong phổ HR-ESI-MS (theo tính toán cho C30H49O2: 441,37326). Phổ IR cho các đỉnh hấp thụ ở 3421 6 (OH), 1718 cm-1 (CHO). Phổ 1H- và 13C-NMR rất tương tự như chất 5 chỉ có sự khác biệt duy nhất là nhóm axit trong chất 5 được thay bằng nhóm andehid ở chất 120. Điều này được thể hiện qua các tín hiệu ở H = 9,32 (1H, s) và C = 207,4 d. Cấu trúc của chất 120 được xác định là andehid ursolic nhờ kết hợp so sánh với số liệu phổ khối và phổ 1D-NMR trong tài liệu.  Axit 3β-O-axetyl pomolic (121): Chất 121 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ HR-ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z = 515,37362 [M+H]+ (theo tính toán cho C32H51O5: 515,37365). Phổ 1H và 13C-NMR cho thấy nó cũng có khung axit urs-12-en-28-oic, nhưng trong phân tử xuất hiện thêm một nhóm hydroxyl gắn với C-19, điều này thể hiện qua tín hiệu cacbon bậc 3 tại C = 73,09 và tín hiệu singlet của H-18 (H = 2,53). Các số liệu phổ cho thấy trong phân tử chỉ chứa một nhóm axetyl [H = 2,05 (s, 3H); C = 21,30 q; 171,03 s] và do đó suy ra phản ứng axetyl hóa chỉ thực hiện với nhóm hydroxyl bậc 2 ở vị trị C-3. Số liệu phổ của 121 hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ của axit 3β-O-axetyl pomolic trong tài liệu. Bảng 3.1 - Số liệu 13C-NMR (125 MHz) của chất 5, 120, 121 và các chất tham khảo Chất 5 Axit ursolic (DMSOd6 ) Chất 120 (CDCl3) Andehid ursolic (CDCl3) Axit 3-OChất 121 (CDCl3) axetyl C (DMSOd6 ) 1 38,24 t 38,22 t 38,78 t 38,7 t 38,07 t 2 26,96 t 26,79 t 27,26 t 27,3 t 23,52 t 23,6 t 3 76,85 d 76,82 d 79,04 d 79,0 d 80,96 d 80,9 d pomolic (CDCl3) 38,1 t 4 38,36 s 38,35 s 39,87 s 38,8 s 37,54 s 37,7 s 5 54,79 d 54,77 d 55,27 d 55,2 d 55,21 d 55,2 d 6 17,99 t 17,97 t 18,31 t 18,4 t 18,28 t 18,2 t 7 30,18 t 30,77 t 33,15 t 32,0 t 32,57 t 32,6 t 8 39,09 s 39,09 s 42,01 s 39,9 s 39,97 s 39,9 s 9 47,02 d 47,00 d 47,62 d 47,6 d 47,97 d 47,1 d 10 36,51 s 36,51 s 36,98 s 37,0 s 36,94 s 36,9 s 11 23,80 t 23,80 t 23,34 t 23,3 t 23,65 t 23,5 t 12 124,57 d 124,54 d 126,24 d 126,1 d 129,30 d 129,3 d 13 138,17 s 138,18 s 137,84 s 137,7 s 137,93 s 137,9 s 7 14 41,63 s 41,62 s 42,01 s 42,2 s 41,04 s 41,0 s 15 32,70 t 32,69 t 29,70 t 28,2 t 28,19 t 28,2 t 16 22,83 t 22,82 t 26,92 t 23,4 t 25,31 t 25,3 t 17 46,82 s 46,81 s 50,16 s 50,2 s 47,76 s 47,8 s 18 52,38 d 52,37 d 52,68 d 52,6 d 52,79 d 52,8 d 19 38,49 d 38,42 d 39,02 d 39,0 d 73,09 s 73,1 s 20 38,44 d 38,48 d 38,86 d 38,9 d 41,08 d 41,0 d 21 27,53 t 27,52 t 30,21 t 30,2 t 25,98 t 25,9 t 22 36,30 t 36,29 t 31,91 t 33,2 t 37,68 t 37,1 t 23 28,24 q 28,23 q 28,17 q 29,8 q 27,43 q 27,4 q 24 16,90 q 16,90 q 15,63 q 15,7 q 16,67 q 16,6 q 25 16,03 q 16,03 q 15,53 q 15,6 q 15,32 q 15,3 q 26 15,19 q 15,18 q 17,25 q 17,3 q 17,04 q 16,9 q 27 23,25 q 23,24 q 23,25 q 23,3 q 24,48 q 24,4 q 28 178,23 s 178,23 s 207,40 d 207,3 d 184,45 s 183,6 s 29 16,97 q 16,97 q 16,67 q 16,7 