Tài liệu Nghiên cứu vi nấm trong nuôi cá tra (pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (channa striata) thâm canh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cần Thơ, 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ĐẶNG THỤY MAI THY NGHIÊN CỨU VI NẤM TRONG NUÔI CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) VÀ CÁ LÓC (Channa striata) THÂM CANH LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Mã ngành 62620301 Cán bộ hƣớng dẫn: PGS. TS. PHẠM MINH ĐỨC PGS. TS. TRẦN THỊ TUYẾT HOA Cần Thơ, 2017 LỜI CẢM TẠ Kính gởi lời chân thành cảm ơn đến Ban Giám Hiệu Trường Đại học Cần thơ, Ban Chủ nhiệm Khoa Thủy sản, Ban lãnh đạo Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa Sau Đại học và các phòng ban khác của Trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành chương trình đào tạo tiến sĩ. Hơn nữa, xin cám ơn Bộ Giáo dục và Đào tạo đã hỗ trợ nguồn kinh phí giúp tôi hoàn thành chương trình nghiên cứu. Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Minh Đức đã dành thời gian quý báu, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án tốt nghiệp. Đặc biệt, xin trân trọng cảm ơn PGS. TS. Trần Thị Tuyết Hoa đã luôn sẵn sàng hướng dẫn, hỗ trợ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Xin chân thành cảm ơn tập thể Quý Thầy Cô và các em thuộc Bộ môn Bệnh học Thủy sản đã giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn, khuyến khích và động viên tôi. Và xin cảm ơn tất cả các bạn nghiên cứu sinh và các em sinh viên đại học đã luôn hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài nghiên cứu. Cuối cùng, xin trân trọng biết ơn sâu sắc gia đình và người thân đã dành cho tôi tất cả tình yêu và sự khuyến khích, ủng hộ để tôi có đủ nghị lực hoàn thành được luận án nghiên cứu này. Xin trân trọng cảm ơn tất cả. NCS ĐẶNG THỤY MAI THY TÓM TẮT Vi nấm là một trong những tác nhân gây bệnh ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) và cá lóc (Channa striata) nuôi ao thâm canh trong những năm gần đây. Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định đặc điểm bệnh học, sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc, hóa chất và thảo dược sử dụng phòng trị bệnh vi nấm làm cơ sở đề xuất biện pháp phòng và trị bệnh do vi nấm. Tổng số 60 mẫu nước, 153 mẫu cá tra và 197 mẫu cá lóc được thu định kỳ tại ao cá tra và cá lóc ở An Giang và Cần Thơ trong 5 tháng của chu kỳ nuôi. Cá tra giống (116 mẫu) và cá tra giai đoạn nuôi thương phẩm (207 mẫu) bệnh trương bóng hơi được thu ở 4 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Vĩnh Long và Đồng Tháp. Cá lóc bệnh (242 mẫu) được thu tại 6 tỉnh An Giang, Cần Thơ, Đồng Tháp, Hậu Giang, Vĩnh Long và Trà Vinh. Kết quả nghiên cứu đã xác định được: (i) chín (09) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium và Tricoderma xuất hiện trong môi trường nước ao nuôi cá tra và cá lóc; (ii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Saprolegnia, Mucor, Aspergillus và Fusarium được phân lập từ cá tra bệnh. Cá tra bị trương bóng hơi có tỉ lệ nhiễm Fusarium đến 94,8%; (iii) Năm (05) giống vi nấm gồm Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus và Fusarium phân lập được từ cá lóc bệnh. Nghiên cứu xác định đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra cho thấy Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra và chủng F1509 có khả năng gây bệnh cao nhất. Mô bóng hơi cá tra bệnh bị biến đổi và cấu trúc của tế bào biểu mô, mô sợi và mô liên kết bị thoái hóa và hoại tử. Đặc biệt, bên trong các xoang bóng hơi có sự hiện diện dày đặc các sợi nấm. Đặc điểm hình thái của các chủng vi nấm gây bệnh giống nhau. Kết quả nghiên cứu cũng xác định 5 chủng Achlya bisexualis có khả năng gây bệnh trên cá lóc trong đó chủng ĐT0232 có độc lực cao nhất. Cá lóc mẫn cảm với vi nấm A. bisexualis hơn cá tra. Nghiên cứu mô bệnh học ghi nhận nhiều sợi nấm xuất hiện trên vết thương ở da, tế bào biểu mô bị hoại tử. Hiện tượng thoái hóa được ghi nhận ở lớp biểu bì, lớp bì và dưới cơ. Sợi nấm nhiễm vào lớp biểu bì đến cơ với sự xuất hiện của một vài u hạt xung quanh sợi nấm. Đặc điểm sinh học của FIESC và A. bisexualis giống nhau. Nhiệt độ thích hợp cho hai loài này phát triển từ 28-33C, pH 6-8, độ mặn 0-0,5%. Vi nấm sử dụng carbohydrate chủ yếu là glucose và sucrose. Trong môi trường có NO2 nồng độ 5mM thì FIESC và A. bisexualis có thể tồn tại và phát triển. Bronopol và iodne ức ii chế FIESC ở nồng độ ≥400 mg/L và CuSO4 ≥200 mg/L. A. bisexualis