Tài liệu So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng cỏ cứt lợn (ageratum conyzoides l.)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LÊ PHÚC NHƯ AN SO SÁNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DÒNG CỎ CỨT LỢN (Ageratum conyzoides L.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y Cần Thơ, Tháng 12/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH THÚ Y SO SÁNH KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DÒNG CỎ CỨT LỢN (Ageratum conyzoides L.) Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS. Huỳnh Kim Diệu Sinh viên thực hiện: Lê Phúc Như An MSSV: 3092651 Lớp: Thú y K35 Cần Thơ, tháng 12/2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN THÚ Y ------  ------ Đề tài “So sánhkhả năng kháng khuẩn của các dòng Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L)”do sinh viên Lê Phúc Như An thực hiện tại phòng thí nghiệm Dược lý thú y, Bộ môn Thú y, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ từ tháng 8/2012 đến tháng 11/2012. Cần Thơ, ngày … tháng … năm … Duyệt của Bộ Môn Cần Thơ, ngày … tháng … năm … Duyệt của Giáo viên hướng dẫn Cần Thơ, ngày … tháng … năm … Duyệt của Khoa Nông Nghiệp & SHƯD i LỜI CẢM ƠN Trải qua những năm tháng học tập và rèn luyện dưới mái trường Đại Học Cần Thơ. Thầy cô là người đã dành bao tâm huyết cho sự nghiệp trồng người, đã trang bị những hành trang quí báu cho chúng tôi vững bước vào đời. Nhờ sự yêu thương chỉ bảo của thầy cô cùng với sự phấn đấu của bản thân, hôm nay tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp. Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn thành kính nhất đến ba mẹ và gia đình của tôi, những người đã vượt khó khăn để nuôi tôi khôn lớn và trưởng thành như ngày hôm nay. Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ Nhiệm Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, quý thầy cô Bộ môn Thú Y và Bộ môn Chăn nuôi - Thú y đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập. Xin chân thành cảm ơn cô Huỳnh Kim Diệu, đã theo sát hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện nghiên cứu, đã chỉ dẫn nhiệt tình, cung cấp những kiến thức cần thiết để hoàn thành đề tài này. Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Bé Mười, Cố vấn học tập lớp Thú Y K35B, người thầy luôn hết mình quan tâm, lo lắng và giúp đỡ sinh viên chúng tôi trong suốt quá trình học tập. Xin cảm ơn các anh chị học viên cao khóa 18, cảm ơn Chị Nguyễn Thị Hàn Niđã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẽ, động viên tôi thực hiện đề tài. Các bạn lớp Thú Y K35 đã nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ nhau trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Lời cuối, xin được chúc các Thầy, Cô của Bộ Môn Thú Y và Bộ Môn Chăn Nuôi - Thú Y luôn công tác tốt và tìm được niềm vui trong công việc.Chúc các bạn lớp Thú Y K35A, Thú Y K35B, Thú Y LT37 sẽ thành công sau khi tốt nghiệp. Xin chân thành cảm ơn. ii MỤC LỤC TRANG DUYỆT ........................................................................................................ i LỜI CẢM ƠN.................................................................................................. ii MỤC LỤC ............................................................................................................... iii DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. v DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................ vi DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ vii TÓM LƯỢC ......................................................................................................... viii CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN ........................................................................... 2 2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CỎ CỨT LỢN ........................................................ 2 2.1.1 Phân loại .................................................................................................... 2 2.1.2 Đặc điểm hình thái ................................................................................... 2 2.1.3 Phân bố sinh thái ...................................................................................... 3 2.1.4 Bộ phận dùng ............................................................................................ 3 2.1.5 Thành phần hóa học ................................................................................. 3 2.1.6 Tác dụng dược lý ..................................................................................... 3 2.1.7 Tính vị ....................................................................................................... 3 2.1.8 Công dụng và liều dùng .......................................................................... 