Tài liệu Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------------------------------------- BÙI THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU VẬT LIỆU KHỞI ĐẦU PHỤC VỤ CHỌN TẠO GIỐNG ĐẬU XANH KHÁNG BỆNH KHẢM VÀNG Chuyên ngành : Di truyền và chọn giống cây trồ ng Mã số : 62.62 01 11 LUẬN ÁN TIẾN SỸ NÔNG NGHIỆP NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. PGS.TS. Hà Viết Cường 2. TS. Trần Danh Sửu HÀ NỘI – 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là do tôi thực hiện. Các số liệu và kết quả nghiên cứu đã nêu trong luận án là trung thực và chưa được ai công bố trên bất kỳ một công trình nghiên cứu nào khác. Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ đã được cám ơn, các tài liệu trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Bùi Thị Thu Huyền năm 2016 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được luận án này, nghiên cứu sinh đã nhận được sự tận tình giúp đỡ của nhiều tập thể và cá nhân. Nghiên cứu sinh xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Hà Viết Cường, TS. Trần Danh Sửu, những người thầy đã tận tình dẫn dắt, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận án. Nghiên cứu sinh biết ơn những ý kiến đóng góp quý báu của các Thầy Cô công tác tại Ban Đào tạo sau đại học - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam trong suốt quá trình học tập tại đây. Nghiên cứu sinh xin chân thành cảm ơn các cán bộ, bạn bè đồng nghiệp công tác tại Bộ môn Nhân giống và đánh giá nguồn gen, Bộ môn Đa dạng sinh học Nông nghiệp – Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Phòng Virus học và Phòng chỉ thị Phân tử - Trung tâm Rau Thế giới đã chia sẻ kinh nghiệm, giúp đỡ động viên trong suốt quá trình thực hiện luận án. Nghiên cứu sinh xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới Ban Lãnh Đạo Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Chủ nhiê ̣m tiểu dự án GIZ tại Viê ̣t Nam, TS. Nguyễn Thi ̣ Lan Hoa, Chủ nhiê ̣m Dự án GIZ tại AVRDC, TS. Lawrence Kenyon, HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên đã tạo điều kiện học tập và giúp đỡ tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu này. Cuối cùng, nghiên cứu sinh xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên khích lệ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng Tác giả luận án Bùi Thị Thu Huyền năm 2016 iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình MỞ ĐẦU ix CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU, CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 5 1.1. Cây đậu xanh 5 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu xanh 5 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh 6 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu xanh 7 1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 8 1 1.2. Đa dạng di truyền cây đậu xanh 13 1.2.1. Kích thước bộ gen cây đậu xanh 13 1.2.2. Các chỉ thị ADN dùng cho đánh giá đa dạng di truyền đậu xanh 14 1.2.