Tài liệu Phát hiện vi khuẩn salmonella bằng phương pháp realtime pcr

i LỜI CẢM ƠN Với tất cả chân thành và lòng biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Phạm Thu Thủy và TS. Nguyễn Văn Duy đã tận tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường cùng quý thầy cô giáo trong Viện đã tận tình dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt khóa học, giúp tôi có một nền tảng vững chắc để bước vào đời. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới cha mẹ, gia đình, bạn bè và những người thương yêu tôi, luôn bên cạnh an ủi và động viên tôi giúp tôi có thêm sức mạnh để vượt qua những khó khăn và có niềm tin vào cuộc sống. Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới chị Minh Nhật, bạn Phạm Thị Huế lớp 49 SH và 2 em Lê Thị Vân và Nguyễn Thị Ngọc Bích lớp 50 SH đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người! Nha Trang, tháng 07 năm 2011 Sinh viên thực hiện Võ Thị Hà GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà ii MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC BẢNG ............................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... vi LỜI NÓI ĐẦU ........................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella ................................................................ 3 1.1.1. Phân loại Salmonella ..................................................................................... 3 1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella........................................................... 4 1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella ....................................................................... 7 1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella ................................................ 9 1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella................................................................... 11 1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra.................................... 14 1.2.1.Trên thế giới ................................................................................................. 14 1.2.2. Ở Việt Nam ................................................................................................. 15 1.3. Các phương pháp kiểm tra sự có mặt của Salmonella ................................ 16 1.3.1. Phương pháp PCR ....................................................................................... 17 1.3.2. Phương pháp Realtime PCR ........................................................................ 19 1.4. Tính cấp thiết và mục tiêu của đề tài ........................................................... 22 1.4.1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................... 22 1.4.2. Mục tiêu của đề tài....................................................................................... 22 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 24 2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 24 2.1.1. Mẫu ............................................................................................................. 24 2.1.2. Thiết bị chuyên dụng ................................................................................... 24 2.1.3. Hóa chất, môi trường và thuốc thử ............................................................... 24 2.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 30 2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 31 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà iii 2.3.1. Phân lập và nuôi cấy Salmonella .................................................................. 31 2.3.2. Nhuộm Gram ............................................................................................... 34 2.3.3. Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System .............................................................................................................................. 35 2.3.4. Xác định nồng độ DNA bằng điện di gel agarose và đo OD ......................... 36 2.3.5. Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella ............................................ 38 2.3.6. Xây dựng quy trình Realtime PCR phát hiện Salmonella ............................. 40 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 43 3.1. Phân lập và nuôi cấy vi khuẩn Salmonella .................................................. 43 3.2. Xác định hình thái tế bào vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram ...... 46 3.3. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn .............................................. 47 3.3.1. Khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella ....................... 47 3.3.2. Khả năng sử dụng lysin của các chủng Salmonella ...................................... 50 3.4. Tách chiết DNA tổng số ................................................................................ 51 3.5. Phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA....................................................... 52 3.5.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA ..................... 52 3.5.2. Kết quả chạy PCR khảo sát nhiệt độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 ................ 53 3.5.3. Kết quả khảo sát nồng độ mồi invA1,2 ......................................................... 55 3.5.4. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR ........................................................... 56 3.6. Phản ứng Realtime PCR khuếch đại đoạn gen invA ................................... 57 3.6.1. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella .............57 36.2. Khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR ............................................. 58 3.6.3. Kết quả phân tích nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm khuếch đại................... 60 3.6.4. Kết quả xây dựng đường chuẩn Realtime PCR phát hiện Salmonella ........... 62 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 65 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pair BPW : Nước pepton đệm (Buffer Pepton Water) CFU : Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit) DNA : Deoxyribonucleic Acid dNTP : Deoxy Nucleotide Triphosphate dsDNA : Double Strand Deoxyribonucleic Acid EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA : Kỹ thuật miễn dịch men (Enzyme – Linked Immuno Sorbent Assay) FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ (Food and Drug Administration) LDC : Lysine Decarboxylase MR : Methyl Red OD : Mật độ quang (Optical Density) PCR : Phản ứng khuếch đại gen (Polymerase Chain Reaction) PE : Polyethylene RNA : Ribonucleic Acid RV : Rappaport – Vassilisdis SPI : Hệ thống gen gây độc (Salmonella pathogenicity island) TBE : Tris Boric acid EDTA TE : Tris EDTA TNF : Yếu tố hoại tử khối u (Tumor Necrosis Factor) TSA : Tryptone Soya Agar VP : Voges – Proskauer WHO : Tổ chức y tế thế giới (World Health Organization) GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella .......................... 4 Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella ......... 7 Bảng 1.3. Kháng nguyên của một số chủng Salmonella ........................................... 9 Bảng 1.4. Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen ................12 Bảng 2.1. Các thông số của cặp mồi invA1,2 ..........................................................39 Bảng 3.1. Mật độ tế bào và đặc điểm hình thái của các chủng.................................45 Salmonella phân lập được.......................................................................................45 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng các loại đường của các chủng Salmonella..............................................................................................................50 Bảng 3.3. Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn Salmonella..............................................................................................................51 Bảng 3.4. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella ........58 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR ...........................59 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi ................... 5 Hình 1.2. Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella..................................... 8 Hình 1.3. Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S. typhimurium..................13 Hình 1.4. Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S. typhimurium ...............................13 Hình 1.5. Biểu đồ khuếch đại của phản ứng Realtime PCR.....................................20 Hình 2.1. Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài...........................30 Hình 2.2. Quy trình phân lập Salmonella ................................................................32 Hình 3.1. Các chủng Salmonella sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường RV ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 44oC ..................................................................................43 Hình 3.2. Các khuẩn lạc của Salmonellas sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường XLD ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37oC .......................................................................44 Hình 3.3. Các khuẩn lạc của chủng vi khuẩn S2 sau 24 giờ nuôi cấy trên môi trường TSA ở điều kiện pH 7,4 và nhiệt độ 37oC ...............................................................44 Hình 3.4. Tế bào của chủng vi khuẩn S2 sau khi nhuộm Gram ...............................47 Hình 3.5. Thí nghiệm lên men đường của các chủng vi khuẩn Salmonella ..............49 Hình 3.6. Khả năng sử dụng lysin của các chủng vi khuẩn......................................51 Hình 3.7. DNA tổng số của các chủng Salmonella..................................................52 Hình 3.8. Kết quả thử nghiệm phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen invA ................53 Hình 3.9. Kết quả khảo sát độ bắt cặp của cặp mồi invA1,2 ....................................54 Hình 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ mồi của cặp mồi invA1,2...............................56 Hình 3.11. Khảo sát độ nhạy của phản ứng PCR.....................................................57 Hình 3.12. Kết quả thử nghiệm phản ứng Realtime PCR phát hiện Salmonella......58 Hình 3.13. Kết quả khảo sát độ nhạy của phản ứng Realtime PCR .........................59 Hình 3.14. Biểu đồ nóng chảy (Melt curve chart) của phản ứng Realtime PCR ......61 Hình 3.15. Biểu đồ đỉnh nóng chảy (Melt curve peak chart) của phản ứng Realtime PCR ........................................................................................................................62 Hình 3.16. Đường chuẩn của phản ứng Realtime PCR ............................................63 GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 1 LỜI NÓI ĐẦU An toàn vệ sinh thực phẩm hiện đang là vấn đề cấp thiết và đáng lo ngại của toàn cầu. Số vụ ngộ độc thực phẩm ngày càng tăng cao đặc biệt là các vụ ngộ độc thực phẩm hàng loạt. Các nguyên nhân gây ra ngộ độc thực phẩm có thể là do tác nhân sinh học (vi khuẩn, vi rút, nấm, ký sinh trùng...), tác nhân hóa học, tác nhân vật lý hay do các tác nhân khác. Trong đó tác nhân sinh học là nguyên nhân phổ biến và nguy hiểm nhất đặc biệt là các vi khuẩn và độc tố của chúng tiết ra. Chúng không chỉ gây hại cho sức khỏe của người tiêu dùng một cách tức thì mà còn có thể gây ra những hậu quả nghiêm trọng và lâu dài. Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae có hơn 2.500 kiểu huyết thanh (serotype), là các trực khuẩn Gram âm, hình que, hiếu khí tùy ý, có thể di động, có khả năng sinh hơi khi lên men dextrose. Chúng được tìm thấy phổ biến trong các loại thực phẩm có nguồn gốc từ động vật như: các loại thịt, trứng, hải sản và các sản phẩm từ chúng. Vi khuẩn này được xác định là tác nhân gây nhiễm độc thức ăn nguy hiểm nhất hiện nay. Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn ở người, Salmonella còn gây ra các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương hàn, phó thương hàn, nhiễm trùng máu cấp tính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp ở cả người và động vật gây ảnh hưởng đến sức khỏe và nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới kể cả Việt Nam. Do vậy, việc phát hiện sớm Salmonella là rất cần thiết. Tuy nhiên ở Việt Nam, việc phát hiện Salmonella hầu hết chỉ dựa trên phương pháp truyền thống: nuôi cấy kết hợp với các thử nghiệm sinh hóa, miễn dịch. Các quy trình này rất phức tạp, độ nhạy thấp và đặc biệt là rất tốn thời gian ít nhất phải mất từ 2 đến 6 ngày. Đó cũng là lý do giải thích vì sao để tìm được nguyên nhân gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm phải mất cả tuần. Kỹ thuật Realtime PCR là kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển từ kỹ thuật PCR truyền thống có độ nhạy cao, vừa cho kết quả định tính vừa kết quả định lượng và đặc biệt là rút ngắn thời gian phát hiện (< 24 giờ) so với các phương pháp truyền thống và các phương pháp sinh học dựa trên GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 2 PCR cổ truyền khác nhưng hiện nay ở nước ta chưa có một công trình nào về ứng dụng phương pháp Realtime PCR phát hiện Salmonella trong mẫu thực phẩm được công bố. Xuất phát từ thực tế trên đề tài “Phát hiện vi khuẩn Salmonella bằng phương pháp Realtime PCR” được tiến hành với các mục tiêu chính sau:  Phân lập các chủng Salmonella có mặt trong một số mẫu thực phẩm thu mua tại các cơ sở chế biến thủy sản và các chợ ở Thành phố Nha Trang và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm sinh hóa.  Xác định gen độc tố invA của vi khuẩn Salmonella bằng kỹ thuật Realtime PCR và so sánh kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện Salmonella, tạo cơ sở khoa học cho việc phát hiện và điều trị bệnh sớm.  Xây dựng đường chuẩn của phương pháp Realtime PCR từ đó có thể định lượng chính xác số bản sao DNA ban đầu có trong mẫu phân tích và suy ra lượng vi khuẩn có trong mẫu thực phẩm. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 3 Chương 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về vi khuẩn Salmonella 1.1.1. Phân loại Salmonella a. Phân loại khoa học Về phân loại khoa học Salmonella được xếp vào: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gramma Proteobacteria Bộ: Enterobacteriales Họ: Enterobacteriaceae Chi: Salmonella Loài: Salmonella bongori & Salmonella enterica b. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên Ðến nay người ta đã xác định được hơn 2.500 kiểu huyết thanh thuộc chi Salmonella. Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S. enterica và S. bongori. S. enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S. enterica (S. enterica I), S. salamae (S. enterica II), S. arizonae (S. enterica IIIa), S. diarizonae (S. enterica IIIb), S. houtenae S. enterica IV) và S. indica (S. enterica VI). Loài S. bongori còn được gọi là Salmonella V ( Popoff, 2001). Các kiểu huyết thanh này được chia theo hệ thống của Kaffmann – White dựa vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay kháng nguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellar antigen) và kháng nguyên vi (vi antigen) (Popoff, 2001; WHO, 2005). Kháng nguyên O là chuỗi phức hợp lipopolysaccharide nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn. Kháng nguyên H được tạo thành bởi các tiểu phần protein roi (flagellin). Sự đa dạng về vùng giữa của flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H. Một số kiểu huyết thanh như là S. typhi, S. paratyphi C, S. dublin còn có thêm kháng GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 4 nguyên vi. Đây là loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polysaccharide của vi sinh vật, có liên quan đến tính độc riêng với tế bào chủ. Các kiểu huyết thanh gây bệnh cho người và động vật máu nóng chủ yếu nằm trong S. enterica I chiếm tới 