4 2.1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ........................................... 4 2.2 GIỚI THIỆU MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH .................................. 5 2.2.1 Nhóm vi khuẩn Gram dương .................................................................. 5 2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm ........................................................................ 7 2.2.3 Nhóm vi khuẩn Edwardsiella ............................................................... 11 CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..... 13 3.1 THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU............... 13 3. 2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ................................................................. 13 3.3 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ........................................................... 13 3.3.1 Nguyên liệu ............................................................................................. 13 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất................................................................ 13 3.3.3 Các giống vi khuẩn dùng trong nghiên cứu ........................................ 13 3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 14 3.4.1 Điều chế cao thô ..................................................................................... 14 3.4.2 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Cỏ cứt lợn ................ 16 3.5 CHỈ TIÊU THEO DÕI ........................................................................... 20 3.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ...................................................... 20 CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN............................................................ 21 4.1. HIỆU SUẤT CHIẾT XUẤT CAO CỎ CỨT LỢN .............................. 21 4.2 NỒNG ĐỘ ỨC CHẾ TỐI THIỂU (MIC) CỦA CAO CỎ CỨT LỢN.. 21 4.2.1 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao Cỏ cứt lợn 1 ............................................................................................................ 21 4.2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao Cỏ cứt lợn 2 ............................................................................................................ 22 4.2.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng cao Cỏ cứt lợn 2 ............................................................................................................ 23 iii 4.2.4 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của 3 dòng Cỏ cứt lợn ......................................................................................................... 24 4.2.5 So sánh hoạt tính kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cứt lợn ..................... 30 4.2.6 So sánh hiệu quả của Cỏ cứt lợn trên 8 chủng vi khuẩn thử nghiệm ............................................................................................................................ 30 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................... 33 5.1 KẾT LUẬN ............................................................................................ 33 5.2 ĐỀ NGHỊ .............................................................................................. 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 34 iv DANH SÁCH HÌNH Hình 2.1 Cây Cỏ cứt lợn(Ageratum conyzoides L.) ................................................... 2 Hình 3.2 Quy trình chuẩn độ vi khuẩn ...................................................................... 17 Hình 3.3 Sơ đồ qui trình xác định MIC cao chiết thô ............................................... 19 Hình 4.1 Mẫu đối chứng của 6 chủng vi khuẩn ........................................................ 27 Hình 4.2 Mẫu đối chứng của 2 chủng vi khuẩn gây bên trên thủy sản. .................... 28 Hình 4.3 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 128 µg/ml của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (7) và Edwardsiella tarda (8) ....................................................................... 28 Hình 4.4 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 512 µg/mlvi khuẩn Staphylococcus aureus(2) ................................................................................................................... 29 Hình 4.5 Kết quả nồng độ ức chế MIC = 1024 µg/mlvi khuẩn Staphylococcus aureus(2) và Streptococcus faecalis(3) ..................................................................... 29 v DANH SÁCH BẢNG Bảng 4.1 Hiệu suất chiết xuất cao Cỏ cứt lợn ........................................................... 21 Bảng 4.2 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 1 .......... 22 Bảng 4.3 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 2 .......... 