bị ức chế ở nồng độ bronopol và CuSO4 ≥100 mg/L, iodine ≥200 mg/L. Cỏ mực ức chế sự phát triển của A. bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex tốt hơn diệp hạ châu. Sử dụng thức ăn bổ sung 10 g cỏ mực/kg thức ăn có hiệu quả hạn chế nhiễm vi nấm trên cá lóc và cá tra. Từ khóa: Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus), cá lóc (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti complex, bệnh nấm. iii ABSTRACT Fungi have been one of the pathogen causing diseases on striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus) and snakehead fish (Channa striata) cultured in intensive ponds in recent years. The aim of present study is to investigate pathogenic and biological characteristics of some disease-causing fungi on striped catfish and snakehead and to evaluate effects of chemicals and herbal extracts on the prevention and treatment of fungal diseases as the basis for the management of these diseases. A total of 60 water samples, 153 striped catfish samples and 197 snakehead fish samples were collected in ponds in An Giang and Can Tho over a period of 5-month production cycle. Catfish fingerlings (116 samples) and swollen swim bladder fish aldults (207 samples) were collected in 4 provinces (An Giang, Can Tho, Vinh Long and Dong Thap). Snakehead fish diseases (242 samples) were also collected from 6 provinces (An Giang, Can Tho, Dong Thap, Hau Giang, Vinh Long and Tra Vinh). Results showed that (i) nine fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Mucor, Rhizopus, Acremonium, Aspergillus, Fusarium and Tricoderma were identified from the water samples; (ii) five fungal genera Fusarium, Aspergillus, Achlya, Saprolegnia and Mucor were identified from striped catfish. Fusarium was detected as the causative agent of swollen swim bladder in striped catfish with a high infection rate of 94.8% (iii) five fungal genera Achlya, Protoachlya, Saprolegnia, Aspergillus và Fusarium were identified from snakehead. This study showed that Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) caused swollen swim bladder in striped catfish and the F1509 strain had the highest virulence. Histopathology of swim bladder was changed and the epithelial cell, fibrio and connective tissue showed degeneration and necrosis. A dense presence of fungal hyphae was found in the sinus of the swim bladder. Morphological characteristics of the strains were similar. Another result was that the five strains of Achlya bisexualis were the causative agents in snakehead, of which the ĐT0232 strain had the highest virulence. Snakehead was sensitive to fungal diseases more than striped catfish. A histopathological examination of the snakehead skin showed degeneration in the epidermis, dermis and underlying muscle. The hyphae were observed to penetrate into the epidermis to the musculature with some granulomatous response surrounding the hyphae. iv Biological characteristics of Achlya bisexualis and Fusarium incarnatumequiseti complex were the same. The optimal temperature of FIESC ranged from 28oC to 33oC, pH level was 6-8 and salinity was 0-0,5%. The strains could use glucose and sucrose. FIESC and A. bisexualis could survive and grow in the media supplied with nitrite (5mM). Bronopol and iodne inhibited FIESC, which were at the concentration of ≥400 ppm and CuSO4 at ≥200 ppm. Similarly, Achlya bisexualis was inhibited with concentrations of bronopol and CuSO4 at ≥100 ppm, and iodine at ≥200 ppm. False daisy (Eclipta prostrata) showed better inhibition than chamber bitter (Phyllanthus niruri) extracts in the hyphal growth of A. bisexualis and Fusarium incarnatum-equiseti complex. Using false daisy with the concentration of 10g/kg was effective with fungal diseases on both P. hypophthalmus and C. striata. Keyword: Striped catfish (Pangasianodon hypophthalmus), snakehead fish (Channa striata), Achlya bisexualis, Fusarium incarnatum-equiseti species complex, fungal diseases. v Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt nam Độc lập – Tự do – Hạnh phúc LỜI CAM KẾT Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần thơ, ngày tháng năm 2017 Nghiên cứu sinh ĐẶNG THỤY MAI THY vi MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ ....................................................................................................................... i TÓM TẮT ............................................................................................................................. ii