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền cây đậu xanh bằng chỉ thị phân tử 14 1.2.4. Đa dạng nguồn gen cây đậu xanh 17 1.3. Những nghiên cứu về bệnh khảm vàng đậu xanh 18 1.3.1. Bệnh khảm vàng hại đậu xanh và lịch sử phát hiện 18 1.3.2. Triệu chứng và tác hại do bệnh khảm vàng gây ra 19 1.3.3. Virus gây bệnh khảm vàng và đặc điểm cấu trúc bộ gen. 21 1.3.4. Con đường lây truyền bệnh 23 1.3.5. Điều kiện sinh thái của vectơ và virus 24 1.3.6. Phổ ký chủ của virus 24 1.3.7. Nghiên cứu nguồn kháng virus và vectơ 25 1.3.8. Đánh giá nguồn gen và chọn giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng 26 iv 1.4. Nghiên cứu lập bản đồ di truyền và ứng dụng trong cải tiến giống ở cây đậu xanh. 29 1.4.1. Nghiên cứu lập bản đồ di tuyền ở cây đậu xanh 29 1.4.2. Lập bản đồ so sánh bộ gen 34 1.4.3. Nghiên cứu lập bản đồ các gen chính và QTL ở đậu xanh 35 1.4.4. Lập bản đồ vật lý trên cây đậu xanh 37 1.4.5. Tiềm năng ứng dụng những thành tựu nghiên cứu hệ gen đậu xanh trong cải tiến di truyền cây trồng kháng bệnh nhờ MAS 41 1.5. Nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và lập bản đồ phân tử ở Việt Nam 43 CHƯƠNG II: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 44 2.1. Vật liệu nghiên cứu 44 2.2. Nội dung nghiên cứu 45 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 45 2.4. Phương pháp nghiên cứu 46 2.4.1. Phương pháp xác định virus gây bệnh khảm vàng đậu xanh 46 2.4.2. Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền sử dụng DArT 49 2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 50 2.4.4. Phương pháp đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự (GBS) 53 2.4.5. Phân tích QTLs (Quantitative Trait Loci) 57 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 58 3.1. Phân lập và xác định virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh 58 3.1.1. Kết quả thu mẫu bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh, các cây họ đậu khác tại Việt Nam 58 3.1.2. Thiết kế mồi phát hiện các virus gây hại trên cây đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR 60 3.1.3. Kết quả chuẩn đoán bệnh virus trên đậu xanh và các cây họ đậu khác bằng kỹ thuật PCR 64 3.1.4. Kết quả giải và phân tích trình tự ADN-A của begomovirus 66 3.1.5. Kết quả phân tích nguồn gốc phát sinh loài của MYMV từ các trình tự ADN-A và ADN-B hoàn chỉnh của Việt Nam 68 v 3.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng trên đồng ruộng và đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 72 3.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng 72 3.2.2. Đánh giá đặc điểm nông sinh học của các mẫu giống đậu xanh 79 3.3. Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen đậu xanh 86 3.3.1. Thống kê các chỉ tiêu đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị DArT 87 3.3.2. Phân tích khoảng cách di truyền của các giống đậu xanh 90 3.3.3. Kết quả chọn tổ hợp lai để xây dựng quần thể lập bản đồ 95 3.4. Nghiên cứu lập bản đồ gen ở cây đậu xanh 97 3.4.1. Đánh giá kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng 97 3.4.2. Đánh giá kiểu gen kháng bệnh khảm vàng bằng giải trình tự 106 3.4.3. Lập bản đồ liên kết di truyền, bản đồ vật lý của quần thể đậu xanh nghiên cứu 109 3.4.4. Lập bản đồ QTL cho tính kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh 111 Kết luận và đề nghị 120 Danh mục các công trình đã công bố có liên quan đến luận án 122 Tài liệu tham khảo 122 Phụ lục 143 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN AFLP ARN A,C,G,T bp BSA CAPS cM CRM CTAB DArT EST GBS H ISSR LG MAS NBS-LRR PIC PCR QTLs RAPD RFLP RGAs RIL SFR SSRs SNP Acid Deoxyribo Nucleic Amplified Fragment Length Polymorphism Acid Ribonucleic Adenine, Cytosine, Guanine, Thyamine Base pair Bulked Segregant Analysis Cleaved Amplified Polymorphic Sequences Centimorgan Comprehensive reference map Cetyltrimethylammonium bromide Diversity Array Technology Expressed Sequence Tag Genotyping by Sequencing Observerd Heterogeneity Inter-Simple Sequence Repeat Linkage group Marker Assisted Selection Nucleotide binding site – leucine rich repeat Polymorphism Information Content Polymerase chain reaction Quantitative trait loci Randomly amplified polymorphic DNA Restriction fragment length polymorphisms Resistance gene analog Recombinant inbred lines Super Fine Resolution Simple sequence repeats Single nucleotide polymorphisms Axít Deoxyribonucleic Đa hình chiều dài đoạn phân cắt được nhân bội Axít Ribonucleic Cặp bazơ Phân tích phân ly nhóm Đa hình các phân đọan nhân bản được cắt giới hạn Đơn vị khoảng cách bản đồ di truyền Bản đồ tham khảo Công nghệ phân tích đa dạng Đoa ̣n trin ̀ h tự biể u hiê ̣n (là một đoạn trình tự ngắn của một chuỗi cDNA) Đánh giá kiểu gen bằng giải trình tự Hê ̣ số di ̣hơ ̣p Trin ̀ h tự xen giữa các SSR Nhóm liên kết Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử Vị trí liên kết nucleotide tại những Vùng lặp lại giàu leucine Hệ số đa dạng gen Phản ứng chuỗi trùng hơ ̣p Những locut tính trạng số lượng Đa hình ADN được nhân bô ̣i ngẫu nhiên Đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn Những yếu tố tương tự gen kháng Dòng thuầ n tái hơ ̣p Đô ̣ phân giải cao Những trình tự lặp lại đơn giản Đa hình một nucleotid vii DANH MỤC BẢNG TT bảng 1.1 Tên bảng Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna với tên Trang 6 thường gọi và nguồn gốc phát sinh 1.2 Diện tích và năng suất đậu xanh ở Việt Nam 13 2.1 Nguồn gốc các nguồn gen đậu xanh được đánh giá khả năng 44 kháng bệnh khảm vàng tại Phú Yên 2.2 Các mồi chung phát hiện ADN-A và ADN-β 47 2.3 Thang điểm (1-6) đánh giá bệnh khảm vàng (MYMD) 51 3.1 Tổng hợp kết quả điều tra, thu thập mẫu bệnh Begomovirus 58 3.2 Kết quả thiết kế mồi cho ADN-A của begomovirus 63 3.3 Tổng hợp kết quả thu thập theo nhóm cây trồng 64 3.4 Trình tự của các cặp mồi chống lưng được thiết kế để khuếch đại 67 toàn bộ ADN-A và ADN-B của MYMV thu thập từ Việt Nam 3.5 Các mẫu bệnh được giải trình tự đoạn ADN-A và ADN-B có 71 chiều dài hoàn chỉnh (full length) 3.6 Thống kê mức độ nhiễm bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh 74 tại Phú Yên vụ Hè 2012 và 2013 3.7 Danh sách các nguồn gen đậu xanh có khả năng kháng bệnh 75 khảm vàng được đánh giá tại Phú Yên qua 2 năm 2012 và 2013 3.8 Kết quả phân tích ANOVA về ổn định tính kháng của các nguồn 77 gen đậu xanh nghiên cứu qua các năm 3.9 Thời gian sinh trưởng và chiều cao cây của các nguồn gen đậu 82 xanh trong tập đoàn 3.10 Tham số thống kê và phân bố các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các nguồn gen trong tập đoàn đậu xanh 84 viii 3.11 Danh sách các mẫu giống đậu xanh triển vọng trong tập đoàn 86 đậu xanh vụ Hè 2013 3.12 Các giá trị nội dung thông tin đa hình (PIC) cho 560 chỉ thị DarT 87 3.13 Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của các 88 chỉ thị DArT với 92 nguồn gen đậu xanh 3.14 Các giá trị PIC cho các chỉ thị DArT đa hình với 54 nguồn gen 89 đậu xanh 3.15 Mối quan hệ giữa chất lượng và các thành phần khác của các 89 chỉ thị DArT với 54 nguồn gen đậu xanh 3.16 Bảng tổng hợp các chỉ tiêu chọn các cặp bố mẹ 96 3.17 Phân ly kiểu hình tính kháng bệnh khảm vàng của quần thể 100 đậu xanh 200 dòng F2:3 và 71 dòng F2:3 rút gọn 3.18 Phân tích quy luật di truyền tính kháng bệnh khảm vàng của 101 quần thể đậu xanh F2:3 trên đồng ruộng 3.19 Một số đặc điểm nông sinh học chính của hai dòng đậu xanh F5 105 triển vọng: dòng 148 và dòng 178 3.20 Kết quả gọi ra chỉ thị SNP từ phân tích GBS 108 3.21 Tổng hợp lập bản đồ di truyền đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP 110 3.22 Các QTL quy định tính trạng kháng MYMV của quần thể 113 đậu xanh F2:3 lập bản đồ 3.23 Trình tự ADN chứa chỉ thị SNP liên kết với các vùng QTL chính 114 3.24 Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp SMR 116 3.25 Các vùng QTL xác định được bằng phương pháp CIM 118 3.26 Danh sách các chỉ thị được lựa chọn cho việc đánh giá chỉ thị 119 ix DANH MỤC HÌNH TT hình Tên hình Trang 1.1 Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Vinga 6 1.2 Diện tích đậu xanh của một số nước trên thế giới 11 1.3 Sản lượng đậu xanh của một số nước trên thế giới 11 1.4 Năng suất TB của một số nước trên thế giới 12 1.5 Phân bố bệnh khảm vàng ở Châu Á 19 1.6 Triệu chứng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh 20 1.7 Cấu trúc hệ gen của Begomovirus bộ gen kép 22 1.8 Vectơ truyền bệnh – Bọ phấn (Bemisa tabaci) 23 1.9 Các loài thuộc chi Vigna bị bệnh khảm vàng gây ra bởi MYMV 25 2.1 Tạo cây nguồn để lây nhiễm nhân tạo 52 2.2 Các adapter cho GBS, các mồi giải trình tự và PCR 54 2.3 Các bước xây dựng thư viện cho GBS 55 2.4 Quy trình phân tích số liệu GBS 56 3.1 Các triệu chứng khảm vàng ở đậu xanh tại Phú Yên 59 3.2 Định vị các vùng thu thập mẫu bệnh khảm vàng chính tại Việt 59 Nam, năm 2011-2013 3.3 Minh họa phản ứng PCR phát hiện begomovirus trên cây đậu xanh 66 3.4 Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu xây dựng 70 dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-A 3.5 Cây phát sinh loài của begomovirus gây hại cây họ đậu xây dựng 70 dựa trên trình tự nucleotide đầy đủ ADN-B 3.6 Tỉ lệ phản ứng của các nguồn gen đậu xanh với bệnh khảm vàng vụ Hè năm 2012 và 2013 tại Phú Yên 74 x 3.7 Biểu đồ nhiệt độ, lượng mưa tại Phú Yên 2010-2012 76 3.8 Độ ổn định tính kháng của các nguồn gen đậu xanh kháng bệnh 77 qua các năm 3.9 Động thái tăng triệu chứng bệnh của các nguồn gen đậu xanh 77 kháng bệnh so với đối chứng nhiễm bệnh 3.10 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các nguồn gen kháng NM92, 78 NM94, VC3960-88 sử dụng cặp mồi MY-AF1/R1 3.11 Các giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng được chọn lọc 79 tại Tùy Hòa, Phú Yên năm 2012-2013 3.12 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 94 nguồn gen đậu xanh 93 nghiên cứu 3.13 Sơ đồ hình cây biểu diễn mối quan hệ của 54 nguồn gen đậu xanh 94 nghiên cứu 3.14 Phân bố kiểu hình kháng bệnh khảm vàng của quần thể F2:3 đậu xanh 98 3.15 Đánh giá kiểu hình kháng bệnh ở 35 và 55 ngày sau trồng 99 3.16 Phân lớp kiểu hình kháng bệnh MYMV của 200 dòng và 71 dòng 100 quần thể đậu xanh F2:3 3.17 Lây nhiễm 71 dòng của quần thể đậu xanh F2:3 bằng bọ phấn 103 3.18 Triệu chứng của bệnh MYMV sau lây nhiễm 103 3.19 Phân ly kiểu hình tính kháng của quần thể đậu xanh tuân theo 104 quy luật phân phối chuẩn 3.20 Hình ảnh hạt và quả của dòng đậu xanh triển vọng 178 và 148 106 3.21 Kiểu hình kháng bệnh của dòng 148 106 xi 3.22 Biểu đồ biểu diễn số lượng đoạn đọc ngắn trên mỗi mẫu thu được 107 từ giải trình tự 3.23 Bản đồ liên kết di truyền của quần thể đậu xanh nghiên cứu 110 3.24 Bản đồ vật lý gồm 11 nhiễm sắc thể của quần thể đậu xanh 111 NM94xKPS2 (được lập bằng GBS) 3.25 Các vùng QTL chính của tính trạng kháng MYMV của quần thể 114 đậu xanh trên các nhiễm sắc thể và giá trí LOD của nó 3.26 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng SMR 116 3.27 Vị trí các vùng QTL trên bản đồ vật lý của đậu xanh bằng CIM 118 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Đậu xanh (Vigna radiata (L.) Wilczek.) là một trong những cây thực phẩm họ đậu quan trọng ở Châu Á nói chung, khu vực Nam Á và Đông Nam Á nói riêng trong đó có Việt Nam. Đậu xanh rất giàu và cân đối protein, thời gian sinh trưởng ngắn, có khả năng chịu hạn, thích ứng rộng với môi trường. Tuy nhiên, năng suất đậu xanh hiện nay còn thấp và biến động lớn giữa các quốc gia. Nguyên nhân chính làm cho năng suất đậu xanh thấp là do sâu bệnh hại và thiếu giống kháng sâu bệnh. Một trong những bệnh hại nghiêm trọng nhất đến canh tác đậu xanh là bệnh khảm vàng hay còn gọi là bệnh hoa lá đậu xanh (Mungbean yellow mosaic virus – MYMV). Đây là bệnh phổ biến trên cây đậu xanh ở các nước như Ấn Độ, Bangladesh, Sri Lanka và Thái Lan... Bệnh không chỉ gây hại trên đậu xanh mà còn gây hại trên một số loài cây họ đậu khác như đậu xanh đen, đậu tương, đậu cowpea …. Nguyên nhân gây bệnh là do một hoặc nhiều virus thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) gây ra và được lan truyền bởi vectơ truyền bệnh là bọ phấn (Bemisia tabaci Genn.). Bệnh khảm vàng đã từng gây hại rất nghiêm trọng, làm mất 100% năng suất tại Ấn Độ và Thái Lan, gây thiệt hại kinh tế trên 300 triệu USD (Varma, 1992). Bệnh khảm vàng do có phổ ký chủ rộng và được truyền bởi bọ phấn theo cơ chế không bền vững nên việc kiểm soát bằng hóa học không khả thi và gây nguy hại đến môi trường. Sử dụng các giống kháng bệnh được đánh giá mang lại hiệu quả tối ưu, là cách ổn định và an toàn để quản lý dịch bệnh. Do vậy, nghiên cứu xác định nguồn gen kháng là công việc được quan tâm không chỉ ở Việt Nam mà ở nhiều quốc gia khác trên thế giới và một số nguồn gen kháng bệnh khảm vàng trên đậu xanh đã được phát hiê ̣n. 2 Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ chỉ thị phân tử, nhiều locut gen kháng sâu bệnh chính đã được định vị trên bản đồ bộ gen của cây đậu xanh. Chỉ thị phân tử liên kế t với tính kháng bênh ̣ khảm vàng trên đâ ̣u xanh cũng đã đươ ̣c báo cáo nhưng các chỉ thị này đều liên kết xa với tính trạng. Trong số các chỉ thị phân tử, SNP là chỉ thị thế hệ mới, có số lượng cao trong bộ gen do vậy được ứng dụng tốt cho tăng mật độ chỉ thị, lập bản đồ QTL và chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử với nhiều thông tin. Sự phát triển nhanh chóng của các công nghệ giải trình tự thế hệ mới đã giúp dễ dàng phát hiện các SNP trên toàn bộ hệ gen. Điều này gợi mở cho việc ứng dụng chỉ thị SNP trong chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử. Tại Việt Nam, đậu xanh là cây đậu đỗ đứng thứ ba sau lạc và đậu tương. Đậu xanh được trồng từ Bắc vào Nam. Diện tích trồng đậu xanh của Việt Nam năm 2015 là 90.950 ha trong đó các tỉnh Bắc Trung Bộ, Nam Trung Bộ và Tây Nguyên là vùng trồng chính với 67,8% diện tích trồng cả nước (2015). Bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh đã được quan sát ở Việt Nam với các triệu chứng điển hình từ những năm 1980 (Phan Hữu Trinh và cs., 1986). Bệnh gây mất năng suất từ 20-70% trên các diện tích trồng. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có nghiên cứu nào xác định virus gây bệnh khảm vàng cũng như xác định gen kháng bệnh. Vì thế, công tác đánh giá khả năng kháng bệnh khảm vàng của tập đoàn đậu xanh để tìm ra nguồn gen kháng bệnh, nghiên cứu xác định cơ sở di truyền tính kháng, lập bản đồ định vị gen kháng sẽ góp phần thúc đẩy công tác khai thác, sử dụng các nguồn gen kháng làm nguồn vật liệu cho chương trình chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh ở nước ta. Xuất phát từ yêu cầu thực tế sản xuất đậu xanh, nhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh, chúng tôi đã tiến hành đề tài: "Nghiên cứu vật liệu khởi đầu phục vụ chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng". 3 2. Mục tiêu của đề tài Tìm hiểu, xác định bản chất di truyền tính kháng bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh ở mức phân tử, giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Mục tiêu cụ thể của đề tài: - Xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên đậu xanh tại Việt Nam. - Xác định được di truyền tính kháng bệnh khảm vàng ở cây đậu xanh. - Xác định được các QTL kháng bệnh khảm vàng. - Giới thiệu được một số nguồn gen đậu xanh triển vọng làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh khảm vàng và năng suất cao tại Việt Nam. 3. Ý nghiã khoa ho ̣c và thư ̣c tiễn của đề tài Việc xác định được nguyên nhân gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh tại Việt Nam là MYMV, xác định nguồn gen kháng bệnh, đánh giá đa dạng di truyền, thiết lập bản đồ gen kháng ở giống đậu xanh làm cơ sở khoa ho ̣c cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh. Xác định di truyền tính kháng bệnh và các chỉ thị SNP liên kết với gen kháng bệnh khảm vàng ở giống đậu xanh nhập nội NM94 không chỉ nhằm xác định nguồn gen kháng mà còn có ý nghĩa thực tiễn cao trong việc khai thác hiệu quả các nguồ n gen kháng bênh ̣ phục vụ công tác cho ̣n ta ̣o giố ng đâ ̣u xanh kháng bê ̣nh. 4. Những đóng góp mới của luận án Đây là đề tài đầu tiên ở Việt Nam đã xác định được virus gây bệnh khảm vàng trên cây đậu xanh là MYMV. 4 Đã thiết lập được bản đồ di truyền gồm 11 liên kết tương ứng với 11 nhiễm sắc thể trên bộ gen của cây đậu xanh dựa trên chỉ thị SNP bằng phương pháp GBS. Đã xác định được vị trí các QTL kháng bệnh khảm vàng trên bản đồ di truyền và bản đồ vật lý ở nguồ n gen đâ ̣u xanh nhâ ̣p nô ̣i NM94. 5. Đố i tươ ̣ng và pha ̣m vi nghiên cứu 5.1. Đối tượng nghiên cứu Bệnh khảm vàng hại đậu xanh do côn trùng môi giới truyền bệnh là bọ phấn và các đặc điểm nông sinh học của các nguồ n gen đậu xanh được thu thập ở Việt Nam và nhập nội có nguồn gốc địa lý khác nhau. 5.2. Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu bản chất di truyền tính kháng bệnh virus trên cây đậu xanh ở mức phân tử và đặc điểm hình thái nông học của cây đậu xanh bản địa và nhập nội. Giới thiệu nguồn vật liệu cho công tác chọn tạo giống đậu xanh kháng bệnh và năng suất tại Việt Nam. Các thí nghiệm của đề tài được thực hiện ta ̣i phòng thí nghiê ̣m, hê ̣ thố ng nhà lưới, nhà kính của Trung tâm Tài nguyên Thực vật, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới, Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Rau Thế giới (AVRDC, Đài Loan), HTX Nam An Nghiệp, huyện Tuy An, Phú Yên trong giai đoạn từ năm 2011 đến năm 2015 5 CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.1. CÂY ĐẬU XANH 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại của cây đậu xanh Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và được thuần hóa từ 1500 năm trước công nguyên. Các loài đậu xanh trồng sau đó được du nhập đến Đông Nam Á, Châu Phi, Châu Úc, Châu Mỹ và Tây Ấn. Một số lượng lớn đậu xanh, cả dạng hoang dại và dạng trồng, có mặt rộng khắp trên các vùng đồng bằng của tiểu lục địa Ấn Độ. Đậu xanh cũng được phát hiện ở vùng Tây Bắc dãy Himalayas, trên độ cao 1850 m so với mặt nước biển và phân bố khắp vùng nhiệt đới (Mogotsi, 2006). Đậu xanh đã từng được phân loại là Phaseolus aureus Roxb. trước khi được chuyển sang chi Vigna (Lambrides và Godwin, 2006). Chi Vigna có liên quan chặt chẽ với chi Phaseolus tạo thành một nhóm phân loại phức tạp, vì vậy được gọi là phức hệ Phaseolus-Vigna. Verdcourt (1970) đã đề xuất chi Phaseolus chỉ dành riêng cho những loài thuộc Châu Mỹ. Theo đề xuất của ông, đậu xanh và họ hàng thân thuộc của nó đã được chuyển sang chi Vigna. Gần đây, đậu xanh được xếp vào họ Fabaceae. Có hai loài đậu xanh được thuần hóa là Vigna radiata (đậu xanh) và Vigna mungo (đậu xanh đen). Verdcourt (1970) đã tách V. radiata được chia thành ba nhóm phụ: V. radiata var. radiata (đậu xanh trồng hiện nay), V. radiata var. sublobata (dạng hoang dại) và V. radiata var. glabra (có thân, lá và quả nhẵn). Một số đậu thuộc chi Vigna gần gũi với đậu xanh (Bảng 1.1 và Hình 1.1) 6 Bảng 1.1. Một số loài hoang dại và loài trồng thuộc chi Vigna Tên khoa học V. aconitifolia (Jacq.) V. angularis (Wild) V. glabrescens (Marechal, Mascharpa Stainier) V. mungo (L.) Hepper V. radiata (L.) Wilczek V. trilobata (L.) Verdc. V. umbellata (Thunb.) Tên thường gọi Đậu ngài Azukibean Đậu xanh vỏ xám Đậu xanh đen Đậu xanh Đậu Jungli Đậu nho nhe Nguồn gốc Nam Á Bắc Á Nam Á Ấn Độ Ấn Độ Nam Á Nam Á Hình 1.1. Quan hệ di truyền giữa các loài thuộc chi Vinga (Gupta et al, 2014) 1.1.2. Đặc điểm nông sinh học và yêu cầu sinh thái của cây đậu xanh Đậu xanh là cây họ đậu lấy hạt làm thực phẩm quan trọng ở Châu Á trong đó có Việt Nam. Đậu xanh là cây trồng hàng năm, thân thẳng đứng, chiều cao cây đạt từ 0,15 - 1,25m (Lambrides và Godwin, 2006). Lá dạng lá kép ba, các lá chét có hình elip hoặc oval. Hoa mọc thành chùm từ 3 - 40 hoa, tràng hoa có màu vàng hoặc hơi xanh. Quả dài, hình trụ, trên bề mặt quả có nhiều lông. Mỗi quả có từ 7 - 20 hạt nhỏ, hình elip hoặc hình khối. Màu sắc hạt rất đa dạng: thường có màu xanh nhưng cũng có thể có màu vàng, màu ô liu, màu nâu, màu nâu tím hoặc đen, đốm. 7 Đậu xanh là cây sinh trưởng, phát triển nhanh, ưa ấm, có thể chín rất nhanh trong các điều kiện ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới nơi nhiệt độ tối ưu vào khoảng từ 28 - 30°C và luôn cao hơn 15°C. Đậu xanh không yêu cầu lượng nước lớn (lượng mưa từ 600 – 1000 mm/năm) và có khả năng chịu hạn tốt, ngược lại mẫm cảm với úng (Mogotsi, 2006). Đậu xanh dễ tính, có thể trồng ở nhiều chân đất khác nhau nhưng thích hợp nhất ở chân đất cát pha hoặc đất thịt nhẹ thoát nước tốt với pH từ 5 - 8 và cũng chịu được mặn (Mogotsi, 2006). 1.1.3. Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu xanh Đậu xanh là cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh giàu đạm và được trồng phổ biến cho mục đích sử dụng hạt khô. Trong hạt đậu xanh, hàm lượng protein cao (22 - 28%), tinh bột (60 - 65%), hàm lượng chất sắt và a-xít folic cao hơn so với các cây họ đậu khác (Keatinge et al, 2011). Đậu xanh là nguồn cung cấp protein chính cho người Châu Á để giúp cân bằng dinh dưỡng cho chế độ ăn chay. Hạt đậu xanh là mặt hàng xuất khẩu có giá trị, được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, nấu xôi đỗ và một số loại đồ uống giải khát... Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng làm rau hoặc muối dưa (Nguyễn Mạnh Chính và cs., 2008). Giá đỗ làm từ đậu xanh được tiêu thụ trong bữa ăn hàng ngày ở nhiều quốc gia Châu Á kể cả Việt Nam. Đậu xanh còn có giá trị trong y học. Theo y học cổ truyền Việt Nam, hạt đậu xanh có vị ngọt, mùi tanh, tính mát, để cả vỏ tính hàn, có công dụng giải nhiệt, giải độc rất tốt. 8 Một số bộ phận từ cây đậu xanh cũng hữu dụng để làm thức ăn chăn nuôi. Ở Việt Nam, người dân sử dụng thân cây đậu xanh già để làm thức ăn rất giàu dinh dưỡng cho gia súc (Nguyễn Mạnh Chính và cs., 2008). Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ rễ đậu xanh có các nốt sần, chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium nên có khả năng cố định đạm cung cấp cho cây và để lại lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch từ 36-70kg N/ha/năm. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn (Pha ̣m Văn Thiề u, 2009). Ngoài ra, cây đậu xanh là cây trồng có thời gian sinh trưởng ngắn nên có thể tham gia vào nhều công thức canh tác (luân canh, xen canh, gối vụ), góp phần nâng cao giá trị sử dụng đất. 1.1.4. Tình hình nghiên cứu, sản xuất đậu xanh trên thế giới và Việt Nam 1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống đậu xanh Công tác chọn tạo giống đậu xanh trên thế giới được tiến hành theo một số hướng chính sau: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng, tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu bệnh. AVRDC là trung tâm dẫn đầu trên thế giới về nghiên cứu đậu xanh và đã đạt được những tiến bộ đáng kể trong việc phát triển các dòng đậu xanh mới. Các dòng đậu xanh tốt nhất ở đây đã được chuyển giao cho các nhà chọn giống trên khắp thế giới. Con đường tạo giống đậu xanh chủ yếu là lai hữu tính và đột biến. Một số giống đậu xanh siêu trội đã được phát triển cho vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các giống này đều chín sớm và chín đồng bộ (5565 ngày), năng suất và khả năng chống chịu bệnh cao. Các giống này bao gồm: Chainat 60 (Thái Lan), BPI Mg7 (Philippines) và Merpati (Indonesia) (Somta et al., 2009).