23 Bảng 4.4 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) đối với vi khuẩn của dòng CCL 3 .......... 24 Bảng 4.5 So sánh nồng độ ức chế tối thiểu của Cỏ cứt lợn....................................... 25 Bảng 4.6 So sánh khả năng kháng khuẩn của 3 dòng Cỏ cứt lợn ............................. 30 Bảng 4.7 So sánh hiệu quả Cỏ cứt lợn trên các chủng vi khuẩn thử nghiệm ............ 31 vi DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích DMSO Dimethyl sulfoxide ĐC Đối chứng MIC Minimum Inhibitory Concentration MHA Muller Hinton Agar NA Nutrient Agar DM Dry matter RAPD Random Amplified Polymorphic DNA CFU Colony forming unit CCL Cỏ cứt lợn A. hydrophila Aeromonas hydrophila E. coli Escherichia coli E. ictaluri Edwardsiella ictaluri E. tarda Edwardsiella tarda P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S. aureus Staphylococcus aureus S. faecalis Streptococcus faecalis Sal. spp. Salmonella spp. vii TÓM LƯỢC Đề tài “So sánh khả năng kháng khuẩn của các dòng Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L.)” 3 dòng Cỏ cứt lợn được ly trích bằng methanol 5 ngày (lần 1 trong 3 ngày, lần 2 thực hiện trong 1 ngày, lần 3 thực hiện trong 1 ngày)thu cao để thử khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp pha loãng trên thạch, xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory Concentration) trên 8 chủng vi khuẩn gây bệnh trên gia súc, gia cầm và thủy sản (Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella spp., Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila, Edwardsiella ictaluri, Edwardsiella tarda). Sau thời gian nghiên cứu, chúng tôi thu được kết quả sau:hiệu suất chiết xuất của Cỏ cứt lợn cao nhất ở dòng 3 là 4,02% và thấp nhất là dòng 1 là 3,81%. Hoạt tính kháng khuẩn của cao Cỏ cứt lợn tốt nhất trên 2 chủng Edwardsiella ictaluri và Edwardsiella tarda (128 µg/ml ≤ MIC ≤ 512 µg/ml), ức chế tốt nhất là dòng 2 và dòng 3. Kế đến, trên vi khuẩn Staphylococcus aureus (512 µg/ml ≤ MIC ≤ 1024 µg/ml), tốt nhất là dòng 1 và dòng 3. Trên Streptococcus faecalis, Cỏ cứt lợn ức chế với nồng độ trong khoảng 1024 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml (ức chế tốt nhất là dòng 3). Trên 2 chủng vi khuẩn, Pseudomonas aeruginosa, Aeromonas hydrophila với nồng độ trong khoảng 2048 µg/ml ≤ MIC ≤ 4096 µg/ml (dòng 2 và dòng 3 ức chế tốt nhất, dòng 1 ức chế yếu nhất). Dòng 2 và dòng 3 cao Cỏ cứt lợn ức chế tốtnhất đối với Escherichia coli ở nồng độ MIC = 2048 µg/ml và Salmonella spp. ở nồng độ MIC = 4096 µg/ml, và dòng 1 không ức chế 2 vi khuẩn ở nồng độ 4096 µg/ml. Trong 3 dòng Cỏ cứt lợn thì dòng 3 có hoạt tính kháng khuẩn tốt nhất, tiếp theo là dòng 2 và yếu nhất là dòng 1. Từ khóa: Cỏ cứt lợn, khả năng kháng khuẩn. viii CHƯƠNG 1 ĐẶTVẤNĐỀ Xã hội ngày càng phát triển, cuộc sống ngày càng được nâng cao, nên con người phải cần nhiều yếu tố để đáp ứng chất lượng cuộc sống, trong đó các sản phẩm từ ngành chăn nuôi đóng vai trò quan trọng. Vì vậy ngành chăn nuôi cũng phải phát triển tương xứng với sự phát triển của xã hội.Để ngành chăn nuôi đạt hiệu quả thì việc phòng trị bệnh là không thể thiếu.Từ thực tế đó, các nhà khoa học đã tìm ra nhiều phương pháp để nâng cao hiệu quả phòng và trị bệnh ở vật nuôi, điều đó không thể không kể đến việc sử dụng kháng sinh. Việc lạm dụng kháng sinh để chữa bệnh và kích thích tăng trưởng dẫn đến sự tồn dư lượng kháng sinh trong sản phẩm chăn nuôi, thủy sản cũng như hiện tượng kháng thuốc là một vấn đề nan giải. Sự tồn dư kháng sinh trong sản phẩm động vật gây thiệt hại rất lớn đối với việc xuất khẩu ở nước ta và quan trọng là ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe con người. Do đó, một hướng đi mới là sử dụng thảo dược phòng trị bệnh thay thế việc sử dụng kháng sinh, trong đó có cây Cỏ cứt lợn có dược tính kháng khuẩn tự nhiên. Cỏ cứt lợn là một trong những cây có vị thuốc dùng để điều trị bệnh trong dân gian như trị viêm xoang, chống viêm, chống dị ứng, chống phù nề (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004). Ngoài ra, còn có tác dụng trị mụn nhọt, ngứa lở, eczema, cầm chảy máu các vết thương ngoài do chấn thương (Đỗ Tất Lợi, 2004). Ở Việt Nam, việc sử dụng thảo dược trị bệnh đã có từ lâu đời, mặc dù chưa có nhiều công trình chuyên sâu về khả năng kháng khuẩn của cây Cỏ cứt lợn này. Để tiếp nối những nghiên cứu trước cũng như góp phần nghiên cứu tác dụng dược lý của Cỏ cứt lợn, đề tài “So sánhkhả năng kháng khuẩn của các dòng Cỏ cứt lợn (Ageratum conyzoides L.)” được tiến hành với mục tiêu chọn ra dòng cây Cỏ cứt lợn có hoạt tính kháng khuẩn cao nhất. 1 CHƯƠNG 2 CƠ SỞ LÍ LUẬN 2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CỎ CỨT LỢN 2.1.1 Phân loại Tên khoa học: Ageratum conyzoides L. Họ: Asteraceae (Cúc) Tên khác: câu bù xích, cỏ hôi, cúc hôi, cỏ cứt heo (Đỗ Tất Lợi, 2004) