Tài liệu Phân lập gen mã hóa enzyme gdp d mannose 3.5 epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin c từ cây quýt miền núi phía bắc việt nam​

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC \ THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN THỊ KIM CHI PHÂN LẬP GEN MÃ HÓA ENZYME GDP-D-MANNOSE-3’.5’- EPIMERASE LIÊN QUAN ĐẾN TỔNG HỢP VITAMIN C TỪ CÂY QUÝT MIỀN NÚI PHÍA BẮC VIỆT NAM Ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8.42.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các cán bộ Phòng DNA ứng dụng, Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiệm của đề tài. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài luận văn. Đề tài luận văn thuộc chương trình đào tạo nghiên cứu sinh và cao học của Bộ môn Di truyền & Sinh học hiện đại, khoa Sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018 Tác giả Nguyễn Thị Kim Chi ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................... ii MỤC LỤC ..........................................................................................................iii DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ................................................... iv DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2 3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................... 3 1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt .......................... 3 1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt ................................................................. 3 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt ................................................................ 3 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt ....................................................... 4 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật .................................................................. 6 1.2.1. Ascorbic acid ............................................................................................. 6 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C ......................................................... 7 1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền ....... 11 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17 2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ....................................................................... 17 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................. 17 2.1.2. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17 2.2.1. Phương pháp thu mẫu .............................................................................. 17 iii 2.2.2. Phương pháp xác định trình tự gen.......................................................... 17 2.3. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................... 22 2.4. Địa điểm nghiên cứu và hoàn thành luận văn ............................................ 22 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23 3.1. Nhân bản và giải trình tự gen GDP-D từ DNA của giống quýt BS-LS ..... 23 3.1.1. Kết quả nhân bản gen GDP-D bằng kỹ thuật PCR ................................. 23 3.1.2. Kết quả tách dòng gen GDP-D ................................................................ 24 3.1.3. Đặc điểm của trình tự gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS ......... 25 3.2. Sự đa dạng về trình tự nucleotide và trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D ........................................................................................................ 30 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 34 1. Kết luận .......................................................................................................... 34 2. Đề nghị........................................................................................................... 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 35 iv DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh bp base pair CIAA 24 Chloroform: 1 isoamylalcol CTAB Cetyl trimetyl amomnium bromide DEPC Diethyl Pyrocarbonate DNA Deoxyribonucleotide acid DNTPs Deoxynucleotide triphosphate GDP-D GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase kb kilo base NCBI National Center for Biotechology Information PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris - Acetate - EDTA iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen GDP-D ............................. 19 Bảng 2.2. Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen GDP-D ....................... 19 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng gắn gen GDP-D vào vector tách dòng pBT..... 20 Bảng 2.4. Thành phần phản ứng colony - PCR ............................................. 21 Bảng 3.1. Những vị trí nucleotide sai khác giữa hai trình tự nucleotide của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946................. 27 Bảng 3.2. Những vị trí amino acid sai khác giữa hai trình tự protein suy diễn của gen GDP-D của giống quýt BS-LS và HQ224946........ 29 Bảng 3.3. Trình tự gen mang mã số trên GenBank được sử dụng phân tích.... 30 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và các trình tự trên GenBank ........................................................................................ 31 Bảng 3.5. Hệ số tương đồng và hệ số phân ly của BS-LS và các trình tự trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D........................................................................................... 32 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình1.1. Các dạng Ascorbic acid trong tự nhiên .......................................... 7 Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp Ascorbic acid ............................................. 8 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR từ DNA tổng số của mẫu quýt BS-LS với cặp mồi GDP-D-F và GDP-D-R................................. 23 Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm colony -PCR từ khuẩn lạc ................ 24 Hình 3.3. Đặc điểm trình tự nucleotide của mẫu BS-LS thu được bằng máy xác định trình tự nucleotide tự động ..................................... 25 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với trình tự gen GDP-D trên GenBank mang mã số HQ224946 ................................................................. 27 Hình 3.5. Kết quả phân tích sự tương đồng giữa trình tự nucleotide của gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS với một số trình tự gen đã công bố trên GenBank ....................................................... 28 Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen GDP-D phân lập từ giống quýt BS-LS và từ gen GDP-D mang mã số HQ224946 trên GenBank. ............................................................. 29 Hình 3.7. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự nucleotide của gen GDP-D........................................................................................... 31 Hình 3.8. Sơ đồ hình cây mô tả mối quan hệ của BS-LS với các trình tự đã công bố trên GenBank dựa trên trình tự amino acid suy diễn của gen GDP-D ............................................................................. 32 vi MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây quýt (Citrus recutilata Blanco) là giống cây ăn quả được nhiều người biết đến với vị ngọt thanh, mùi thơm đặc trưng, chứa nhiều vitamin, khoáng chất và dinh dưỡng cần thiết cho con người. Quýt được khuyến khích sử dụng hằng ngày bởi các chuyên gia dinh dưỡng. Quýt không chỉ là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng mà còn đóng vai trò tích cực trong phát triển kinh tế ở nhiều địa phương.Trồng quýt đem lại thu nhập cao cho các hộ làm vườn so với các cây nông nghiệp khác, trung bình từ 80 - 100 triệu đồng/ha/năm. Cây quýt được trồng lâu đời ở miền núi phía Bắc Việt Nam có sự thích nghi sinh thái ở diện hẹp, do đó đòi hỏi khá kỹ tính về điều kiện canh tác, nông hóa thổ nhưỡng hay tiểu vùng khí hậu. Điều này dễ nhận thấy mỗi loại quýt chỉ trồng phù hợp trên một địa bàn đặc hữu với các giống thường gặp như quýt sen (Phú Thọ), quýt hồng (Hà Giang), quýt đường (Lào Cai), quýt Quang Thuận (Bắc Kạn), quýt Bắc Hà (Lào Cai), quýt giấy (Tuyên Quang), quýt Bắc Sơn (Lạng Sơn) [4]. Quả quýt chứa hàm lượng vitamin C cao, khoảng 30mg- 36mg vitamin C trong 100gram quả. Vitamin C tốt cho tóc, da, tiêu hóa, hệ thống miễn dịch và cân bằng trọng lượng cơ thể. Mỗi giống quýt lại có hàm lượng vitamin C khác nhau, điều này ảnh hưởng đến mùi vị, độ chua ngọt của mỗi giống quýt. Nghiên cứu đặc điểm trình tự các gen tham gia tổng hợp vitamin C, và tìm hiểu sự đa dạng của trình tự các gen này ở các giống quýt địa phương là cơ sở đề xuất sử dụng đa dạng hóa trong việc chọn giống cho vùng trồng chuyên canh. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen mã hóa enzyme GDP-D-mannose-3’.5’- epimerase liên quan đến tổng hợp vitamin C từ cây quýt miền núi phía Bắc Việt Nam.” 1 2. Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá được đặc điểm trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen liên quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt miền núi phía Bắc. 3.2. So sánh trình tự gen, trình tự amino acid suy diễn của enzyme liên quan đến tổng hợp vitamin C ở mẫu quýt nghiên cứu với một số trình tự đã công bố trên GenBank. 2 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Phân loại thực vật học và đặc điểm sinh học của cây quýt 1.1.1. Phân loại thực vật học cây quýt Cây quýt có tên khoa học là Citrus recutilata Blanco (tên khác: Citrus suhuiensis Hort. ex Tanaka hoặc: Citrus deliciosa Tennre) [6], [11]. Quýt thuộc chi Cam chanh (Citrus), họ Cam quýt (Rutaceae), bộ Cam quýt (Rutales). Tập đoàn quýt trồng khu vực miền núi phía Bắc Việt Nam được xác định với nhiều giống quýt (Variele) trong loài Citrus recutilata Blanco với bộ nhiễm sắc thể 2n = 18, quýt mang những đặc tính đặc trưng của chi quả có múi Citrus ở đặc điểm có các túi chứa tuyến dầu và hoa lưỡng tính, thụ phấn nhờ sâu bọ [11]. 1.1.2. Đặc điểm sinh học của cây quýt Cây quýt có tuổi thọ trung bình từ 20 - 50 năm, trong đó thời kỳ cho thu hoạch quả tập trung khoảng 15 - 25 năm. Quýt là cây thân gỗ, thường xanh, thiết diện tròn, màu nẫu thâm, cao 23m, hình dạng ngoài của cây thường có hình chóp, thân cây có gai, phần trong vỏ cây chứa nhiều túi tiết tinh dầu thơm. Cây trồng bằng hạt thường có một gốc lớn, cây trồng bằng cành chiết thì có nhiều cành gốc. Quýt có rễ cọc khỏe , lan rộng, rễ phát triển tối ưu ở nhiệt độ 10-37oC, khi nhiệt độ cao hơn hay thấp hơn cộng với độ ẩm của đất là 1% thì sự phát triển của rễ sẽ ngừng lại hoặc tỷ lệ oxy trong đất từ 1,2 -1,5% thì rễ cũng ngừng phát triển. Lá quýt là đơn mọc cách, không có eo lá, trên lá chứa nhiều túi tiết dầu thơm, dưới dạng điểm, có thể quan sát được bằng mắt thường khi soi qua ánh sáng cường độ đủ lớn. Lá thay nhau rụng trong lúc lá mới xuất hiện nên cây lúc nào cũng xanh lá. Hoa quýt được hình thành ở nách lá, có cấu tạo là hoa cụm, lưỡng tính, cánh hoa rời nhau, hoa mẫu bốn, trong hoa thường có đĩa mật, một đặc điểm 3 thích nghi với thụ phấn nhờ sâu bọ. Đài hoa gồm các mảnh dính nhau ở phía dưới làm thành đài hợp hình đấu. Nhị hoa có số lượng gấp ba đến bốn lần cánh hoa (do sự phân nhánh), chỉ nhị dính thành nhiều bó. Bộ nhụy đôi, một đầu vòi và một đầu nhụy với nhiều lá noãn dính lại thành bầu trên, nhiều ô, mỗi ô tương ứng với số lá noãn đính trụ giữa. Kích thước hoa khi nở trung bình từ 0,2 - 0,25 cm. Cây quýt miền Bắc ra lộc đầu tiên vào tháng 2 hoặc tháng 3 hằng năm, phần lớn sinh cành cho quả, đợt 2 vào tháng 5 và tháng 6 ra hoa, đợt 3 vào tháng 7 và tháng 8 đợt lộc này sinh ra cành khỏe dài, lá to màu nhạt. Trong các lứa ra hoa thì lứa hoa tháng 2 và tháng 3 là tốt nhất. Quả quýt là quả mọng với ba lớp vỏ, lớp vỏ ngoài chứa các túi dầu, lớp vỏ giữa trắng xốp (cùi), vỏ quả giữa mỏng dai, phía trong có nhiều lông đơn bào chứa nhiều nước mà người ta thường gọi là “tép”. Sự sinh trưởng của quả quýt trải qua các giai đoạn: Giai đoạn ra hoa hình thành quả (từ tháng 12 đến giữa tháng 3 năm sau), rụng quả sinh lý đợt một (cuối tháng 4), rụng quả sinh lý đợt hai (đầu tháng 6), quả chắc xanh (cuối tháng 8) và cho thu hoạch (đầu tháng 10 đến tháng 1 năm sau). Quả quýt có hình dẹt (trừ quýt chum), vỏ màu vàng và mỏng, trọng lượng của quả đạt khoảng 35 gam đến 145 gam. Vị quả ngọt sắc, chua nhẹ đặc biệt có hương thơm đậm, đặc trưng rất dễ phân biệt với bất kỳ quả trong nhóm cây ăn quả có múi khác. Quả trung bình có từ 8 đến 16 múi, số hạt trung bình của quả giao động từ 10 đến 40 hạt. Hạt quýt có 2 lá mầm, đa phôi hay đơn phôi, hạt có 2 lớp màng vỏ, màng ngoài cứng do thấm nhiều lignin, màng trong mỏng. Hạt thường chín cùng quả, nảy mầm ở nhiệt độ từ 10-30oC, nhiệt độ tối ưu là 25-30oC [14]. 1.1.3. Thành phần dinh dưỡng của quả quýt Trong quả quýt có nhiều chất dinh dưỡng, vitamin, khoáng chất cần thiết cho con người, đặc biệt chứa vitamin C giúp chống lại một số bệnh tật, tăng cường sức đề kháng. Mỗi 100 gram quả quýt có thành phần dinh dưỡng gồm: 4 87,6 gram nước; 1,104 mg carotene - một loại vitamin chống oxy hóa, 30mg vitamin C, 93mg kali, 26 mg canxi, 9mg magnesium, 0,3g chất xơ, 4,5 mg natri, 7mg Chromium, 20mg phốt pho, 0,32 mg sắt và giá trị năng lượng là 48 kcal, protein chiếm 0,6 %, lipid chiếm 0,4 %, đường khoảng 8,6 %...Trong đó, tinh dầu vỏ quýt (có tên thương phẩm là Mandarin oil), là chất lỏng màu vàng đỏ có huỳnh quang xanh nhẹ. Thành phần chính tinh dầu vỏ quýt là limonen (hơn 90 %), methylan - thranilat (1 %). Trong quýt ngoài vitamin C, chất khoáng thì còn có một lượng chất xơ. Chất xơ khi vào ống tiêu hóa sẽ trương lên do hút nước trong ruột, giúp cặn bã của quá trình tiêu hóa dễ dàng thải ra ngoài. Chất xơ khi vào ruột kết hợp với đường và acid tạo thể đông có tác dụng làm chậm quá trình hấp thụ một số chất dinh dưỡng từ đó làm lượng đường trong máu tăng vừa phải, duy trì ở mức cần thiết, nhờ đó mà cơ thể không thừa đường, không chuyển hóa thành mỡ dư thừa dự trữ ở các mô gây béo phì. Quả quýt không chứa chất béo hay cholesterol nhưng chứa nhiều vitamin C. Quả quýt được chứng minh có tác dụng chống viêm, chống khối u, ức chế đông máu và chống oxy hóa mạnh. Trên thực tế, hàm lượng vitamin C chỉ chiếm 15 - 20% tổng số các chất kháng oxy hóa trong quả, trong khi những hợp chất khác có khả năng chống oxy hóa cao gấp 6 lần vitamin C đó là hesperidin từ flavanoid có nhiều trong lớp vỏ xơ trắng, màng bao múi của quả và một lượng nhỏ trong tép [14]. Ăn cam quýt còn giúp chữa lành các vết thương nhanh hơn bởi vitamin C đảm nhiệm vai trò quan trọng trong cơ thể để sản xuất collagenprotein chịu trách nhiệm tạo ra các mô liên kết, giúp vết thương, vết cắt hay xước da mau lành, thiếu hụt collagen khiến các tế bào trong mạch máu thiếu sự gắn kết, cho phép máu rò rỉ trong các mô, cơ quan dễ dẫn đến chảy máu nướu răng và xuất hiện đốm màu đỏ đặc trưng của bệnh Scorbut [28]. 5 Quả quýt có vị chua tính ấm. Người bị cao huyết áp, bệnh mạch vành, đau dạ dày, suy dinh dưỡng, cơ thể suy nhược sau khi ốm ăn quýt rất tốt. Vỏ quýt khô gọi là trần bì, có tính ấm, có tác dụng làm khỏe dạ dày, long đờm, trị ho, trị phong, lợi tiểu, chữa ợ hơi, đau thượng vi. Y học đã chứng minh, tinh dầu thơm trong vỏ quýt có tác dụng hưng phấn tim, ức chế vận động của cơ dạ dày, phòng xuất huyết. Vỏ quýt còn dùng để điều trị cao huyết áp, nhồi máu cơ tim, có tác dụng tốt đối với các chứng bệnh đầy bụng, rối loạn tiêu hóa, kém ăn, buồn nôn, ho nhiều đờm. Hạt quýt có vị đắng tính bình, vào hai kinh can và thận, có tác dụng kiện tì, lý khí, táo thấp hóa đờm. Lá quýt vị đắng tính bình, vào đường can kinh, có tác dụng trợ gan, hành khí, tiêu thủng, tan u cục, chữa đau mạn sườn, sa nang, u cục ở vú [29]. 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid và một số gen, enzyme tham gia tổng hợp ascorbic acid ở thực vật 1.2.1. Ascorbic acid Ascorbic acid (vitamin C) có nhiều trong cây xanh, rau quả, đặc biệt trong chanh, cam, bưởi, quýt, bắp cải và trong thịt, nhất là ở cây hồng gai và một số giống ớt đỏ (có thể đạt tới 1% - 2 % khối lượng khô). Lần đầu tiên vitamin C được tách chiết từ chanh, cam vào năm 1920. Đến năm 1933, vitamin C được điều chế thành công bằng con đường tổng hợp hóa học không cần phải tách chiết từ thực vật. Ngày nay, vitamin C được biết tồn tại trong tự nhiên dưới dạng khử (L. ascorbic acid) và dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid). Tuy nhiên, dạng oxy hóa không phổ biến bằng dạng khử. Cả hai dạng đều tan trong nước, dễ bị phân huỷ khi tiếp xúc với các chất oxy hoá hoặc bazơ. Cả hai dạng khử và dạng oxy hoá đều có hoạt tính sinh học và đều tồn tại trong các dịch cơ thể. Hoạt tính của vitamin C chủ yếu là do nhóm endiol của axit ascorbic, vì nhóm này làm nhiệm vụ tham gia vận chuyển hydro [25]. 6 (- C ===== C -) | | OH OH Dạng khử (L. ascorbic acid) Dạng oxy hoá (dehydroascorbic acid) Hình1.1. Các dạng ascorbic acid trong tự nhiên [19] So với các vitamin khác, vitamin C là chất duy nhất không có ở dạng phức hợp với các nucleotide hoặc coenzym. Đặc tính cơ bản của ascorbic acid là tác dụng khử. Đặc tính này để định lượng vitamin C khi cho nó tác dụng với một chất có màu, rồi xác định bằng phương pháp so màu. Trong cơ thể người hoàn toàn không tự tổng hợp được vitamin C mà phải lấy từ các nguồn thức ăn bên ngoài vào. Vitamin C dễ tìm, có nhiều ở rau quả. Trong cơ thể, vitamin C có nồng độ khác nhau ở mô và thể dịch, nơi nào chuyển hoá mạnh nhất thì nồng độ vitamin C ở đó cao nhất. 1.2.2. Con đường sinh tổng hợp vitamin C Nghiên cứu về cơ chế tổng hợp vitamin C ở thực vật gần đây được công bố năm 1998 bởi Steven Clarke tại phòng thí nghiệm UCLA (University of California, Los Angeles, Hoa Kỳ). Theo ông, các nghiên cứu từ năm 1998 đến nay đã xác minh được phần lớn cơ chế này, mặc dù gen thực hiện bước thứ bảy(g) trong sơ đồ hình 1.2 trong tổng số 10 bước chuyển hóa glucose thành vitamin C được đề xuất vẫn còn là một ẩn số và đang tiếp tục nghiên cứu. Quá trình nghiên cứu bắt đầu từ việc tìm ra vai trò của một gen có trong loài giun C. elegans, một loài giun nhỏ được nhà nghiên cứu Tara Gomez từ phòng thí nghiệm UCLA của Clarke sử dụng làm mẫu vật để nghiên cứu quá 7 trình lão hóa. Trình tự sắp xếp của gen cho thấy nó có mối quan hệ với một họ gen bị biến đổi trong bệnh ung thư. Sự cộng tác từ nhiều phòng thí nghiệm đã khám phá ra điểm tương đồng trong gen của loài giun này với sản phẩm là gen GDP-L-galactose phosphorylase (GGP hay VTC2) của một loài cải dại có tên Arabidopis thaliana, một loại thực vật hoang dại mà bộ gen của chúng đã được biết rõ. Trước đây, các nhà khoa học đã tìm thấy mối tương quan giữa những đột biến trong gen của loài thực vật này với hàm lượng vitamin C thấp. Chính vì thế, một số nghiên cứu hiện nay tập trung vào việc xác định cách mà sản phẩm của gen này góp phần vào quá trình tổng hợp vitamin C [26]. Mạng lưới nội chất hạt, polysacarit và glycoprotein thành tế bào Ty thể Quan điểm hiện tại về Sinh học thực vạt Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp ascorbic acid, Nicholas Smirnoff (2000) [21] 8 Steven Clarke tái hiện lại bước thứ 7(g) trong hình 1.2, một ẩn số trong suốt một thời gian dài, trong quá trình tổng hợp vitamin C trong phòng thí nghiệm, một phản ứng mà được miêu tả là bước khơi mào. Sau đó, so sánh 6 bước đầu tiên của quá trình tổng hợp vitamin C với một bản đồ gồm nhiều quá trình chuyển hóa từ đường glucose đến các hợp chất tế bào mà có thể xảy ra. Tuy nhiên, một khi sản phẩm của bước (f) là một hợp chất có tên GDP-L-galactose có thể thoát ra ở nơi có mặt gen VTC2 thì các nguyên tử sẽ được hoàn thiện cấu trúc để hướng đến việc tổng hợp vitamin C, đặc biệt là tạo ra một số các loại vitamin khác. Enzyme VTC2 đã được biểu hiện và tinh chế từ vi khuẩn. Tác giả và nhóm nghiên cứu đã chứng minh được rằng gen VTC2 chịu trách nhiệm ở bước (g), bước mà các nhà nghiên cứu đã tìm kiếm rất lâu trong quá trình tổng hợp vitamin C. Bởi vì, các enzyme xúc tác cho các bước thực hiện khơi mào trong quá trình tổng hợp cho thấy các vị trí điều hòa sinh học nên các nhà nghiên cứu hi vọng khám phá này có thể đưa đến những chiến lược mới khi mong muốn của con người là tăng hàm lượng vitamin C trong cây trồng thực vật [21]. Trên cây ăn quả có múi, khi so sánh hàm lượng vitamin C giữa cam và quýt (Citrus unshiu Marc và Citrus sinensis Osb.) của Trung Quốc, Xiao Y. Y. và cs (2011) đã chỉ ra hàm lượng vitamin C ở cam nhiều hơn so với quýt. Đồng thời tìm ra 4 gen mã hóa cho 4 loại enzyme (GDP-D-mannose-3’.5’-epimerase; GDP-Lgalactose-pyrophosphatase; L-galactose dehydrogenase và L- galactono - 1,4 lactone dehydrogenase) liên quan đến con đường hình thành ascorbic acid trong quả. Các tác giả đã giải mã thành công gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’epimerase (mã số HQ224946) liên quan đến hoạt động của enzyme ascorbate oxidase và ascorbate peroxidase. Khi quả chín, sự có mặt của GDP-D-mannose3’.5’-epimerase đã góp phần nâng cao hàm lượng vitamin C của cam nhiều hơn 1,5 lần so với quýt [21]. Cũng theo Xiao – Y.Y. và cs (2011), gen mã hóa GDP-D-mannose-3’.5’epimerase tìm thấy trên Citrus unshiu (một loài cam ngọt), gen có tổng chiều dài 9 1086 bp. Gen mã hóa quy định trình tự phân tử protein GDP - D - mannose 3’.5’- epimerase với 361 amino acid. GDP - D - mannose - 3’.5’- epimerase điều phối vào quá trình hoạt hóa từ enzyme GDP - D – manose thành GDP - L galactose, bước chuyển hóa (e) trong hình 1.2 trên con đường sinh tổng hợp ascorbic acid ở thực vật được công bố trên GenBank với mã số HQ224946 [22]. Nghiên cứu của Xiao – Y. Y. và cs (2011) cũng đã chỉ ra rằng, trên gen hình thành 03 vùng để quy định bảo toàn chức năng protein gồm: (1) Vùng được đặt tên “M1P -guanylylT_B_like_N”, từ vị trí amino acid thứ nhất đến 234, quy định enzyme pyrophosphorylase GDP – mannose một trong số các enzyme tham gia trực tiếp trong chu trình hình thành ascorbic acid; (2) Vùng có tên “LbetaH - LbH”, từ vị trí amino acid thứ 256 đến 335, mã hóa enzyme acyltransfase liên quan đến sự chuyển hóa ion trong tế bào; và (3) Vùng “other” từ vị trí amino acid thứ 303 đến 330, vị trí hình thành sự liên kết giữa các chuỗi polypeptide [22], [21]. Cũng theo Junjie T. và cs (2018) ascorbic acid phổ biến đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển của cây trồng và khả năng chịu stress phi sinh học, nhưng nồng độ ascorbic acid rất khác nhau giữa các cây khác nhau. GDP-Dmannose epimerase (GDP-D), xúc tác GDP-D-mannose đến GDP- L -galactose hoặc GDP- L -gulose, là một enzyme quan trọng trong con đường sinh tổng hợp ascorbic acid thực vật. Các chức năng và mô hình biểu hiện của GDP-D đã được nghiên cứu kỹ trong các công trình trước đó, tuy nhiên, ít thông tin được biết về các mô hình tiến hóa của gen. Trong nghiên cứu này, cấu trúc gen GDPD , các mô hình protein được bảo tồn tương ứng và các mối quan hệ tiến hóa đã được phân tích một cách hệ thống. Tổng số 111trình tự gen GDP-D được lấy từ 59 bộ gen thực vật, đại diện cho hầu như tất cả các dòng chính của thực vật xanh: dicotyledons, monocotyledon, thực vật hạt trần, pteridophytes, bryophytes và chlorophytes. Kết quả cho thấy rằng homologs của GDP-D đã có mặt rộng rãi trong thực vật xanh. Cấu trúc gen GDP-D được bảo thủ ở cây cao hơn, trong khi 10 rất đa dạng trong các phân nhóm cơ bản của phylogeny bao gồm lycophytes, bryophytes và chlorophytes, cho thấy cấu trúc gen GDP-D có thể đã trải qua sự phân hóa sâu sắc ở thực vật thấp hơn và sau đó dần dần cố định như sự tiến hóa của thực vật. Các trạng thái cơ bản của GDP-D được bảo tồn mạnh mẽ trong thực vật xanh, cho thấy chức năng bảo tồn của protein. Một vài nhánh và địa điểm được lựa chọn và hầu hết các nhánh nằm trong phân nhóm chlorophyte, cho thấy sự lựa chọn đa dạng ở một số nhánh và địa điểm có thể đóng vai trò trong sự phát triển của GDP-D và đa dạng hóa sự lựa chọn giai đoạn đầu của thực vật xanh. Kết quả này cung cấp thông tin chi tiết mới về bảo tồn chức năng và sự phát triển của GDP-D[23]. Nghiên cứu của Gilbert L. và cs (2009) đã sử dụng các dòng cà chua biến đổi gen đã được RNAi-slienced cho GDP-D, qua đó xác nhận rằng GDP-D thực sự đóng một vai trò quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp ascorbate trong thực vật. Ngoài ra, các dòng cà chua chuyển gen biểu hiện các khuyết tật tăng trưởng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và sự phát triển tế bào. Một tính năng đáng chú ý hơn nữa của cây chuyển gen là sự mong manh và mất độ săn chắc của trái cây. Phân tích thành phần thành tế bào của lá và phát triển quả cho thấy hàm lượng monosaccharide thành tế bào được thay đổi trong các dòng chuyển gen, đặc biệt là những liên kết trực tiếp với hoạt động của GDP-D như: mannose và galactose. Khi được xem xét cùng nhau, những phát hiện này cho thấy mối liên hệ mật thiết giữa sinh tổng hợp polysaccharide của ascorbate và tế bào không chứa cellulose trong thực vật, giúp giải thích các yếu tố phổ biến trong các đặc điểm không liên quan như độ cứng trái cây và hàm lượng ascorbate[24]. 1.3. Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền Nghiên cứu, đánh giá đa dạng di truyền được các nhà nghiên cứu sử dụng bằng nhiều phương pháp khác nhau, mỗi phương pháp cung cấp các loại thông tin khác nhau. Việc lựa chọn phương pháp đánh giá phụ thuộc vào mục đích của người nghiên cứu. Có hai phương pháp sử dụng rộng rãi để nghiên cứu, đánh giá 11