ABSTRACT.......................................................................................................................... iv LỜI CAM KẾT ..................................................................................................................... vi MỤC LỤC ............................................................................................................................ vii DANH SÁCH BẢNG ........................................................................................................... xi DANH SÁCH HÌNH ............................................................................................................ xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................................. xv Chƣơng 1: GIỚI THIỆU .................................................................................................... 1 1.1 Giới thiệu .................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................. 2 1.3 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................. 3 1.4 Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 3 1.5 Ý nghĩa của luận án .................................................................................................. 3 1.6 Điểm mới của luận án............................................................................................... 3 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................ 5 2.1 Đặc điểm của vi nấm ................................................................................................ 5 2.1.1 Cấu tạo vi nấm ................................................................................................ 5 2.1.2 Phân loại ......................................................................................................... 6 2.1.3 Đặc điểm sinh sản của vi nấm ......................................................................... 8 2.2 Một số nghiên cứu vi nấm trong môi trường nước ................................................... 10 2.3 Nghiên cứu vi nấm gây bệnh trên động vật thủy sản ............................................... 12 2.3.1 Bệnh do vi nấm Saprolegniasis ...................................................................... 12 2.3.2 Bệnh do vi nấm Fusarium............................................................................... 17 2.3.3 Bệnh do vi nấm khác....................................................................................... 20 2.3.4 Bệnh do vi nấm trên cá ở Việt Nam ................................................................ 21 2.4 Nghiên cứu hóa chất phòng trị bệnh do vi nấm ở động vật thủy sản ....................... 22 2.4.1 Bronopol ......................................................................................................... 22 2.4.2 Iodine .............................................................................................................. 23 2.4.3 Đồng sunfat ..................................................................................................... 24 2.5 Một số nghiên cứu thảo dược phòng trị bệnh ở động vật thủy sản .......................... 25 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................................. 28 3.1 Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................... 28 3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................ 28 vii 3.3 Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 28 3.3.1 Môi trường nuôi cấy vi nấm, thuốc kháng sinh, ............................................. 28 3.3.2 Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................... 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 29 3.4.1 Xác định thành phần giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi ................. 30 3.4.1.1 Phương pháp thu mẫu ............................................................................ 30 3.4.1.2 Phương pháp phân tích mẫu nước ......................................................... 30 3.4.1.3 Phương pháp định danh vi nấm ............................................................. 30 3.4.2 Xác định thành phần giống loài vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc ............... 31 3.4.2.1 Phương pháp thu mẫu ............................................................................ 31 3.4.2.2 Phương pháp phân lập vi nấm ............................................................... 33 3.4.3 Nghiên cứu đặc điểm bệnh học vi nấm gây bệnh ở cá tra và cá lóc ............... 33 3.4.3.1 Nguồn cá tra và cá lóc khỏe sử dụng ở thí nghiệm cảm nhiễm ............. 33 3.4.3.2 Phương pháp nuôi cấy sinh bào tử vi nấm ............................................ 34 3.4.3.3 Thí nghiệm cảm nhiễm 1 trên cá tra: ..................................................... 34 3.4.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm 2 trên cá tra: ..................................................... 35 3.4.3.5 Thí nghiệm cảm nhiễm 3 trên cá tra: ..................................................... 36 3.4.3.6 Thí nghiệm cảm nhiễm 4 trên cá lóc: .................................................... 37 3.4.3.7 Thí nghiệm cảm nhiễm 5 trên cá lóc: .................................................... 38 3.4.3.8 Thí nghiệm cảm nhiễm 6 trên cá tra và cá lóc:...................................... 39 3.4.4 Phương pháp định danh vi nấm ...................................................................... 40 3.4.4.1 Phương pháp định danh truyền thống.................................................... 40 3.4.4.2 Phương pháp sinh học phân tử định danh vi nấm .................................. 40 3.4.5 Phương pháp mô học ...................................................................................... 42 3.4.6 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc ........................................................................................................................ 42 3.4.6.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phát triển của vi nấm ............... 42 3.4.6.2 Ảnh hưởng của pH đến khả năng phát triển của vi nấm ....................... 43 3.4.6.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng phát triển của vi nấm................. 43 3.4.6.4 Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm ........................................... 43 3.4.6.5 Khả năng sử dụng nitrite của vi nấm ..................................................... 44 3.4.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm ..................................................................................................... 44 3.4.8 Thí nghiệm sử dụng cỏ mực phòng bệnh do vi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm ..................................................................................................................... 46 3.4.9 Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................. 47 viii CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 48 4.1 Vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc .................................................... 48 4.1.1 Thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc ....................... 48 4.1.2 Đặc điểm hình thái vi nấm trong môi trường ao nuôi .......................... 51 4.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc theo chu kỳ nuôi .................... 57 4.3 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra ở thời điểm cá bệnh ...................................... 59 4.3.1 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra giống.................................................... 59 4.3.2 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá tra bệnh giai đoạn nuôi thương phẩm ....... 62 4.4 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá tra .................................................... 63 4.4.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm ở cá tra ............................................. 63 4.4.2 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp. ở cá tra ............................... 65 4.4.3 Khả năng gây bệnh của các chủng Fusarium sp. ở các mật độ khác nhau ..... 67 4.4.4 Biến đổi mô học ở cá tra bệnh do Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) ..................................................................................................... 69 4.4.5 Kết quả định danh vi nấm gây bệnh trên cá tra............................................... 72 4.4.5.1 Đặc điểm hình thái Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) gây bệnh trên cá tra .................................................................................................... 72 4.4.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............. 73 4.5 Thành phần vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh .............................................................. 76 4.5.1 Dấu hiệu bệnh lý ............................................................................................. 76 4.5.2 Thành phần và tỉ lệ vi nấm nhiễm trên cá lóc bệnh ........................................ 77 4.6 Đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá lóc.................................................... 79 4.6.1 Khả năng gây bệnh của 5 giống vi nấm phân lập ở cá lóc .............................. 79 4.6.2 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc ........................................ 81 4.6.3 Khả năng gây bệnh của Achlya bisexualis ở cá lóc và cá tra .......................... 84 4.6.4 Biến đổi mô học ở cá lóc bệnh do vi nấm ....................................................... 86 4.6.5 Kết quả định danh nấm gây bệnh trên cá lóc .................................................. 90 4.6.5.1 Đặc điểm hình thái của Achlya gây bệnh trên cá lóc .............................. 90 4.6.5.2 Kết quả định danh vi nấm bằng phương pháp sinh học phân tử ............. 92 4.7 Đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc .................................. 94 4.7.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi nấm .................................... 94 4.7.2 Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi nấm ............................................ 96 4.7.3 Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi nấm ..................................... 98 4.7.4 Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm ..................................................... 99 4.7.5 Ảnh hưởng của nitrite đến sự phát triển của vi nấm ....................................... 100 ix 4.8 Ảnh hưởng của hóa chất đến sự phát triển của Achlya bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC)........................................................................... 101 4.8.1 Bronopol ......................................................................................................... 101 4.8.2 CuSO4 ............................................................................................................. 104 4.8.3 Iodine .............................................................................................................. 107 4.9 Ảnh hưởng của cỏ mực và diệp hạ châu đến sự phát triển của Achlya bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) .......................................................... 111 4.10 Thử nghiệm bổ sung cỏ mực vào thức ăn cho cá tra và cá lóc cảm nhiễm vi nấm 113 4.10.1 Kết quả cảm nhiễm vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex trên cá tra cho ăn thức ăn bổ sung cỏ mực ................................................................................ 113 4.10.2 Kết quả cảm nhiễm vi nấm Achlya bisexualis trên cá lóc cho ăn thức ăn bổ sung cỏ mực ............................................................................................................. 114 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................................ 117 5.1 Kết luận .................................................................................................................... 117 5.2 Đề xuất ..................................................................................................................... 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 119 PHỤ LỤC A.......................................................................................................................... 138 PHỤ LỤC B .......................................................................................................................... 141 PHỤ LỤC C .......................................................................................................................... 144 PHỤ LỤC D.......................................................................................................................... 148 PHỤ LỤC E .......................................................................................................................... 153 PHỤ LỤC F .......................................................................................................................... 158 PHỤ LỤC G.......................................................................................................................... 176 x DANH SÁCH BẢNG Số bảng 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 3.18 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 Tên bảng Số mẫu cá tra thu định kỳ ở ao nuôi thâm canh Số mẫu cá tra bệnh thu tại các địa điểm Số mẫu cá lóc thu định kỳ ở ao nuôi thâm canh Số mẫu cá lóc bệnh thu tại các địa điểm Các chủng vi nấm thí nghiệm cảm nhiễm Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm 5 giống vi nấm ở cá tra Các chủng Fusarium sp. ở thí nghiệm cảm nhiễm Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Fusarium sp. ở cá tra Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Fusarium sp. ở mật độ bào tử khác nhau trên cá tra Các chủng vi nấm thí nghiệm cảm nhiễm Nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm 5 giống vi nấm ở cá lóc Các chủng Achlya bisexualis thí nghiệm cảm nhiễm Các nghiệm thức thí nghiệm cảm nhiễm Achlya bisexualis ở cá lóc Thí nghiệm cảm nhiễm Achlya bisexualis ở cá lóc và cá tra Số lượng mẫu cá thu phân tích mô học Hóa chất và nồng độ sử dụng trong nghiên cứu Nồng độ thảo dược sử dụng trong thí nghiệm Nghiệm thức thí nghiệm sử dụng cỏ mực ở cá tra và cá lóc Thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc ở các địa điểm thu mẫu Thành phần và số chủng vi nấm trong ao nuôi cá tra và cá lóc theo chu kỳ 5 tháng nuôi Thành phần và số chủng vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc theo chu kỳ 5 tháng nuôi Thành phần vi nấm nhiễm ở các cơ quan của cá tra và cá lóc Số lượng chủng vi nấm phân lập ở cá tra bệnh Tỉ lệ nhiễm Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) trên bóng hơi cá tra cảm nhiễm với mật độ bào tử khác nhau Kết quả mối tương quan trình tự ITS rDNA của 5 chủng Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) với các chủng trong FUSARIUM-ID Thành phần vi nấm trên cá lóc ở các địa điểm thu mẫu Tỉ lệ nhiễm vi nấm ở các cơ quan trên cá lóc xi Trang 31 32 32 33 34 35 35 36 37 37 38 38 39 40 42 44 45 47 48 50 57 58 63 68 74 77 78 Số bảng 4.10 4.11 4.12 4.13 4.14 4.15 4.16 4.17 4.18 4.19 4.20 4.21 4.22 4.23 Tên bảng Biến đổi mô học ghi nhận ở các tiêu bản mẫu mô Kết quả mối tương quan trình tự ITS rDNA của vi nấm Achlya với các chủng trong Genbank Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi nấm Ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi nấm Ảnh hưởng của độ mặn đến sự phát triển của vi nấm Khả năng sử dụng carbohydrat của vi nấm Ảnh hưởng của nitrite đến sự phát triển của vi nấm Khả năng ức chế của bronopol đối với A.bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các thời gian thí nghiệm Khả năng ức chế của CuSO4 đối với A.bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các mức thời gian Khả năng ức chế của iodine đối với A.bisexualis và Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) ở các mức thời gian Ảnh hưởng của nồng độ cỏ mực và diệp hạ châu đến sợi nấm Ảnh hưởng của cỏ mực và diệp hạ châu đến tỉ lệ nẩy mầm của bào tử vi nấm Tỉ lệ chết và tỉ lệ nhiễm vi nấm ở cá tra cảm nhiễm Fusarium incarnatum-equiseti complex Tỉ lệ chết và tỉ lệ nhiễm vi nấm ở cá lóc cảm nhiễm Achlya bisexualis xii Trang 86 92 94 97 98 99 101 103 106 108 111 112 114 114 DANH SÁCH HÌNH Số Tên hình Trang hình 2.1 5 Cấu trúc của vi nấm Đặc điểm hình thái cơ bản túi động bào tử của vi nấm thuộc lớp 2.2 13 Oomycotae 2.3 Vòng đời của vi nấm Saprolegnia 14 2.4 Hình thái bào tử vi nấm Fusarium 18 3.1 Sơ đồ nghiên cứu cá bệnh do vi nấm 29 4.1 49 Tỉ lệ % vi nấm trong môi trường nước ao nuôi cá tra và cá lóc thâm canh 4.2 Đặc điểm hình thái vi nấm Achlya và Saprolegnia 52 4.3 53 Đặc điểm hình thái vi nấm Aspergillus và Fusarium 4.4 Đặc điểm hình thái vi nấm Mucor và Rhizopus 54 4.5 Đặc điểm hình thái vi nấm Geotrichum, Acremonium và Trichoderma 56 4.6 Cá tra giống (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi nấm 60 4.7 Tỉ lệ % các giống vi nấm nhiễm ở cá tra giống 60 4.8 Tỉ lệ % vi nấm nhiễm ở các cơ quan của cá tra giống 61 4.9 Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị bệnh trương bóng hơi 62 4.10 Tỉ lệ chết tích lũy (%)của cá tra cảm nhiễm các giống vi nấm 64 4.11 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá tra nhiễm vi nấm Fusarium sp. 65 4.12 Cá tra cảm nhiễm vi nấm Fusarium sp. 66 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá tra nhiễm Fusarium sp. ở các mật độ bào tử 4.13 67 khác nhau 4.14 Mô bóng hơi cá tra bệnh thu ở ao nuôi thâm canh (H&E) 69 4.15 Mô bóng hơi cá tra cảm nhiễm Fusarium incarnatum-equiseti complex 71 4.16 Đặc điểm hình thái của vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex 73 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS rDNA của 5 chủng vi nấm 4.17 75 Fusarium incarnatum-equiseti species complex (FIESC) 4.18 Cá lóc (Channa striata) bệnh do vi nấm 76 4.19 Tỉ lệ chết tích lũy (%)của cá lóc cảm nhiễm các giống vi nấm 79 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá lóc cảm nhiễm Achlya bisexualis ở mật độ 4.20 81 106 bào tử/ml Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá lóc cảm nhiễm Achlya bisexualis ở mật độ 4.21 82 104 bào tử/ml 4.22 Cá lóc cảm nhiễm vi nấm Achlya bisexualis 83 4.23 Tỉ lệ chết tích lũy (%) của cá lóc và cá tra cảm nhiễm Achlya bisexualis 85 4.24 Cá cảm nhiễm vi nấm Achlya bisexualis 85 xiii Số Tên hình Trang hình 4.25 Biến đổi mô da cá lóc nhiễm vi nấm (H&E) 87 4.26 Biến đổi mô cơ cá lóc nhiễm vi nấm (200x) 89 4.27 Đặc điểm hình thái của vi nấm Achlya bisexualis 91 Cây phát sinh loài dựa trên trình tự ITS rDNA của vi nấm Achlya 4.28 93 bisexualis 4.29 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tỉ lệ nẩy mầm (%) của bào tử vi nấm 95 4.30 Ảnh hưởng của bronopol đến sự phát triển của sợi nấm 102 4.31 Ảnh hưởng của bronopol đến sự phát triển của bào tử 103 4.32 Ảnh hưởng của CuSO4 đến sự phát triển của sợi nấm 105 4.33 Ảnh hưởng của CuSO4 đến sự phát triển của bào tử 105 4.34 Ảnh hưởng của iodine đến sự phát triển của sợi nấm 107 4.35 Ảnh hưởng của iodine đến sự phát triển của bào tử 108 xiv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BioEdit Biological sequence alignment editor BP Bronopol ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long DNA Deoxyribose Nucleic Acid dNTP Deoxyribonucleoside Triphosphate FIESC Fusarium incarnatum-equiseti complex GY Glucose Yeast GYA Glucose Yeast Agar ITS Internal Transcribed Space MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis MIC Nồng độ ức chế tối thiểu MT 2-methyl-4isothiazolin-3-one NCBI National of Centre Biotechnology Information NT Nghiệm thức NTĐC Nghiệm thức đối chứng PCR Polymerase Chain Reaction PDA Potato Dextrose Agar rDNA Ribosomal Deoxyribose Nucleic Acid RNA Ribonucleic Acid SA Sabouraud Agar Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA xv CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Giới thiệu Vi nấm là một trong những tác nhân gây bệnh ở động vật thủy sản và bệnh do vi nấm đã và đang gây thiệt hại cho nghề nuôi thủy sản ở nhiều quốc gia trên thế giới. Vi nấm bậc thấp với đa dạng thành phần loài gây bệnh và nhiễm ở các giai đoạn khác nhau trên động vật thủy sản, trong đó đặc biệt là Achlya và Saprolegnia là các giống vi nấm thường gây bệnh trên các loài cá nước ngọt với các sợi nấm phát triển nhanh và tạo thành búi màu trắng như bông gòn (Bruno and Woo, 1994; Yanong, 2003). Vi nấm nhiễm trên động vật thủy sản thông thường là bệnh mãn tính, tuy nhiên cũng gây thiệt hại kinh tế cho nghề nuôi thủy sản. Điển hình như nghiên cứu về các giai đoạn phát triển của cá chình (Anguilla Anguilla), cá hồi bạc (Oncorhynchus kisutch) nuôi ở Nhật Bản cho thấy tỉ lệ cá chết hằng năm do nhiễm vi nấm rất cao, khoảng 50% (Bruno and Woo, 1994; Hatai and Hoshiai, 1994). Tỉ lệ cá chết ở 5 loài cá hồi nuôi ở Nhật Bản lên đến 100% khi bị nhiễm vi nấm S. parasitica (Hussein and Hatai, 2002). Vi nấm Saprolegnia sp. gây cảm nhiễm trên cá nheo (Ictalurus punctatus) cho thấy 92% cá nheo bị bệnh có dấu hiệu tổn thương trên da và tỉ lệ chết lên đến 67% sau 21 ngày (Bly et al., 1992). Bên cạnh đó, vi nấm bậc cao bao gồm là Fusarium moniliforme và F. udum được phát hiện gây bệnh phổ biến trên một số loài cá nuôi nước ngọt ở Ấn Độ như cá chành dục (Channa punctatus), cá chốt giấy (Mystus tengra), cá leo (Wallago attu), cá trôi Ấn Độ (Labeo rohita), cá chạch bông (Mastaceamblus armatus), cá đòng đong (Puntius sophore) và cá ngạnh (Barbus rana) (Deepa et al., 2000). Ở Ai Cập, nghiên cứu đã phát hiện cá dĩa (Symphysodon) bị nhiễm vi nấm F. solani, F. oxysporum và F. moniliform với tỉ lệ lần lượt là 50; 33,3 và 16,7% (El-Ghany et al., 2014). Ở Tây Ban Nha, nhóm nghiên cứu của Cutuli et al. (2015) tìm thấy sự hiện diện của F. oxysporum ở vết thương dưới da cá rô phi (Oreochromis niloticus). Đặc biệt một số nghiên cứu gần đây đã phát hiện các vi nấm phức nhiễm trên động vật thủy sản như F. incarnatum-equiseti complex (FIESC) và F. solani species complex (FSSC) nhiễm trên trứng cá (Odontesthes bonariensis) hay F. oxysporum species complex (FOSC) nhiễm trên cơ cá vằn (Danio rerio) nuôi ở Hàn Quốc (Marino et al., 2016; Kulatunga et al., 2017). 1 Cá tra là loài cá nuôi truyền thống mang lại giá trị kinh tế và xuất khẩu chủ lực của Việt Nam. Hơn nữa bệnh do vi nấm đã xuất hiện cũng làm giảm hiệu quả kinh tế và ảnh hưởng đến nghề nuôi cá này, điển hình như bệnh trương bóng hơi trên cá tra. Bệnh xuất hiện trong một vài năm gần đây và các mẫu cá tra bệnh đã ghi nhận được các loài Fusarium oxysporum, Fusarium subglutinans và Fusarium sp. nhiễm trên bóng hơi (Phạm Minh Trúc và ctv., 2012; Phạm Minh Đức và ctv., 2012). Nhưng nghiên cứu này chỉ dừng lại ở dạng định tính, chưa xác định tác nhân gây ra bệnh trương bóng hơi và đặc điểm bệnh học của vi nấm Fusarium một cách hệ thống, thông tin về bệnh học vẫn còn giới hạn. Tương tự như cá tra, nghiên cứu về bệnh cá lóc nói chung và bệnh do nấm gây ra nói riêng vẫn còn hạn chế. Cho đến nay, các nghiên cứu về bệnh vi nấm trên cá lóc đang dừng lại ở mức xác định thành phần loài vi nấm nhiễm ở cá bệnh. Nghiên cứu của Kitancharoen et al. (1995) lần đầu tiên phát hiện Achlya klebsiana nhiễm trên cá lóc ở Myanmar. Ngoài ra, Saraswathi et al. (2015) cho biết trong số 9 loài cá nghiên cứu thì cá lóc là đối tượng dễ bị nhiễm đồng thời nhiều loài vi nấm Achlya khác nhau. Vi nấm Achlya bisexualis được ghi nhận nhiễm trên trứng cá rô phi, trứng cá tra dầu và cá rô phi bột ở Thái Lan (Panchai et al., 2007; Abking et al., 2012). Ở Việt Nam, kết quả khảo sát mầm bệnh trên cá lóc nuôi thâm canh trong ao đã phân lập được 4 giống vi nấm là Achlya sp., Fusarium sp., Acremonium sp., Geotrichum sp. và chỉ xuất hiện ở 3 tháng nuôi đầu tiên, đặc biệt vi nấm Achlya sp. chỉ xuất hiện ở tháng nuôi thứ nhất và thứ ba (Phạm Minh Đức và ctv., 2012). Như vậy, nghiên cứu một cách hệ thống về mầm bệnh vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc cũng như xác định tác nhân gây bệnh do vi nấm và khảo sát hóa chất, thảo dược diệt vi nấm là cần thiết nhằm có được hệ thống cơ sở dữ liệu khoa học để kiểm soát mầm bệnh này. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định thành phần vi nấm trong môi trường ao nuôi cá tra và cá lóc thâm canh, đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh trên cá tra và cá lóc, hóa chất và thảo dược sử dụng phòng trị bệnh vi nấm. Từ đó cung cấp thông tin về vi nấm và bệnh do vi nấm trên cá, đóng góp các dữ liệu khoa học làm cơ sở đề xuất giải pháp phòng trị bệnh do vi nấm gây ra góp phần quản lý dịch bệnh tổng hợp và phát triển nghề nuôi cá bền vững. 2 1.3 Phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu tập trung tìm hiểu về mầm bệnh vi nấm nhiễm trên cá tra, cá lóc và vi nấm xuất hiện trong môi trường nước ao nuôi nhằm cung cấp dẫn liệu khoa học về mầm bệnh vi nấm phục vụ công tác đào tạo và ứng dụng cho thực tiễn sản xuất. 1.4 Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu thành phần giống vi nấm trong môi trường nuôi và trên cá tra bệnh và cá lóc bệnh. 2) Nghiên cứu đặc điểm bệnh học của vi nấm gây bệnh ở cá tra và cá lóc. 3) Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi nấm gây bệnh. 4) Nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm gây bệnh và thử nghiệm phòng bệnh do nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm. 1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu Kết quả nghiên cứu cung cấp và bổ sung thông tin chuyên về vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc. Đặc biệt vi nấm Achlya bisexualis là tác nhân gây bệnh trên cá lóc và Fusarium incarnatum-equiseti complex là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi trên cá tra nuôi thâm canh và các đặc điểm bệnh học của hai loài vi nấm này. Đồng thời, nghiên cứu đã đánh giá ảnh hưởng của hóa chất và thảo dược đến vi nấm gây bệnh, đây là cơ sở khoa học cần thiết để đề xuất các giải pháp hiệu quả trong phòng và trị bệnh do vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc. Bên cạnh ý nghĩa khoa học và ứng dụng trong thực tiễn, luận án còn giúp nâng cao kiến thức, năng lực nghiên cứu cho người tham gia và là nguồn tài liệu tham khảo bổ sung cho nghiên cứu và giảng dạy sinh viên và học viên cao học. 1.6 Điểm mới của luận án Đã định danh và lưu giữ được các giống loài vi nấm trong môi trường ao nuôi thâm canh cũng như vi nấm nhiễm trên cá tra và cá lóc. Nghiên cứu đã xác định vi nấm Fusarium incarnatum-equiseti complex (FIESC) là tác nhân gây bệnh trương bóng hơi ở cá tra. Ứng dụng phương pháp truyền thống và sinh học phân tử xác định các đặc điểm hình thái, di truyền và sinh học của các chủng FIESC gây bệnh. Mô tả đặc điểm mô bệnh học bóng hơi bị bệnh do FIESC. 3