99,5%. Dưới loài này có 1.478 kiểu huyết thanh. S. enterica II có 498 kiểu huyết thanh, S. enterica IIIa có 94 kiểu huyết thanh, S. enterica IIIb có 327 kiểu huyết thanh, S. enterica IV có 71 kiểu huyết thanh, S. enterica VI có 12 kiểu huyết thanh và S.bongori (V) có 21 kiểu huyết thanh (Bảng 1.1). Bảng 1.1. Số kiểu huyết thanh ở các loài và dưới loài Salmonella Loài Salmonella S. enterica Dưới loài Số kiểu huyết thanh S. enterica (I) 1.487 S. salamae (II) 498 S. arizonae (IIIa) 94 S. diarizonae (IIIb) 327 S. houtenae (IV) 71 S. india (VI) 12 S. bongori (V) 21 Tổng 2.501 (Nguồn: Popoff, 2001) 1.2.2. Các đặc điểm sinh học của Salmonella a. Đặc điểm hình thái của Salmonella Năm 1880, Eberth là người đầu tiên quan sát thấy vi khuẩn Salmonella được phân lập từ lát cắt lách, hạch bạch huyết của bệnh nhân sốt thương hàn dưới kính hiển vi điện tử. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 5 Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Salmonella được quan sát dưới kính hiển vi (Tế bào vi khuẩn có hình que, có lông xung quanh ) Salmonella thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, là vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,7 – 1,5 µm x 2 – 5 µm (Holt, 2002). Đa số các loài đều có khả năng di động mạnh do có lông xung quanh thân trừ S. gallinarum và S. pullorum gây bệnh cho gia cầm. Vi khuẩn dễ nhuộm màu với các thuốc nhuộm thông thường, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu Gram âm, bắt màu đều ở toàn thân hay đậm ở hai đầu. b. Tính chất nuôi cấy Salmonella vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp là 37oC nhưng có thể phát triển được từ 6 – 42oC, pH thích hợp là 7,6, phát triển được ở pH từ 6 – 9 (Holt, 2002). Ở pH > 9 hoặc < 4,5 vi khuẩn có thể bị tiêu diệt. Khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn kém: 50 oC trong 1 giờ, 70oC trong 15 phút và 100oC trong 5 phút. - Trên môi trường thạch thường: Sau 24 giờ vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn đều, nhẵn bóng, rìa gọn, hơi lồi ở giữa, hơi ướt và trông lóng lánh. - Trên môi trường Macconkey: Ở 35 – 37oC sau 18 – 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn, trong, không màu nhẵn bóng và hơi lồi ở giữa. - Trên môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate): Nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc tròn bóng, lồi, có chấm đen ở giữa, đế môi trường màu hồng đậm (Aspinall, 1992). GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 6 - Trên môi trường SS (Salmonella – Shigella): Ở nhiệt độ 35 – 37oC, sau 18 – 24 giờ vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, không màu, nhẵn bóng và có chấm đen ở giữa. - Trên môi trường KIA (Kliger – Iron – Agar): Vi khuẩn lên men đường glucose và không lên men đường lactose, nên phần thạch nghiêng vẫn giữ màu đỏ, phần thạch đứng đổi màu vàng, nếu vi khuẩn có sinh H2S môi trường màu đen, vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch (Aspinall, 1992). Ở một số loài như S. paratyphi B, S. cholerae suis khi nuôi cấy trên thạch peptone dày, sau 1 – 2 ngày khuẩn lạc hình thành bờ có chất dính, chất keo bọc. Trên thạch thường, thỉnh thoảng có thể thấy khuẩn lạc dạng R (Rough) nhám, mặt trong mờ. c. Đặc tính sinh hoá Salmonella có những đặc tính sinh hoá chủ yếu mà dựa vào đó mà người ta có thể định hướng và phân biệt với các vi khuẩn đường ruột khác. Mỗi loại Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi. Phần lớn các chủng Salmonella lên men có sinh hơi các loại đường như glucose, mantose, mannitol, galactose, arabinose (WHO, 2010). Một số loài Salmonella cũng lên men các đường trên nhưng không sinh hơi như: S. abortus equi, S. abortus bovis, S. abortus ovis, S. typh suis, S. typhi,... Riêng S. pulllorum không lên men đường mantose, S. choleraesuis không lên men đường arabinose. Hầu hết các Salmonella không lên men lactose, saccharose. Đa số Salmonella không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không sản sinh indol, một số sử dụng được cacbon ở dạng citrat, phân giải xanh methylen, phản ứng MR (Methyl red), catalase dương tính (trừ S. choleraesuis, S. gallinarum và S. pulllorum), phản ứng H2S dương tính (trừ S. paratyphi A, S. abortus equi, S. typhi suis) (Funk và cs, 2000; WHO, 2003). GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 7 Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc tính sinh hoá của các loài và dưới loài Salmonella Loài Dưới loài S. enterica S. enterica S. salmae S. arizonae Đặc điểm sinh hóa Sorbitol + + + Glucose + + + Saccharose Mannitol + + + Lactose - (75%) (*) γ-Glutamyl+ + tranferase βd d Glucuroidase KCN Galacturonae + Mucate + + + Salicine Dulciol + + ONPG (2h) + LDC + + + VP Malonate + + + “*”: Trừ S. typhimurium và S. dublin S. diarizonae S. houtenae S. indica S. bongori + + + +(75%) + + + + + + + + d + + + + + + - + - + - (70%) + + + + + + + - d d + - + + + + + - “+”: ≥ 90% phản ứng dương tính “-”: ≤ 90% phản ứng âm tính “d”: Cho kết quả khác nhau giữa các phản ứng (Nguồn:http://www.vphcap.org/file/THESIS/4634903%20Mr.Arsooth/chapter2.pdf) 1.2.3. Kháng nguyên của Salmonella Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O); kháng nguyên roi (H) và kháng nguyên vi. Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ lipopolysaccharide gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn. Nội độc tố gồm 3 lớp: lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A). GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 8 Kháng nguyên H (Roi) Kháng nguyên Vi Kháng nguyên O Màng trong Nội bào Lớp peptidoglycan Màng ngoài Tua riềm Hình 1.2. Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella (Nguồn: http://www.kilobooks.com) a. Kháng nguyên thân O Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O (lipopolysaccharide) khác nhau. Kháng nguyên O có cấu trúc dạng sợi lipopolysaccharide được bộc lộ trên bề mặt tế bào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh. Kháng nguyên O gồm hai phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang. Phần nhân cơ bản giống nhau trong tất cả Salmonella. Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị oligosidic lặp lại. Chính các chuỗi ngang này quyết định tính đặc hiệu của mỗi nhóm Salmonella. b. Kháng nguyên vi Kháng nguyên vi là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vi khuẩn, nó có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành. Chức năng chính của kháng nguyên vi là khả năng kết dính, tương tác với vi khuẩn và với các nhân tố khác. Kháng nguyên vi có ở một số kiểu huyết thanh như: S. typhi, S. paratyphi C và S. dublin. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 9 c. Kháng nguyên roi H Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các kiểu huyết thanh của Salmonella. Các protein này vừa tham gia chức năng cấu trúc vừa có khả năng đáp ứng miễn dịch cao. Do đó kháng nguyên H được chọn làm đối tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụ cho việc tạo vacxin tái tổ hợp. Bảng 1.3. Kháng nguyên của một số chủng Salmonella Chủng Nhóm huyết Kháng nguyên O Salmonella thanh (somatic) Kháng nguyên roi H (flagella) Phase 1 Phase 2 S. paratyphi A A 1 , 2, 12 a (1, 5) S. typhimurium B 1, 4, (5), 12 i 1, 2 S. agona B 4, 12 f, g, s - S. derby B 1, 4, (5), 12 f, g (1, 2) S. typhi D 9, 12 (Vi) c 1, 2 S. enteriditis D 1, 9, 12 g, m (1, 7) (Nguồn: http://www.vphcap.org/file/THESIS/4634903%20Mr.Arsooth/chapter2.pdf) 1.2.4. Khả năng và cơ chế gây bệnh của Salmonella a. Khả năng gây bệnh Tùy theo từng loài, Salmonella có thể chỉ gây bệnh cho người hoặc chỉ gây bệnh cho động vật, nhưng cũng có thể vừa gây bệnh cho người và vừa gây bệnh cho động vật. Trong đó những loài Salmonella có thể gây bệnh cho người được quan tâm nhiều hơn cả. Ví dụ: - S. typhimurium và S. enteritidis: Vừa có khả năng gây bệnh cho người vừa có khả năng gây bệnh cho động vật, có thể gặp ở các nước khác nhau trên thế giới. Chúng là căn nguyên chủ yếu của bệnh nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn do Salmonella. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 10 - S. typhi: Chỉ gây bệnh cho người, là vi khuẩn quan trọng nhất trong các căn nguyên gây bệnh thương hàn (typhoid fever). - S. paratyphi A: Cũng chỉ gây bệnh cho người, là căn nguyên gây bệnh thương hàn, tỷ lệ phân lập đứng sau S. typhi. - S. choleraesuis: Là nguyên nhân thường gặp trong các ca nhiễm khuẩn huyết do Salmonella ở nước ta. - S. paratyphi B: Chủ yếu gây bệnh cho người, nhưng cũng có thể gây bệnh cho động vật. Tại các nước châu Âu, tỷ lệ phân lập cao hơn ở nước ta. - S. paratyphi C: Vừa có khả năng gây bệnh thương hàn, vừa có khả năng gây bệnh viêm dạ dày – ruột và nhiễm khuẩn huyết, thường gặp ở các nước Đông Nam Á. b. Cơ chế gây bệnh thương hàn Bệnh thương hàn (typhoid fever) do S. typhi và các S. paratyphi A, B, C gây ra. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo đường tiêu hóa do thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn. Số lượng vi khuẩn đủ để gây bệnh khoảng 105 đến 107 cfu/g. Sau khi vào ống tiêu hóa, vi khuẩn thương hàn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc ruột vào các hạch mạc treo ruột. Ở đây vi khuẩn nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực đi vào máu, lúc này các dấu hiệu lâm sàng bắt đầu xuất hiện. Từ máu, vi khuẩn đến lách và các cơ quan khác, tới gan theo mật đổ xuống rồi được đào thải qua phân; Tới thận, một số vi khuẩn được đào thải ra ngoài theo nước tiểu. Vi khuẩn thương hàn gây bệnh bằng nội độc tố. Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm ở ruột gây ra hoại tử chảy máu và có thể gây thủng ruột, vị trí tổn thương thường ở các mảng payer. Đây là biến chứng hay gặp do bệnh nhân ăn sớm chưa bình phục, nhất là các thức ăn cứng. Nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật ở não thất ba. Giai đoạn toàn phát thân nhiệt tăng cao, sốt “hình cao nguyên”. Thân nhiệt tăng GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 11 nhưng nhịp tim không tăng. Bệnh nhân thường có dấu hiệu li bì, có thể hôn mê, trụy tim mạch, tử vong. Những bệnh nhân qua khỏi, sau khi đã hết các triệu chứng lâm sàng khoảng 5% vẫn tiếp tục thải vi khuẩn qua phân do vi khuẩn vẫn tồn tại trong túi mật. Tình trạng này có thể kéo dài nhiều năm. Họ trở thành nguồn lây bệnh rất nguy hiểm. Bệnh phó thương hàn (paratyphoid fever) có những triệu chứng như bệnh sốt thương hàn nhưng nhẹ hơn. c. Nhiễm khuẩn và nhiễm độc thức ăn Bệnh xảy ra thường là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm bị nhiễm Salmonella. S. typhimurium và S. enteritidits là tác nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm ở người. 75% các vụ ngộ độc là do ăn phải thực phẩm như hải sản, thịt, trứng... bị nhiễm 2 chủng vi khuẩn này (Lee và cs, 2009). Thời gian ủ bệnh trung bình kéo dài từ 10 đến 48 giờ. Đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu, thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ vài giờ. Sau thời gian ủ bệnh, bệnh nhân lên cơn sốt, nôn và ỉa chảy. Khác với sốt thương hàn, bệnh nhân ngộ độc do nhiễm Salmonella chỉ sốt nhẹ có trường hợp không có dấu hiệu sốt. Ở người lớn, rối loạn tiêu hóa thường kéo dài từ 2 đến 5 ngày rồi tự khỏi. Một số rất ít bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn, có thể kéo dài nhiều tháng. 1.2.5. Gen độc tố invA của Salmonella Đến nay genome của nhiều chủng Salmonella đã được giải trình tự và công bố (Bảng 1.4). Bộ gen của Salmonella dài hơn 4,5 Mbp trong đó thành phần GC chiếm 50 – 52%. Genome của các chủng Salmonella không giống nhau khác nhau ở chiều dài hệ gen và thành phần GC. Ví dụ như chiều dài hệ gen của S.typhi là 4.809.037 bp, trong đó thành phần GC chiếm 52,09% còn của S. typhimurium là 4.857.432 bp và 52%. Theo nghiên cứu gần đây nhất, hệ gen 2 chủng này khác nhau 10 – 15%. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 12 Bảng 1.4. Danh sách các chủng Salmonella đã được giải trình tự bộ gen Chủng huyết thanh (Serovar) Đơn vị thực hiện Arizonae RSK2980 Đại học Washinton St. Louis Bongori 12419 Sanger Choleraesuis Đại học Chang Gum Diarizonae CDC 01-0005 Đại học Washinton St. Louis Dublin Salmonella.org Enteritidis PT4 Sanger Enteritidis PT8 Salmonella.org Gallinarum 287/91 Sanger Paratyphi A ATCC9150 Đại học Washinton St. Louis Paratyphi B SPB7 Đại học Washinton St. Louis Paratyphi C Shu-Lin Liu Pullorum Salmonella.org Typhi CT18 Sanger Typhi TY2 Wisconsin Typhimurium LT2 Đại học Washinton St. Louis Typhimurium SL1344 Sanger Typhimurium DT104 Sanger (Nguồn: http://www.salmonella.org) Genome của Salmonella có 5 hệ thống gen gây độc là SPI – 1 (Salmonella pathogenicity island), SPI – 2, SPI – 3, SPI – 4 và SPI – 5. Tất cả các kiểu huyết thanh Salmonella đều mang cụm gen inv (invasion) giúp cho quá trình xâm nhiễm vào trong thành ruột của người và động vật, mở đầu của tiến trình gây bệnh. Cụm gen này nằm trong hệ thống gen SPI – 1 có mặt trong tất cả các Salmonella, từ nhóm tiến hoá thấp nhất là S. bongori đến nhóm tiến hoá cao nhất là S. enterica I. InvA là một bản gen luôn có mặt trong cụm gen inv. Do vậy trong nhiều nghiên cứu, gen invA được sử dụng để xác định sự có mặt của vi khuẩn Salmonella (Rahn và cs, 1992; Chiu và Ou, 1996; Daniele và cs, 2006). Ngoài gen invA người ta còn GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 13 sử dụng trình tự 16S rRNA (Fey và cs, 2004), agfA (Doran và cs, 1993), viaB (Hashimoto và cs, 1995), spvR (Mahon và Lax, 1993), spvC (Chiu và Ou, 1996) ... để phát hiện Salmonella. Hình 1.3. Ví trí các vùng gen gây độc trong hệ gen của S. typhimurium invA (Nguồn: http://www.mgc.ac.cn/cgibin/VFs/genus.cgi?Genus=Salmonella) Hình 1.4. Các gen trong vùng gen SPI – 1 của S. typhimurium (Nguồn: http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/genus.cgi?Genus=Salmonella) GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà 14 1.2.Tình hình ngộ độc thực phẩm do Salmonella gây ra 1.2.1.Trên thế giới Salmonella là một trong những chủng vi khuẩn nguy hiểm nhất hiện nay. Bất kỳ thực phẩm tươi nào có nguồn gốc từ động vật như thịt gia súc, thịt gia cầm, sữa và các sản phẩm của chúng, hải sản cùng với một số rau, quả đều có thể nhiễm vi khuẩn Salmonella (Malonry và cs, 2004). Salmonella có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dưới nước và trên cạn. Đây là nguyên căn chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm, bệnh thương hàn và phó thương hàn ở nhiều quốc gia trên thế giới. Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) hàng năm trên thế giới có hơn 1,3 tỉ trường hợp bị nhiễm Salmonella trong đó xấp xỉ 3 triệu trường hợp tử vong (Lee và cs, 2009). Trong đó, chỉ tính riêng ở Mỹ, hàng năm có tới 1,34 triệu người nhiễm Salmonella (Lee và cs, 2009). Trong số đó có 25,6% trường hợp phải nhập viện và khoảng 30,6% trường hợp tử vong gây tổng thiệt hại kinh tế lên tới hàng tỉ USD. Trong thời gian gần đây, các vụ ngộ độc hàng loạt do Salmonella liên tiếp xảy ra ở Mỹ. Sau biến cố ngộ độc thực phẩm do cà chua nhiễm khuẩn Salmonella xảy ra vào tháng 6 năm 2008 khiến trên 250 người mắc bệnh và làm một người chết, đến năm 2009, Salmonella lại xuất hiện trở lại trong các sản phẩm có chất bơ như bánh quy giòn, các thanh kẹo và kẹo bơ đậu phộng của ít nhất 343 công ty thực phẩm ở 46 tiểu bang của Mỹ làm trên 400 người bị bệnh và ba người tử vong. Ngoài ra các sản phẩm khác như trứng, xúc xích cũng bị nhiễm Salmonella với tỷ lệ rất cao, gây ra các cơn đại dịch Salmonella ở đất nước này. Các cơ quan điều tra Mỹ đã thu hồi hơn 560 tấn xúc xích do Công ty Daniele International sản xuất do nghi bị nhiễm vi khuẩn này. Đặc biệt là theo thống kê gần đây nhất của Trung tâm an toàn về Trứng (Egg Safety Center) vào năm 2010 cứ 20.000 quả trứng ở Mỹ lại có một quả có chứa vi khuẩn Salmonella (chiếm hơn 1% số lượng trứng tiêu thụ mỗi năm) trong đó vi khuẩn S. enteritidis chiếm tỷ lệ cao nhất đã làm cho 1.300 người mắc bệnh trong vòng từ tháng 5 đến tháng 7 nhiều gấp ba lần so với mức trung bình hằng năm của giai đoạn này. GVHD: TS. Phạm Thu Thủy SVTH: Võ Thị Hà