Tài liệu Phân lập và tuyển chọn các chủng lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản của phụ nữ​

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp. CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2020 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Nguyễn Thanh Hiền PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG Lactobacillus spp. CÓ HOẠT TÍNH PROBIOTIC ĐỂ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC NĂNG NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE SINH SẢN CỦA PHỤ NỮ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 8420101.07 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà Hà Nội - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa học thạc sĩ chuyên ngành Vi sinh vật học của mình, trước hết em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Bùi Thị Việt Hà – Bộ môn Vi sinh vật học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) đã tin tưởng, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Trong thời gian học tập tại trường em cũng xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo trong bộ môn Vi sinh vật học, Phòng Sinh học Nano và ứng dụng – KLEPT, Khoa Sinh học và Khoa Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQGHN) đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Ngoài ra, em xin chân thành cảm ơn sự ủng hộ và giúp đỡ của các anh chị, các em sinh viên và bạn bè trong phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh môi trường trong suốt thời gian em thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã tạo điều kiện, quan tâm, động viên và góp ý cho em trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 12 năm 2019 Học viên Nguyễn Thanh Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN.........................................................................................................i i MỤC LỤC.............................................................................................................ii DANH MỤC BẢNG..............................................................................................v DANH MỤC HÌNH..............................................................................................vi MỞ ĐẦU...............................................................................................................1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................3 1.1. Probiotic.......................................................................................................3 1.1.1. Khái niệm probiotic.............................................................................3 1.1.2. Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp................................................3 1.2. Vai trò của vi khuẩn probiotic......................................................................4 1.2.1. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa.....................................5 1.2.2. Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến...................................6 1.2.3. Tác động trên biểu mô ruột..................................................................7 1.2.4. Kích thích hệ thống miễn dịch.............................................................8 1.2.5. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose............................................................................................................8 1.2.6. Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch.................................................................................................8 1.2.7. Khả năng chống dị ứng........................................................................8 1.2.8. Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ.......................9 1.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics...............................................11 1.3.1. Sinh ra H2O2.......................................................................................11 1.3.2. Sinh ra axit lactic...............................................................................11 1.3.3. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn..............................................12 1.4. Tổng quan chung về sức khỏe sinh sản của phụ nữ....................................13 1.5. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics thương mại dùng cho con người................................................................................................................. 14 1.5.1. Một số loại thực phẩm chức năng probiotics dành riêng cho phụ nữ được thương mại trên Thế giới....................................................................14 ii 1.5.2. Một số thực phẩm chức năng probiotics thương mại trong nước hỗ trợ sức khỏe cho con người...............................................................................15 1.6. Vi khuẩn probiotic trong sữa mẹ................................................................16 1.7. Bảo quản chế phẩm probiotics chứa Lactobacillus spp. bằng phương pháp đông khô...........................................................................................................17 CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................18 2.1. Nguyên liệu, thiết bị và dụng cụ thí nghiệm..............................................18 2.1.1. Nguyên liệu........................................................................................18 2.1.2. Phương pháp lấy mẫu sữa mẹ............................................................18 2.1.3. Thiết bị...............................................................................................18 2.1.4. Dụng cụ.............................................................................................19 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................19 2.2.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh các chủng Lactobacillus spp. trong mẫu sữa mẹ..................................................................................................20 2.2.2. Đánh giá một số tính chất & hoạt tính probiotic của các chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.................................................23 2.2.3. Nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn được tuyển chọn..........................................................................................25 2.2.4. Nghiên cứu các công thức phối trộn làm tăng mật độ sống sót sau quá trình đông khô của các chủng được tuyển chọn...........................................26 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................29 3.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và kết quả tuyển chọn chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic định hướng vào sản xuất chế phẩm probiotics giành riêng cho phụ nữ.....................................................................29 3.1.1. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri ở khu vực nông thôn và khu vực thành thị tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam.....................................29 3.1.2. Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. từ sữa mẹ................................................................................................................ 30 3.1.3. Kết quả định danh chủng vi khuẩn được tuyển chọn từ mẫu sữa mẹ. 32 iii 3.2. Kết quả đánh giá một số tính chất, hoạt tính và điều kiện nhân giống của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.......................................34 3.2.1. Kết quả đánh giá một số tính chất và hoạt tính probiotic của chủng vi khuẩn được tuyển chọn ở điều kiện in-vitro.................................................34 3.2.2. Kết quả nghiên cứu một số điều kiện nhân giống in-vitro của chủng vi khuẩn được tuyển chọn................................................................................43 3.3. Nghiên cứu các công thức phối trộn để nâng cao tỉ lệ sống của các chủng tuyển chọn sau khi đông khô............................................................................45 3.3.1. Mật độ tế bào của chủng vi khuẩn tuyển chọn trước khi đông khô....45 3.3.2. Mật độ sống của chủng vi khuẩn tuyển chọn sau khi đông khô.........46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................................50 TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................51 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Thử nghiệm các công thức phối trộn sinh khối chủng probiotic................27 với các chất bảo vệ..................................................................................................27 Bảng 2. Tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri trong sữa mẹ ở khu vực thành thị và khu vực nông thôn tại một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam..................................29 Bảng 3. Lượng axit lactic sinh ra của các chủng L. reuteri và Lactobacillus spp....30 Bảng 4. Đặc điểm của các chủng vi khuẩn lactic được tuyển chọn.........................33 Bảng 5. Số đo vòng kháng khuẩn của chủng tuyển chọn với các loại kháng sinh...40 Bảng 6. Khả năng ức chế đối với các vi khuẩn và nấm có hại................................42 Bảng 7. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. rhamnosus SMH1.................46 Bảng 8. Mật độ sống sót sau đông khô của chủng L. reuteri SMH2.......................47 v DANH MỤC HÌNH Hình 1. Hình thái các sinh vật Lactobacillus và tế bào biểu mô âm đạo...................4 (ảnh nhuộm Gram) [64].............................................................................................4 Hình 2. Tương tác của các vi sinh vật trong đường ruột [35]....................................5 Hình 3. Các chủng vi khuẩn probiotic và các cơ chế chống lại các bệnh ung thư [29]............................................................................................................................ 6 Hình 4. Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102].........................................................7 Hình 5. Thiết kế thí nghiệm....................................................................................19 Hình 6. Máy đông khô vi khuẩn.............................................................................28 Hình 7. Đường cong sinh trưởng và lượng axit lactic sinh ra theo thời gian của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng.........................34 Hình 8. Khả năng chịu muối mật của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..........................................................36 Hình 9. Khả năng chịu axit của chủng chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..........................................................37 Hình 10. Khả năng sinh H2O2 của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087..............................................................38 Hình 11. Khả năng nhạy cảm với kháng sinh của chủng ĐC L. reuteri VTCC 910087 (Hình 6A), chủng L. reuteri SMH2 (Hình 6B) và L. rhamnosus SMH1 (Hình 6C)................................................................................................................40 Hình 12. Khả năng tạo màng biofilm của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng ĐC L. reuteri VTCC 910087........................................................41 Hình 13. Khả năng phát triển của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 910087 trong điều kiện nuôi lắc và nuôi tĩnh....43 Hình 14. Khả năng phát triển trên các mức nhiệt độ khác nhau của chủng L. rhamnosus SMH1, L. reuteri SMH2 và chủng đối chứng L. reuteri VTCC 91008744 vi MỞ ĐẦU Viêm nhiễm phụ khoa hay viêm phụ khoa là thuật ngữ dùng để chỉ các bệnh ở nữ giới gây ra tình trạng viêm nhiễm tại cơ quan sinh dục như: âm đạo, cổ tử cung, tử cung, buồng trứng, vòi trứng, phần phụ, và các vùng xung quanh. Tỉ lệ mắc bệnh viêm nhiễm phụ khoa ở nữ giới chưa quan hệ tình dục lần nào sẽ thấp hơn vì có lớp màng trinh bảo vệ giúp ngăn chặn vi khuẩn xâm nhập vào bên trong tử cung. Đối với nữ giới đã quan hệ tình dục, đặc biệt đang trong thời kì mang thai, sinh nở thì nguy cơ mắc các bệnh viêm phụ khoa sẽ rất cao. Viêm nhiễm phụ khoa được coi là bệnh nhiễm trùng phổ biến đặc biệt ở các nước nhiệt đới trong đó có Việt Nam. Nhiều thống kê từ 2004 đến nay cho thấy, tỉ lệ viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ trong độ tuổi sinh đẻ vẫn ở mức cao, chiếm đến 90% [1]. Nếu không điều trị hoặc điều trị không đúng cách, không đầy đủ có thể gây nên các biến chứng như vô sinh, chửa ngoài tử cung, sảy thai, ung thư cổ tử cung và các biến chứng cho thai nhi như thai chết lưu, dị tật bẩm sinh, trì độn trí tuệ... đây được coi là một vấn đề rất lớn đã và đang rất được quan tâm vì những thiệt hại do bệnh gây ra là rất lớn. Mặc dù nhiễm trùng đường sinh dục có thể có các triệu chứng khác nhau, nhưng không phải lúc nào phụ nữ cũng dễ dàng nhận ra. Trên thực tế việc chẩn đoán thậm chí còn khó khăn đối với một bác sĩ có kinh nghiệm. Các trường hợp nhiễm trùng nặng được bác sĩ chỉ định điều trị bằng kháng sinh phổ rộng với liều khá cao nên gây ra các tác dụng phụ như chán ăn, mệt mỏi, ảnh hưởng tới sinh hoạt tình dục… và nếu được điều trị tái lặp sẽ dẫn tới tình trạng kháng thuốc kháng sinh, một vấn đề nổi cộm và thách thức hiện nay. Để phòng ngừa và hỗ trợ điều trị các bệnh nhiễm trùng đường sinh sản, nhiều nghiên cứu đã cho thấy việc sử dụng các chế phẩm probiotics chứa các chủng lợi khuẩn Lactobacillus spp. là hiệu quả. Các sản phẩm probiotics dành cho phụ nữ hiện nay bắt đầu được sử dụng khá phổ biến dưới dạng sản phẩm chức năng hỗ trợ điều trị cho các bệnh nhân nhiễm trùng đường âm đạo và tiết niệu. Các sản phẩm thương mại này được bán nhiều nhất trên thị trường Việt Nam phần lớn là hàng nhập khẩu từ Mỹ, Anh, Nhật Bản với giá thành rất cao và hiện tại Việt Nam chưa có một dòng sản phẩm nào nghiên cứu và phát triển dành riêng cho phụ nữ. Sản phẩm nhập ngoại chưa hoàn toàn phù hợp với điều kiện thu nhập thấp của người dân Việt Nam, đặc biệt là phụ nữ ở vùng nông thôn và miền núi. Trong khi đó, hơn 80% phụ nữ Việt Nam bị mắc bệnh phụ khoa. Chính vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất một số chế phẩm probiotics từ Lactobacillus spp. phân lập ở sữa mẹ của các bà mẹ đang cho con bú tại Việt Nam có các đặc tính ưu việt về việc ức chế các vi sinh vật gây 1 viêm nhiễm phụ khoa là việc làm hết sức cần thiết, có ý nghĩa cộng đồng và ý nghĩa thực tiễn cao. Dựa trên nhu cầu và tính cấp thiết của vấn đề nêu trên nên chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phân lập và tuyển chọn các chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic để sản xuất thực phẩm chức năng nhằm nâng cao sức khỏe sinh sản cho phụ nữ”. Hiện nay, vẫn còn rất ít tài liệu công bố liên quan đến sự xuất hiện của Lactobacilli và Lactobacillus reuteri trong sữa mẹ ở Việt Nam. Chính vì thế, nghiên cứu này được thực hiện để điều tra sự xuất hiện của nhóm vi khuẩn thuộc chi Lactobacillus spp. và loài L. reuteri trong sữa mẹ, xác định mối liên hệ có thể có giữa sự có mặt của L. reuteri trong sữa mẹ của các bà mẹ ở vùng nông thôn và thành thị tại miền Bắc Việt Nam và nghiên cứu các đặc tính probiotic của chủng Lactobacillus spp. được tuyển chọn để hướng tới việc sản xuất chế phẩm probiotics dành cho phụ nữ. Mục tiêu của đề tài: - Xác định được tỉ lệ Lactobacillus spp. và L. reuteri có trong sữa mẹ của các bà mẹ sống tại khu vực nông thôn và thành thị ở một số tỉnh thành miền Bắc Việt Nam và tuyển chọn được 2 chủng Lactobacillus spp. có hoạt tính probiotic tốt nhất. - Xác định được công thức phối trộn để nâng cao mật độ sống sót sau quá trình đông khô của các chủng được tuyển chọn. 2 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Probiotic 1.1.1. Khái niệm probiotic Theo ngôn ngữ Hy Lạp, probiotic có nghĩa là “dành cho cuộc sống” và có một số nghĩa khác nhau theo thời gian. Khái niệm này được sử dụng lần đầu tiên bởi Lilley và Stillwell vào năm 1965 để mô tả các chất được tiết ra bởi một loại vi sinh vật kích thích sự phát triển của loại vi sinh vật khác. Do vậy, khái niệm này có nghĩa ngược lại hoàn toàn với “antibiotic – kháng sinh”. Tuy nhiên, việc sử dụng khái niệm probiotic này đã không tồn tại và sau đó được Sperti sử dụng để mô tả các chất chiết xuất từ mô kích thích sự phát triển của vi sinh vật năm 1971. Mãi đến năm 1974, Parker mới sử dụng probiotic để chỉ những vi sinh vật như vi khuẩn hay nấm men mà có thể thêm vào thực phẩm với mục đích điều chỉnh quần thể sinh vật đường ruột của sinh vật chủ. Định nghĩa này liên quan đến việc sử dụng probiotic vào hệ vi sinh đường ruột nhưng bao gồm “các chất phụ khác” đã cho probiotic nghĩa rộng bao gồm cả các kháng sinh. Trong việc nỗ lực cải thiện định nghĩa, năm 1989 Fuller đã định nghĩa lại probiotic là một chất (có bổ sung vi sinh vật sống) ảnh hưởng có lợi cho sinh vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột của sinh vật chủ. Định nghĩa sửa đổi này nhấn mạnh sự cần thiết của một probiotic [38]. Hiện nay, chế phẩm probiotics được hiểu là những chế phẩm có chứa các vi sinh vật sống, khi đưa vào cơ thể một lượng đầy đủ thì có lợi cho sức khỏe, đặc biệt là hệ tiêu hóa [80], [48], [82]. Trên thực tế, cơ thể con người bao gồm cả vi khuẩn có lợi và có hại. Vi khuẩn có lợi thường không gây bệnh và có thể giúp kìm hãm các vi khuẩn có hại, giúp cải thiện tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng cũng như tăng cường khả năng miễn dịch. Probiotics được coi là an toàn để tiêu thụ nhưng cũng có thể gây ra tương tác giữa vi khuẩn & sinh vật chủ và tác dụng phụ không mong muốn trong những trường hợp hiếm gặp [31], [90], [32]. Khi vi khuẩn có hại trong cơ thể lấn át được vi khuẩn có lợi, đó là lúc cần sử dụng các chế phẩm sinh học probiotics để lấy lại sự cân bằng của khu hệ vi sinh vật trong cơ thể. 1.1.2. Probiotic phổ biến – Lactobacillus spp. Lactobacillus spp. thường được xem là một trong các loại probiotics phổ biến. Lactobacilli là một chi của vi khuẩn Gram dương, kị khí hoặc vi hiếu khí, hình que, không hình thành bào tử [57]. Chúng là một phần chính của nhóm vi khuẩn lactic (tức là, chúng chuyển đổi đường thành axit lactic). Môi trường sống chủ yếu 3 có chứa carbohydrate (lớp chất nhầy của người và động vật, chất thải và thực phẩm lên men hay hư hỏng). Ở người, chúng tạo thành một phần quan trọng của hệ vi sinh vật tại một số vị trí cơ thể, chẳng hạn như hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống sinh dục. Ở phụ nữ châu Âu, các loài thuộc chủng Lactobacillus spp. thường là một phần chính của hệ vi sinh vật âm đạo [53], [36]. Hình 1. Hình thái các sinh vật Lactobacillus và tế bào biểu mô âm đạo (ảnh nhuộm Gram) [64] L. reuteri là một loài vi khuẩn Gram dương, chúng được tìm thấy ở ruột của động vật có vú, chim, sữa mẹ và dịch âm đạo ở người. Chúng là một loài probiotic đã được ứng dụng từ rất lâu và có khả năng sinh ra reuterin - một chất có khả năng ức chế sự phát triển của một số vi khuẩn Gram âm và Gram dương có hại cùng với nấm men, nấm và động vật nguyên sinh [126]. L. reuteri có thể giúp cơ thể chống lại nhiều bệnh nhiễm trùng thông thường, thúc đẩy sức khoẻ tổng thể ở cả trẻ em và người lớn. Với những đặc tính hữu ích vốn có của loài này, việc tuyển chọn L. reuteri trong nghiên cứu này để sản xuất thực phẩm chức năng probiotics nhất định sẽ có tiềm năng trong việc bảo vệ sức khỏe con người nói chung và cho sức khỏe sinh sản của phụ nữ nói riêng. 1.2. Vai trò của vi khuẩn probiotic Việc duy trì ổn định hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trong bảo vệ sức khỏe và phòng ngừa bệnh tật. Vai trò chính của vi khuẩn probiotic là giúp cho hệ VSV đường ruột khỏe mạnh, ngăn cản sự thâm nhập và phát triển VSV gây bệnh, tăng cường đề kháng tự nhiên với các bệnh truyền nhiễm của đường tiêu hóa. Vai trò này được thể hiện ở một số biểu hiện cụ thể như sau. 4 1.2.1. Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa Sự sống sót của vi khuẩn probiotic ở những phần khác nhau của đường tiêu hóa thường khác nhau giữa các loài. Khi tập trung ở khoang ruột, chúng tạo nên sự cân bằng tạm thời của hệ sinh thái đường ruột, sự thay đổi này được nhận thấy một vài ngày sau khi bắt đầu tiêu thụ chế phẩm probiotics, phụ thuộc vào công dụng và liều lượng của chủng vi khuẩn. Kết quả chỉ ra rằng với sự tiêu thụ thường xuyên thì vi khuẩn probiotic định cư một cách tạm thời trong ruột, một khi chấm dứt sự tiêu thụ này thì số lượng vi sinh vật probiotic sẽ giảm xuống. Điều này đúng cho tất cả các loại vi khuẩn probiotic [115]. Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng gồm có các axit hữu cơ gồm các axit béo chuỗi ngắn dễ bay hơi, chủ yếu là acetate, propionate và butyrate, nhất là axit lactic, hydrogen peroxide (H2O2) và các chất diệt khuẩn có thể ức chế cả khuẩn Gram (+) và Gram (-). Cụ thể những hợp chất này làm giảm pH trong khoang ruột gây ảnh hưởng đến quá trình điều hòa hoạt động trao đổi chất của vi khuẩn đường ruột thông qua việc cản trở hoạt động tiết ra enzyme và tạo ra các độc tố của vi khuẩn gây hại đường ruột [107], [93], [70], [119]. Hình 2. Tương tác của các vi sinh vật trong đường ruột [35] Chú thích: Các mầm bệnh và độc tố của vi sinh vật gây hại kết dính vào màng nhầy, cụ thể là thụ thể của đường ruột và phá hủy nó. Khi cơ thể được bổ sung vi khuẩn probiotic, các phản ứng miễn dịch được kích thích và hoạt động của các kháng thể ở tế bào chủ được tăng lên. Vi khuẩn probiotic cạnh tranh các chất dinh dưỡng quan trọng với mầm bệnh. Loại trừ bằng cách cạnh tranh/ ngụy trang: vi khuẩn probiotic khóa các thụ thể bên trong đường ruột làm cho mầm bệnh không bám vào được, do đó loại trừ mầm bệnh. Sự tập hợp các vi khuẩn probiotic gây cản trở sự gắn kết và tăng sinh của mầm bệnh. Các vi khuẩn probiotic ngăn chặn sự bám dính vào đường ruột và cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của các VSV gây bệnh phổ biến như Salmonella và Shigella. Cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, tăng cường vi khuẩn có 5 lợi và giảm số lượng những vi khuẩn gây hại mang mầm bệnh. Cuối cùng điều chỉnh thành phần phân bố của vi khuẩn đường ruột [115]. 1.2.2. Khả năng chống ung thư và các yếu tố đột biến Nhiều nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra còn có tác dụng khử chất độc gây ung thư có trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu. Cơ chế này đã được nghiên cứu và kết luận như sau [29]. + Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư. + Sản xuất các hợp chất kháng ung thư: sinh ra những axit yếu có lợi cho đường ruột như axit butyric có vai trò giảm tạo ra những chất gây ung thư trong đường ruột và kích thích các tế bào niêm mạc ruột bị tổn thương màu lành và phục hồi chức năng. + Điều hòa những enzyme như nitroreductase, ß-glucuronidase (các enzyme này có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung thư thành chất gây ung thư trong trực tràng). + Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in-vitro và in-vivo, việc mở rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn là vấn đề đang tranh cãi. Hình 3. Các chủng vi khuẩn probiotic và các cơ chế chống lại các bệnh ung thư [29] 6 1.2.3. Tác động trên biểu mô ruột Vi khuẩn probiotic được xem như là phương tiện phân phát các phân tử kháng viêm cho đường ruột. Cụ thể là đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào chủ để làm giảm đáp ứng viêm, tạo đáp ứng miễn dịch để làm giảm dị ứng và cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn ngừa tiêu chảy và táo bón. Vi khuẩn probiotic giúp đẩy mạnh sự liên kết chặt giữa những tế bào biểu mô; giảm việc kích thích bài tiết & những hậu quả khi bị viêm gây ra do lây nhiễm vi khuẩn và đẩy mạnh việc tạo ra các phân tử phòng vệ như chất nhầy [102] . Hình 4. Cơ chế hoạt động của probiotic thúc đẩy cân bằng nội môi và liên quan đến khả năng ứng dụng trong bệnh viêm ruột [102] Vi khuẩn probiotic hỗ trợ điều hòa cân bằng nội môi của tế bào chủ. Vi khuẩn probiotic gây ra một số phản ứng có lợi cho tế bào chủ, bao gồm: ngăn chặn tác động của vi khuẩn gây bệnh bằng cách sản xuất các chất kháng khuẩn (Antibacterial substance) và cạnh tranh với mầm bệnh để liên kết với các tế bào biểu mô; xác định sự cân bằng giữa khả năng miễn dịch cần thiết và khả năng miễn dịch phòng vệ quá mức bằng cách tăng khả năng miễn dịch bẩm sinh (innate immunity), điều chỉnh tăng sản xuất cytokine chống viêm và ức chế sản xuất cytokine tiền 7 viêm; thúc đẩy cân bằng nội môi của tế bào biểu mô ruột bằng cách tăng tỉ lệ sống, chức năng rào cản và phản ứng bảo vệ bên trong tế bào chất (survival, barrier function and cytoprotective responses). DC, dendritic cell; IL, interleukin; M, Mcell; Hsp, heat shock protein [102]. 1.2.4. Kích thích hệ thống miễn dịch Thực phẩm chức năng probiotics có thể góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, giúp tăng cường hàm lượng globulin. Sự hấp thụ thực phẩm chức năng probiotics đối với người ốm và trẻ nhỏ cải thiện rõ rệt sức đề kháng của cơ thể, giúp tăng cường hiệu quả của một số vắc xin như vắc xin thương hàn [113]. Những cải thiện hệ miễn dịch bởi vi khuẩn probiotic có thể được trình bày theo 3 cách sau: tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của sinh vật hay hạt carbon; tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là IgM, IgA và interferon (nhân tố kháng vi rút không đặc hiệu); tăng cường khả năng định vị kháng thể trên bề mặt ruột thường là IgA [113]. 1.2.5. Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp được lactose Sự không dung nạp đường lactose (có nhiều trong sữa) xảy ra khá phổ biến ở nhiều người, gây đầy hơi, khó tiêu khi hấp thu thực phẩm có chứa đường lactose. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy một số chủng vi khuẩn lên men axit lactic trong sản phẩm sữa lên men có thể cải thiện các triệu chứng kháng đường lactose của cơ thể bằng cách cung cấp lactase cho dạ dày và đường ruột. Sử dụng các thực phẩm có chứa các chủng vi khuẩn probiotic này giúp cải thiện rõ rệt khả năng tiêu hóa đường lactose [88]. 1.2.6. Làm giảm cholesterol trong huyết thanh và hạn chế các bệnh liên quan đến tim mạch Vi khuẩn probiotic được biết có vai trò sản xuất ra axit hữu cơ, làm giảm axit béo, có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh, làm giảm huyết áp cao [73, 109]. Các nghiên cứu chỉ ra rằng các vi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacterium không chỉ sinh ra các axit hữu cơ mà còn trực tiếp sử dụng lipid và các thành phần cholesterol trong máu [83]. 1.2.7. Khả năng chống dị ứng Thực phẩm chức năng probiotics góp phần chống lại một số dị ứng của cơ thể và cung cấp nhiều chất quan trọng cho cơ thể (ví dụ như axit folic, niacin, riboflavin, vitamin B6 và B12) [76], [75], [114]. 8 1.2.8. Phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa ở phụ nữ Việc sử dụng thực phẩm chức năng probiotics chứa các lợi khuẩn đã được phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Ngoài các vai trò kể trên, thực phẩm chức năng probiotics giành riêng cho phụ nữ còn góp phần phòng ngừa và điều trị viêm nhiễm phụ khoa. Các nghiên cứu in-vitro chỉ ra rằng một số chủng Lactobacillus spp. có thể ức chế sự gắn kết của Gardnerella vaginalis với biểu mô âm đạo và tạo ra H2O2, axit lactic và các chất kháng khuẩn ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây nhiễm trùng âm đạo. Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy đặt viên nén chứa L. acidophilus trong âm đạo trong 6 - 12 ngày hay uống L. acidophilus hoặc L. rhamnosus GR-1 và L. fermentum RC-14 trong 2 tháng có thể giúp chữa trị và làm giảm sự tái phát nhiễm khuẩn âm đạo đồng thời giúp gia tăng lượng Lactobacilli trong âm đạo và phục hồi một hệ vi sinh âm đạo khỏe mạnh một cách thường xuyên hơn là dùng thuốc tạm thời (axit axetic) hoặc không điều trị [34]. Mastromarino và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định hiệu quả của viên nén đặt âm đạo chứa Lactobacillus trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo và trong việc khôi phục hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh. 39 phụ nữ đã được ghi tên vào một thử nghiệm lâm sàng đánh giá hiệu quả tác động của viên nén Lactobacillus lên vi sinh vật âm đạo và so sánh với nhóm sử dụng giả dược. Sản phẩm được chỉ định dùng liên tục trong 7 ngày. Các chỉ số lâm sàng, điểm số Gram âm đạo và các triệu chứng đã được so sánh với những người ở lần khám đầu tiên, những người đã hoàn thành điều trị và 2 tuần sau đó. Sau khi hoàn thành điều trị, tất cả bệnh nhân trong nhóm sử dụng Lactobacillus (n = 18) không còn nhiễm khuẩn âm đạo, cho thấy hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (83%) hoặc ở ngưỡng trung gian (17%). Ngược lại, chỉ có 2 bệnh nhân không còn nhiễm khuẩn âm đạo, hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh (12%) trong số 16 phụ nữ được điều trị bằng giả dược (p < 0,001). Hai tuần sau khi hoàn thành điều trị, việc điều trị đã thành công với 61% số bệnh nhân được điều trị bằng Lactobacillus so với 19% số bệnh nhân điều trị thành công được điều trị bằng giả dược (p < 0,05). Trong nhóm điều trị, tổng số bệnh nhân có triệu chứng và cường độ của các triệu chứng nhiễm khuẩn âm đạo đặc biệt là viêm âm đạo đã giảm đáng kể ở cả hai lần theo dõi tiếp theo. Các dữ liệu cho thấy bổ sung các chủng Lactobacillus ngoại sinh được lựa chọn là có thể khôi phục lại hệ vi sinh vật âm đạo khỏe mạnh và được sử dụng trong điều trị viêm nhiễm âm đạo phụ khoa [60]. Chế phẩm probiotics chứa các loài L. rhamnosus và L. reuteri còn được bác sĩ chỉ định hỗ trợ điều trị nhiễm khuẩn âm đạo khi kê đơn dưới dạng thực phẩm chức năng sử dụng qua đường uống cùng với kháng sinh metronidazole 9 (thuốc thuộc về nhóm kháng sinh nitroimidazole, hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn và động vật nguyên sinh. Kháng sinh này rất có hiệu quả khi xử lý với nhiễm khuẩn và protozoa ở đường âm đạo). Kết quả cho thấy số lượng Lactobacillus được phát hiện nhiều hơn đáng kể ở các bệnh nhân được điều trị bằng metronidazole kết hợp với probiotic so với các bệnh nhân chỉ được điều trị với metronidazole trong 5 ngày [105]. Theo các nghiên cứu về vi khuẩn âm đạo ở phụ nữ thì các loài Lactobacillus chiếm đa số trong các vi sinh vật có lợi ở âm đạo những phụ nữ khỏe mạnh. Các loài G. vaginalis, Prevotella, Atopobium, Sneathia và Megasphaera thường được gặp ở những phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo và được điều trị bằng tinidazole (Tinidazole là một thuốc kháng sinh nhóm nitroimidazole. Thuốc hoạt động bằng cách ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn và sinh vật đơn bào). Khi kết hợp điều trị kháng sinh này kèm với chế phẩm probiotics có chứa 2 chủng L. reuteri RC-14 và L. rhamnosus GR-1 sử dụng qua đường uống, số lượng L. iners hoặc L. crispatus gia tăng mạnh ở âm đạo phụ nữ cùng với khả năng phục hồi cân bằng nội mô dẫn đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics và kháng sinh trong điều trị nhiễm khuẩn âm đạo đem lại hiệu quả cao. Điều đó chứng tỏ khả năng khôi phục cân bằng nội môi có liên quan đến việc sử dụng kết hợp chế phẩm probiotics với điều trị kháng sinh trong việc nhiễm khuẩn âm đạo [55]. Trong một nghiên cứu khác về “Tác động của chế phẩm Probiotic SYNBIO đặt âm đạo trong việc thúc đẩy sức khỏe âm đạo của phụ nữ” đã cho thấy việc sử dụng chế phẩm probiotics Lactobacillus dạng viên nang đặt âm đạo làm gia tăng các vi khuẩn có lợi, giúp chúng chiếm và tồn tại trong âm đạo. Việc sử dụng chế phẩm sinh học probiotics dạng thuốc đặt âm đạo đã được thực hiện trên 35 phụ nữ khỏe mạnh trong nghiên cứu của Maria cùng cộng sự. Mỗi phụ nữ được kiểm tra ba lần trong quá trình nghiên cứu. Người tình nguyện được hướng dẫn nhận và sử dụng thuốc đặt SYNBIO (L. rhamnosus IMC 501 và L. paracasei IMC 502) mỗi ngày và duy trì trong 7 ngày. Các miếng gạc âm đạo được thu thập 3 lần, mỗi lần cách nhau 7 ngày sau khi sử dụng SYNBIO để xác định số lượng lactobacilli có mặt, giá trị pH và chẩn đoán viêm nhiễm phụ khoa dựa vào thang điểm Nugent phụ thuộc hình thái vi khuẩn trên tiêu bản nhuộm Gram (quan sát trên 10 hiển vi trường) và chẩn đoán xác định viêm nhiễm phụ khoa khi đạt từ 7 đến 10 điểm [69]. Khi đánh giá khả năng dung nạp trong điều trị được dựa trên phân tích các loại và sự xuất hiện của các tác dụng bất lợi, kết quả cho thấy thuốc đặt âm đạo probiotic được dung nạp tốt và không có tác dụng phụ nào đã được báo cáo. Điểm số Nugent ở ngưỡng trung gian đã được ghi chép lại ở 40% phụ nữ tại lần khám thứ nhất và các điểm ở 10 ngưỡng trung gian này trở lại bình thường vào ngày thứ 7 (kết thúc điều trị) ở 20% phụ nữ tham gia. SYNBIO đã góp phần làm tăng đáng kể lượng Lactobacilli tại lần khám thứ 2. Các kỹ thuật sinh học phân tử đã cho thấy sự hiện diện của hai chủng có nguồn gốc từ SYNBIO ở 100% phụ nữ khám lần 2 và 34% khi đến thăm khám lần 3. Không có thay đổi đáng kể nào được ghi nhận về độ pH giữa các lần thăm khám. Sản phẩm SYNBIO an toàn cho việc sử dụng hàng ngày ở phụ nữ khỏe mạnh và có thể sẽ rất hữu ích để khôi phục và duy trì một hệ vi khuẩn âm đạo khỏe mạnh [103]. 1.3. Cơ chế kháng khuẩn âm đạo và cân bằng hệ vi sinh đường sinh dục ở phụ nữ khi sử dụng thực phẩm chức năng probiotics 1.3.1. Sinh ra H2O2 H2O2 là một chất oxy hóa mạnh. Các nghiên cứu đã cho thấy chất này cũng giống như O2- hay OH- có khả năng gây tổn thương cao khi tham gia vào phản ứng Fenton. Chúng gây tổn thương cấu trúc và chức năng các đại phân tử trong tế bào như protein, ADN, lipid…dẫn đến gây chết mạnh các vi khuẩn [86]. Một số chủng Lactobacillus được tìm thấy có tác dụng ức chế sự phát triển các VSV gây bệnh ở âm đạo trong ống nghiệm bằng cách sản xuất tạo ra H 2O2. Mastromarino và nhóm cộng sự đã nghiên cứu L. salivarius FV2 và L. gasseri 335 được phân lập từ âm đạo của người và phát hiện thấy chúng có thể sản xuất ra một lượng lớn H 2O2 cũng như ức chế sự tăng trưởng của G. vaginalis [60]. McLean và Rosenstein đã chứng minh L. acidophilus 48101 được phân lập từ âm đạo của phụ nữ khỏe mạnh đã sản xuất lượng lớn H2O2 và ức chế sự tăng trưởng của Bacteroides spp., Prevotella bivia và G. vaginalis được lập từ gạc âm đạo của phụ nữ nhiễm khuẩn âm đạo [62]. Mặc dù đã có khá nhiều nghiên cứu chứng minh Lactobacilli sản xuất H2O2 bảo vệ cho đường sinh dục nữ khỏi nhiễm trùng và quan điểm cho rằng H2O2 là yếu tố kháng khuẩn chính được sản xuất bởi Lactobacillus vẫn là phổ biến nhất nhưng một nghiên cứu in-vitro khác lại chứng minh rằng H 2O2 được tạo ra do Lactobacillus không phải là nguyên nhân chính gây ức chế các tác nhân gây bệnh. Các Lactobacillus này sản xuất H2O2 có thể làm tăng khả năng hoạt động của các chuỗi peptide kháng khuẩn của vật chủ (muramidase và lactoferrin) cũng như hoạt tính kháng khuẩn của các tế bào biểu mô [11]. 1.3.2. Sinh ra axit lactic Không giống với H2O2, tác dụng ức chế vi khuẩn gây bệnh đường âm đạo của axit lactic được chứng minh rõ ràng. Axit lactic ở nồng độ sinh lý (ví dụ: 110 mM) thậm chí ở pH 4,5 làm giảm 106 lần khả năng tồn tại của 17 loại vi khuẩn 11 khác nhau gây viêm nhiễm âm trong khi đó lại không ảnh hưởng đến khả năng tồn tại của bốn loài Lactobacillus spp. âm đạo trong nghiên cứu in-vitro. Đáng chú ý là hoạt tính kháng khuẩn của axit lactic có cường độ lớn hơn các chất được axit hóa đến pH 4,5 như axit chlohydric hoặc axit axetic [70]. Ngoài ra, ở gần điều kiện exvivo, axit lactic sử dụng đơn lẻ không kết hợp với bacteriocin vẫn có hiệu quả kháng vi khuẩn gây viêm nhiễm ở đường sinh dục nữ [30]. Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng axit lactic có tác dụng chính trong chống lại các bệnh do vi khuẩn gây ra bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục (Sexually Transmitted Infections- STIs) chứ không phải là H2O2. Axit lactic sinh ra bởi L. crispatus và L. gasseri đã làm bất hoạt Chlamydia trachomatis [67] và Neisseria gonorrhoeae [45]. Axit lactic sản xuất bởi L. crispatus đã được chứng minh có tác dụng ức chế N. gonorrhoeae và G. vaginalis trong mô hình niêm mạc âm đạo ở lợn [20]. Tóm lại, những nghiên cứu in-vitro và ex-vivo đều cho thấy rằng axit lactic được sản sinh ở các chủng probiotic thuộc chi Lactobaciilus có khả năng duy trì hệ vi sinh vật âm đạo và bảo vệ vi khuẩn chống lại bệnh nhiễm trùng qua đường tình dục. 1.3.3. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn Bacteriocin có bản chất là protein hoặc các chuỗi peptide được sản xuất bởi vi khuẩn để ức chế sự phát triển của các chủng vi khuẩn tương đồng hoặc các chủng vi khuẩn có liên quan chặt chẽ với chủng đó. Chúng tương tự như các yếu tố diệt nấm men và paramecium, chúng đa dạng về cấu trúc, chức năng và về sinh thái học. Các ứng dụng của bacteriocin đang được thử nghiệm để đánh giá ứng dụng của chúng như các kháng sinh phổ hẹp [28]. Bacteriocin lần đầu tiên được André Gratia phát hiện năm 1925, cho đến nay có hàng ngàn loại bacteriocin đã được nghiên cứu. Ông đã tham gia vào quá trình tìm kiếm các cách để tiêu diệt vi khuẩn, điều này cũng dẫn đến sự phát triển của kháng sinh và phát hiện ra bacteriophage, tất cả chỉ trong một vài năm. Ông ấy đã gọi chất kháng khuẩn phát hiện đầu tiên của mình là colicine vì chất này có khả năng giết chết E. coli [44]. Việc sản xuất các chất kháng khuẩn bởi một số Lactobacillus cũng đã được tìm thấy với vai trò ức chế tăng trưởng của G. vaginalis, ít nhất là trong ống nghiệm. Aroutcheva cùng các cộng sự đã kiểm tra 22 chủng Lactobacillus và nhận thấy rằng 80% số chủng sản xuất một loại độc tố ức chế sự phát triển của G. vaginalis [15]. Trong một nghiên cứu khác, Simoes và cộng sự đã phát hiện thấy sự tăng trưởng của 28 trường hợp (78%) trong số 36 trường hợp lâm sàng nhiễm G. vaginalis bị ức chế bởi vi khuẩn L. acidophilus do các chủng này nhạy cảm với bacteriocin sinh ra bởi vi khuẩn này [89]. 12