q 28,03 q 28,0 q 30 21,04 q 21,10 q 21,07 q 21,2 q 16,15 q 16,1 q OCOCH3 - - - - 171,03 s -  Axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (123): Công thức phân tử của chất 123 được xác định là C34H50O8 từ pic ion phân tử m/z = 587,35841 [M+H]+ (theo tính toán cho C34H51O8 là 587,35839) trong phổ HR-ESI-MS. Phổ 1H, 13C-NMR, DEPT cho thấy phân tử 123 cũng là 1 tritecpen axit khung urs-12-en. Sự khác nhau rõ rệt của chất 123 so với các chất đã nêu là sự xuất hiện nhóm xeton C=O (C = 198,39) và 2 nhóm axetyl (H = 2,15 s, 6H; C = 20,47; 20,99 và 169,77; 169,90) trong phân tử. Ngoài ra, tương tự như chất 121, tín hiệu cacbon bậc 3 cộng hưởng ở 73,04 ppm, chứng tỏ có nhóm hydroxyl gắn ở C-19. Hai proton của hai nhóm axetoxy metin xuất hiện dưới dạng tín hiệu singlet ở H = 4,37 và 4,33 (mỗi tín hiệu 1H) cho phép dự đoán hai nhóm axetyl được gắn vào C-1 và C-3, và nhóm xeton ở C-2. Các dự đoán trên được khẳng định khi so sánh số liệu phổ của chất 123 với số liệu đã công bố của axit 2-oxo-1,3-O-diaxetyl-19hydroxyurs-12-en-28-oic trong tài liệu.  Axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxyurs-12-en-28-oic (124): Chất 124 được tách ra ở dạng chất bột màu trắng, cho pic ion phân tử ở m/z = 8 631 [M+H]+ trong phổ ESI-MS. Phổ 1H và 13C-NMR của nó gần giống như của chất 123, chỉ khác nhau nhóm thế ở C-2. Nhóm xeton trong chất 123 được thay thế bằng nhóm axetyl ở chất 124. Điều này thể hiện qua sự mất tín hiệu của nhóm xeton và xuất hiện thêm tín hiệu của một nhóm axetoxy metin và một nhóm axetyl. Tín hiệu triplet ở H = 5,45 (J = 3,7 Hz) được gán cho H-2; hai tín hiệu doublet ở H 4,77 và 4,70 (J = 3,7 Hz) là của H-1 và H-3, tương ứng. Bên cạnh đó, phổ COSY cho thấy tương tác giữa H-2 với H-1 và H-3 và cấu hình của các nhóm thế O-axetyl ở C-1, C-2 và C-3 được xác định thông qua hằng số tương tác 3,7 Hz của các proton H-1, H-2 và H-3 thể hiện mối tương quan axial-equatorial-axial của chúng. Từ các số liệu phổ đã phân tích ở trên, cùng với phổ HSQC, HMBC và kết hợp với tài liệu, chúng tôi xác định chất 124 là axit 1,2,3-O-triaxetyl-19-hydroxy urs-12-en-28oic. Bảng 3.2- Số liệu 1H- (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất 123, 124 và các chất tham khảo (CDCl3) Axit 2-oxo1,3-Odiaxetyl-19hydroxy urs12-en-28-oic Chất 123 C Chất 124 Metyl 1,2,3-Otriaxetyl-19hydroxy urs12-en-28-oat δC δH, J (Hz) δH, J (Hz) δC δH, J (Hz) δH, J (Hz) 1 85,44 d 5,08 (s) 5,08 ( s) 70,05 d 4,77(d, 3,7) 4,75 (d, 3,7) 2 198,39 s - - 75,07 d 5,45 (t, 3,7) 5,44 (t, 3,7) 3 81,98 d 5,04 (s) 5,04 (s) 78,24 d 4,70(d, 3,7) 4,70 (d, 3,7) 4 43,05 s - - 40,50 s 5 52,47 d 52,53 d 6 17,83 t 25,16 t 7 32,19 t 32,28 t - 8 40,73 s 41,94 s - 9 47,69 d 48,24 d - 10 47,79 s 37,59 s - 9 11 25,92 t 25,92 t 12 128,90 d 13 137,60 s 137,73 s 14 40,73 s 41,05 s 15 28,32 t 28,27 t 5,28(t, 3,7) 5,30 (t, 3,0) 129,19 d 16 25,13 t 25,92 t 17 46,79 s 47,63 s 18 52,64 d 19 73,04 s 73,04 s 20 41,09 d 41,05 d 21 25,92 t 28,27 t 22 37,45 t 23 28,63 q 1,10 (s) 1,10 (s) 24 17,15 q 0,72 (s) 25 12,77 q 0,79 (s) 26 16,84 q 27 28 29 30 2,52 (s) 5,26 (t, 3,7) 5,26 (t,3,6) - 2,50 (s) 2,55 (br s) 27,49 q 1,19 (s) 1,18 (s) 0,73 (s) 17,55 q 1,07 (s) 1,07 (s) 0,80 (s) 12,03 q 1,34 (s) 1,30 (s) 0,99 (s) 0,99 (s) 17,55 q 0,73 (s) 0,69 (s) 24,19 q 1,28 (s) 1,29 (s) 24,36 q 1,22 (s) 1,21 (s) 184,20 s - - 184,12 s - - 27,44 q 1,20 (s) 1,21 (s) 29,10 q 0,90 (s) 0,90 (s) 16,07 q 0,95 (d, 6,6) 0,95 (d, 6,5) 16,12 q 0,94 (d,6,6) 0,93 (d, 6,4) 2,15 (s) 2,16 (s) 170,05 s – 20,71 q 2,00 (s) 1,99 ( s) 169,77 s – AcO-C1 20,47 q 2,52 (s) - 52,53 d 37,59 t AcO-C2 - - - 170,05 s – 21,37 q 2,08 (s) 2,08 (s) AcO-C3 169,90 s – 20,99 q 2,15 (s) 2,16 (s) 170,05 s – 20,89 q 2,02 (s) 2,02 (s)  Khung oleanan Chất R 125 R1= R2= R3= OH 126 R1= R2= OAc và R3= OH 127 R1= R2= OAc và R3= H  Axit arjunic (125): Phổ HR-ESI-MS của chất 125 có pic ion phân tử 10 tại m/z 511,33940 [M+Na]+ (theo tính toán cho C30H48O5Na: 511,33994), tương ứng với công thức phân tử là C30H48O5. Số liệu phổ khối, kết hợp với phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho phép dự đoán chất 125 là một tritecpen axit khung oleanan. Các tín hiệu singlet của 7 nhóm metyl bậc 3 ở H = 0,79; 0,84; 0,96; 0,99; 1,02; 1,04; 1,31 (mỗi tín hiệu 3H, s) củng cố cho giả thiết trên. Ngoài ra phổ 1H- và 13C-NMR còn cho thấy sự có mặt của 1 nối đôi dạng >C=CH- [H = 5,30 (1H, t, J = 3,4, H-12)]; C = 124,73 (C-12), 144,70 (C-13)]; 1 nhóm –COOH ở C = 182,65 và 3 nhóm oxymetin ở H = 3,63 (m); 3,28 (d, J = 3,7); 2,94 (d, J = 9,6) và C = 69,53; 82,48; 84,55. Bên cạnh các tín hiệu kể trên, phổ 13C-NMR, DEPT còn cho thấy sự có mặt của 8 nhóm CH2, 3 nhóm CH cũng như 6 cacbon không gắn trực tiếp với hydro trong phân tử. Hình 3.1 – Phổ 13C-NMR và DEPT (125 MHz) của chất 125 Để xác định ví trí nối kết của các nhóm hydroxyl trong phân tử, dữ liệu phổ 2D-NMR đã được phân tích. Phổ 1H-1H-COSY cho thấy tương tác giữa H-2/H-3, H-1/H-2, H-18/H-19 và H-11/H-12. Mặc dù tín hiệu của nhóm cacboxyl không được quan sát rõ trong phổ 1D-NMR, nhưng phổ HMBC cho thấy tương tác giữa H-18 với 28-COOH. Hơn nữa, phổ HMBC còn cho thấy tương tác giữa H-1 với C-2, C-3; giữa H-3 với C-2, C-4, C23, C-24. Điều này càng khẳng định sự gán ghép các tín hiệu phổ là hoàn toàn phù hợp. Ngoài ra, hằng số tương tác giữa H-2 và H-3 khá lớn (J = 9,6 Hz), chứng tỏ 2 nhóm hydroxyl ở C-2 và C-3 không nằm trên cùng mặt phẳng phân tử. Với các số liệu đã nêu trên và các tương tác trong phổ 2D- 11 NMR (HSQC, HMBC, COSY), kết hợp so sánh với các số liệu đã công bố, cấu trúc chất 125 được xác định là axit 2α,3β,19α-trihydroxyolean-12-en28-oic hay axit arjunic. Đây là lần đầu tiên axit arjunic được tìm thấy ở chi Eriobotrya.  Axit 2α,3β-O-diaxetylolean-12-en-28-oic (127): So sánh phổ của chất 127 với chất 126 ta thấy rằng độ dịch chuyển hóa học và dạng vạch của các tín hiệu rất gần nhau, tuy nhiên phân tử 127 có ít hơn một nhóm hydroxyl so với chất 126. Điều này được thể hiện ở sự mất đi tín hiệu của một nhóm oxymetin trong phổ 1H- và 13C-NMR của 127. Tín hiệu doublet của nhóm oxymetin C-19 ở vùng trường thấp ( δC 80,57) trong chất 126 đã bị thay thế bởi tín hiệu triplet (δC 46,2) ở phía vùng trường cao hơn. Như vậy phân tử 127 không có nhóm hydroxyl thế ở C-19. Mặc dù phổ 13CNMR của chất 127 không cho tín hiệu của nhóm cacboxyl, tuy nhiên độ dịch chuyển của cacbon không gắn trực tiếp với hydro ở C-17 về phía vùng trường thấp (C = 46,51) và pic ion phân tử tại m/z 557,38424 [M+H]+ ứng với công thức phân tử C34H52O6 trong phổ khối phân giải cao đã chứng tỏ phân tử chất 127 có nhóm COOH ở C-17. Cấu hình của hai nhóm axetyl được xác định là 2,3dựa vào giá trị hằng số tương tác lớn của H-2 với H-1 (J2a-1a = 11,0 Hz) và H-3 với H-2 (J2a-3a = 10,5 Hz) cùng 1 giá trị hằng số tương tác nhỏ (J2a-1e = 4,3 Hz), kết hợp so sánh với các chất tương tự trong tài liệu. Như vậy, cấu trúc của chất 127 được xác định là axit 2α,3β-Odiaxetylolean-12-en-28-oic qua các số liệu phổ như đã phân tích và so sánh với tài liệu đã công bố. 3.1.2. Các hợp chất flavonoid Chất 22:(-)-Epicatechin Chất 128:Catiguanin B 12  Catiguanin B (128): Chất 128 thu được ở dạng chất rắn, màu cam. Phổ IR của chất 128 cho các đỉnh hấp thụ ở 3413 (OH), 1728 cm-1 (C=O). Công thức phân tử là C25H22O10 được rút ra từ pic ion phân tử ở m/z = 483,12909 [M+H]+ (theo tính toán cho C25H23O10 là 483,12912) trong phổ HR-ESI-MS. Phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT cho thấy chất 128 có chứa một đơn vị epicatechin thể hiện qua các tín hiệu của vòng C, gồm có 2 nhóm metin gắn với oxy ở H = 4,92 (1H, br s, H-2); 4,25 (1H, m, H-3) và C = 80,07 (C-2); 66,83 (C-3); tín hiệu của nhóm metylen CH2-4 ở H = 2,82; 2,92 và C = 29,49. Bên cạnh đó, các proton thơm tương tác kiểu ABX của vòng B cũng được tìm thấy trong phổ 1H-NMR, gồm có 2 doublet ở H = 6,79 và 7,00 với hằng số tương tác lần lượt là 8,2 và 1,5 Hz; 1 doublet kép ở H = 6,86 (J = 1,5 & 8,2 Hz). Các tương tác giữa H-2 với C-1' (132,08 ppm), C-2' (115,18 ppm) và C-6' (119,20 ppm) trong phổ HMBC khẳng định sự có mặt của đơn vị epicatechin trong phân tử 128. Ngoài ra, phổ NMR còn cho thấy các tín hiệu của 1 nhóm metin [H = 4,48 (1H, dd, J = 3,0 & 9,0 Hz) và C = 31,15], 1 nhóm metylen [H = 2,98 (1H, dd, J = 3,0 & 14,8 Hz); 2,50 (1H, dd, J = 9,0 & 14,8 Hz) và C = 44,78], 1 vòng benzen bị thế 4 lần trong đó có 2 nhóm thế là hydroxyl thể hiện qua tín hiệu singlet của 2 proton thơm ở H = 6,47 và 6,62. Bên cạnh đó 6 cacbon thơm trong đó có 2 cacbon dịch chuyển về vùng trường thấp ở C = 142,10 và 146,41 cùng 1 nhóm –COOMe [H = 3,60 s, và C = 174,65 s; 52,03 q] cũng được quan sát thấy trong phổ NMR. Phổ HMBC chỉ ra các tương tác giữa H-9 với C-7, C-8, C-1", C-2" và C=O chứng tỏ rằng C-9 liên kết với C-8 của vòng A và C-1" của vòng thơm bị thế 4 lần. Ngoài ra, các tương tác giữa H-10 với C-9, C-1” và C=O khẳng định sự nối kết của C-10 với C-9 và –COOMe. Tương tác của một trong hai proton của nhóm CH2-10 ở 2,98 ppm với H-2’, H-6’ và H-6’’ trong phổ ROESY chứng minh hóa lập thể của chất 128 như trong hình vẽ. Cuối cùng cấu trúc chất 128 được xác định là catiguanin B khi so sánh với số liệu phổ trong tài liệu.Theo tra cứu tài liệu của chúng tôi, đây là lần đầu tiên catiguanin B được tìm thấy trong chi Eriobotrya. 13 Hình 3.2 – Phổ ROESY (75 MHz) của chất 128 3.1.3. Các hợp chất phytosterol và ancol béo  Hexatetracontan-1-ol (129): Phổ FT-IR của chất 129 cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl ở 3423 và C-O ở 1023 cm-1. Phổ HR-ESI-MS cho biết pic ion phân tử ở m/z 663,73831 [M+H]+ (theo tính toán cho C46H95O là 663,73829) tương ứng với công thức là C46H94O. Sự phân mảnh trong phổ khối thể hiện đặc điểm rất đặc trưng cho một hydrocacbon no qua các ion phân mảnh luôn mất một nhóm CH2 hay là một số nhóm CH2 tương ứng với 14 đơn vị khối lượng hoặc bội số của 14. Ví dụ: m/z = 606 [M-C4H8]+ (M-56 ); 578 [M-C6H12]+ (M-84); 522 [M-C10H20]+ (M-140),.... Sự có mặt nhóm hydroxyl trong phân tử cũng được thể hiện rõ qua ion phân mảnh tại m/z 646 [M-OH+H]+ (M-16). Phổ 1H- và 13C-NMR khẳng định chất 129 là ancol béo mạch dài, thể hiện qua pic của rất nhiều nhóm CH2 cộng hưởng chồng chập ở δH = 1,26; δC = 29,63; 1 nhóm metyl của mạch hydrocacbon no ở δH = 0,89 (t, 3H), δC = 14,12; 1 nhóm CH2OH ở δH = 3,65 (t, 2H), δC = 63,13; 2 nhóm metylen bên cạnh nhóm CH2OH ở δH = 1,56 (4H), C = 32,85; 31,94. Dựa vào các tín hiệu phổ đã được phân tích ở trên kết hợp so sánh với số liệu trong tài liệu, cấu trúc chất 129 được 14 xác định là hexatetracontan-1-ol. Đây là lần đầu tiên chất này được tìm thấy ở chi Eriobotrya.  β-Sitosterol (130) và β-Sitosterol glucosid (131) Chất 130: β-Sitosterol Chất 131: β-Sitosterol glucosid 3.2. Các chất phân lập từ cây Eriobotrya japonica Lindl. Từ cây E. japonica, 7 tritecpen thuộc các khung oleanan, ursan và lupan, ở dạng nguyên gốc và dạng sản phẩm axetyl hóa đã được phân lập. Trong đó có 3 chất giống với các chất đã được chúng tôi tìm thấy trong cây E. poilanei, đó là chất 5 (axit ursolic), 93 (axit 3β-O-axetyl ursolic) và 121 (axit 3β-O-axetyl pomolic).  EJ1 là hỗn hợp 2 đồng phân cấu tạo: Metyl 2α,3β-dihydroxyolean12-en-28-oat (132) và Metyl 2α,3β-dihydroxyurs-12-en-28-oat (133): Số liệu phổ 1D-NMR cho các cặp tín hiệu khá giống nhau về độ dịch chuyển hóa học và dạng vạch. Dựa vào tỉ lệ đường tích phân trong phổ 1H-NMR có thể thấy rằng chất EJ1 là hỗn hợp hai đồng phân với tỉ lệ khoảng 5 : 1 (132 : 133). Cấu trúc của hỗn hợp 2 đồng phân cấu tạo này được xác định dựa vào các phổ IR, ESI-MS và 1D-NMR. Chất 132: Metyl 2α,3β- Chất 133: Metyl 2α,3βdihydroxy-olean-12-en-28-oat dihydroxy-urs-12-en-28-oat  EJ2-Ac là hỗn hợp 2 đồng phân hình học: Chất 134 và 135 15 Công thức phân tử của chất EJ2-Ac là C43H58O8 được rút ra từ pic ion phân tử ở m/z = 701 [M-H]- trong phổ ESI-MS và số liệu phổ NMR. Các tín hiệu trong phổ NMR của chất EJ2-Ac xuất hiện chủ yếu dưới dạng từng cặp có độ dịch chuyển hóa học và dạng vạch tương tự nhau với tỉ lệ 1: 0,9 (134 : 135) cho phép dự đoán đây là một hỗn hợp hai đồng phân. Phần giống nhau của 2 đồng phân này là khung lupan axit với tín hiệu cacboxyl ở δC = 182,23 (2xC); nhóm isopropenyl [δH = 4,73; 4,60 (mỗi tín hiệu br s, 2H); 1,69; 1,685 (mỗi tín hiệu s, 3H); δC = 109,79 (2xCH2); 152,09 (C); 151,05 (C) và 19,27 (2xCH3)] cùng 5 nhóm metyl singlet cộng hưởng trong vùng từ 0,78 - 1,00 ppm. Độ dịch chuyển hóa học, dạng vạch cũng như hằng số tương tác của 2 proton oxymetin ở δH = 4,79; 4,86 (mỗi tín hiệu d, J = 10,3 Hz, H-3) và 5,08; 5,20 (mỗi tín hiệu dt, J = 10,3 & 4,5 Hz, H-2) trong phổ 1H-NMR đặc trưng cho cấu hình 2 của 2 nhóm thế chứa oxy khi so sánh với tài liệu. Hình 3.3–Phổ 1H-NMR (125 MHz) của chất EJ2-Ac 16 Sự có mặt của 2 cặp nhóm axetyl trong phân tử cũng được quan sát thấy trong phổ NMR. Các tín hiệu của cặp thứ nhất là: δH = 2,31; 2,30 (mỗi tín hiệu s, 3H); và δC = 170,68; 170,59 (C=O); 21,08; 20,96 (CH3). Cặp nhóm axetyl thứ hai ở 1,91 ppm (s, 6H, CH3CO) và 166,68; 165,61 ppm (CH3CO); 21,08 ppm (CH3CO). Ngoài ra, các tín hiệu của 4 proton thơm đối xứng từng cặp ở δH = 7,66; 7,07 (mỗi tín hiệu d; J = 8,6 Hz; 2H) và 7,55; 7,12 (mỗi tín hiệu d; J = 8,8 Hz; 2H) cùng với tín hiệu cacbonyl este ở δC = 169,13 (2xC) chứng tỏ trong phân tử có chứa nhóm p-coumaroyl. Với các số liệu phổ phân tích trên đây có thể giả thiết rằng chất EJ2-Ac là axit 2α-axetyl-3β-O-(p-axetyl-coumaroyl) alphitolic. Sự khác nhau của hai đồng phân này là do cấu hình của coumaroyl. Đồng phân 134 có nhóm thế trans-coumaroyl và 135 có nhóm cis-coumaroyl thể hiện qua hằng số tương tác giữa H-2' và H-3' là 16,0 và 12,7 Hz, tương ứng. Các số liệu phổ của chất 134 và 135 gần như đồng nhất với số liệu của axit 2-O-axetyl-3β-O-(p-transcoumaroyl) alphatolic và axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-cis-coumaroyl) alphatolic, tương ứng trong tài liệu chỉ khác ở độ dịch chuyển hóa học của C-7' về phía trường cao với  ~ 7 ppm và xuất hiện thêm nhóm axetyl. Từ các số liệu phân tích ở trên, chúng tôi xác định chất 134 và 135 lần lượt là axit 2-O-axetyl-3βO-(p-axetyl-trans-coumaroyl) alphatolic và axit 2α-O-axetyl-3β-O-(p-axetylcis-coumaroyl) alphatolic. 3.3. Cây Cau chuột núi (Pinanga duperreana Pierre ex Becc.) 3.3.1. Hàm lượng lipit tổng và thành phần axit béo trong mẫu hạt Hình 3.4 – Sơ đồ phân tích hàm lượng lipit tổng của hạt P. duperreana  Kết quả cho thấy hàm lượng lipit tổng trong mẫu hạt Cau chuột núi tương đối nhỏ (2,35% so với mẫu khô). Hình 3.5 – Sơ đồ phân tích thành phần axit béo trong dầu hạt P. duperreana 17  Kết quả phân tích thành phần dầu béo cho thấy các axit béo sau có hàm lượng khá cao: axit octadecenoic (40,89%); axit tetradecanoic (19,48%) và axit dodecanoic (15,42%). 3.3.2. Các chất phân lập từ thân cây Cau chuột núi Từ cây P. duperreana, 4 hợp chất thuộc các lớp chất khác nhau đã được phân lập, gồm 1 polyphenol, 1 flavonoid và 2 phytosterol. Trong đó chất 22 (epicatechin) và 130 (-sitosterol) là hai chất giống với chất đã phân lập từ cây E. poilanei. Hai chất không trùng lặp còn lại là (E)-3,5,3',4'-tetrahydroxystilben (136) và stigmasterol (137).  (E)-3,5,3’,4’-tetrahydroxystilben (136): Chất 136 thu được ở dạng chất rắn, màu nâu. Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z 243 [M-H]-, kết hợp với số liệu phổ 1D-NMR cho phép dự đoán chất 136 có công thức phân tử là C14H12O4. Phổ 1D-NMR cho biết phân tử 136 chứa bộ khung stilben trong đó mỗi vòng benzen có gắn 2 nhóm hydroxyl [δH 8,13 (4H, br s, -OH)]. Hai vòng benzen được gắn kết với nhau qua 1 nhóm etylen với cấu hình trans thể hiện ở các tín hiệu [δH 6,94 (1H, d, 16,3 Hz), 6,81 (1H, d, 16,3 Hz) và δC 129,72d, 127,05d]. Vòng benzen thứ nhất bị thế 3 lần ở các vị trí 1, 3, 5 dựa vào độ bội của các tín hiệu [δH 6,52 (2H, d, 2,0 Hz), 6,26 (1H, t, 2,0 Hz) và δC 159,61s ×2, 141,32s, 105,82d ×2], trong đó C-1 gắn với nhóm etylen, C-3 và C-5 gắn với hai nhóm hydroxyl. Vòng benzen thứ hai cũng bị thế 3 lần, trong đó C-1’ gắn với nhóm etylen và hai vị trí thế còn lại gắn với hai nhóm hydroxyl [δH 7,07 (1H, d, 2,0 Hz), 6,90 (1H, dd, 8,0, 2,0 Hz), 6,80 (1H, d, 8,0 Hz) và δC 146,50s, 146,48s, 131,12s, 120,19d, 116,47d, 113,90d]. Dạng vạch của các proton kết hợp với tài liệu cùng phổ mô phỏng cho phép xác định vòng benzen thứ hai chứa 2 nhóm hydroxyl ở vị trí C-3’ và C-4’. Từ các số liệu phân tích trên, cấu trúc chất 136 được xác định là (E)-3,5,3’,4’-tetrahydroxystilben. Bảng 3.3- Số liệu phổ 1H- (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của chất 136 và chất tham khảo 18 C (E)-3,5,3’-trihydroxy-4’metoxystilben (CD3COCD3) Chất 136 (E)-3,5,3’,4’tetrahydroxy stilben (mô phỏng) 1 2 3 δH(CD3COCD3) 6,52 (d, 2,0) - δC(CD3OD) 141,31s 105,82d 159,61s δH [J(Hz)] 6,61 (d, 1,8) - δC 140,8s 105,8d 159,4s δH 6,38 - δC 141,3 104,7 159,8 4 6,26 (t, 2,0) 102,69d 6,35 (br t, 1,8) 102,8d 6,212 102,8 5 6 7 8 1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 6,52 (d, 2,0) 6,81 (d, 16,3) 6,94 (d, 16,3) 7,07 (d, 2,0) 6,80 (d, 8,0) 6,90 (dd, 8,0, 2,0) 8,13 (s) 159,61s 105,82d 129,72d 127,05d 131,12s 113,90d 146,50s 146,48s 116,47d 6,61 (d, 1,8) 6,94 (d, 16,2) 7,04 (d, 16,2) 7,20 (d, 1,8) 6,85 (d, 8,3) 7,02 (dd, 8,3, 1,8) - 159,4s 105,8d 129,4d 127,0d 130,4s 110,1d 148,5s 147,4s 116,5d 6,38 6,95 6,95 7,29 6,98 159,8 104,7 127,4 127,4 130,9 115,2 145,9 146,5 117,2 121,1d 7,24 123,2 - 5,35 - 6’ OH 120,19d - 3.4. Các dẫn xuất từ sự chuyển hóa axit ursolic Tám dẫn xuất của axit ursolic đã được tổng hợp. Sơ đồ phản ứng tổng hợp 3 dẫn xuất chuyển hóa nhóm C-3-OH, 4 dẫn xuất chuyển hóa nhóm 28COOH và 1 dẫn xuất chuyển hóa ở cả hai nhóm trên cùng với phần biện luận phổ để chứng minh cấu trúc của 2 dẫn xuất mới: 145 và 146 được trình bày dưới đây. 3.4.1. Các dẫn xuất từ sự chuyển hóa nhóm 3-OH Hình 3.6- Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất 138, 139 và 140 19 3.4.2. Các dẫn xuất từ sự chuyển hóa nhóm 17-COOH Hình 3.7- Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 142 Hình 3.8 – Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 143 và 144 Hình 3.9 – Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất amit 145  N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin (145) Phổ ESI-MS cho pic ion phân tử tại m/z 595 [M-H]- tương ứng với CTPT của chất 145 là C38H64O3N2. So sánh phổ 1D-NMR của chất 145 với 93 cho thấy phân tử 145 có thêm tín hiệu của cầu nối amit CO-NH [δH = 6,00 (1H, br s, NH) và δC = 178,5s (C=O)] và một số tín hiệu cho thấy phản ứng amit hóa xảy ra tại nhóm amino liên kết với nguyên tử cacbon bậc một của tác nhân hexan-1,5-diamin [δH = 3,31, 2,99 (2H, mỗi tín hiệu m, H-1’); 2,73, 2,62, (2H, mỗi tín hiệu m, H-2’) và δC = 39,71t (C- 20 1’), 47,48t (C-2’)]. Từ các số liệu phân tích như đã nêu, chúng tôi kết luận chất 145 là N-(3-axetoxyurs-12-en-28-oyl)-5-aminohexan-1-amin. 3.4.3. Các dẫn xuất từ sự chuyển hóa ở cả hai nhóm 3-OH và 17-COOH Hình 3.10–Sơ đồ tổng hợp dẫn xuất 146  3-succinoylurs-12-en-28-amit (146) Khi thực hiện phản ứng este hóa của chất 144 với axit succinic đã thu được chất 146. Phổ IR của chất này cho thấy các tín hiệu 3459 (N-H), 1735 (C=O este), 1713 (C=O axit) và 1641 (C=O amit). Phổ 1D-NMR cho thấy phân tử 146 có chứa 1 nhóm –CONH2 [H 6,78, 5,93 (mỗi tín hiệu 1H, br s, NH2) và C 182,81s (C=O)] và 1 nhóm succinoyl [H 2,64 (4H, br s, 2H-2’ và 2H-3’); C 176,32 và 171,84 (mỗi tín hiệu s, C=O)]. Thêm vào đó, H-3 của chất 146 có giá trị H cao hơn 1,3 ppm so với H-3 của chất 144. Điều này chứng tỏ rằng nhóm succinoyl được gắn vào vị trí C-3. Pic ion phân tử tại m/z = 554 [M-H]- trong phổ ESI-MS tương ứng với công thức phân tử là C34H53O5N khẳng định thêm cấu trúc của 146 là 3-succinoylurs-12-en-28-amit. 3.5. Kết quả thử hoạt tính sinh học 3.5.1. Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy 3 cặn chiết lá E. poilanei không thể hiện hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật đem thử; 2 dẫn xuất mới 145 và 146 có hoạt tính với chủng Bacillus subtillis ở mức độ trung bình, trong đó chất 145 có hoạt tính mạnh hơn chất 146 ở cả nồng độ 1 µM và 10 µM.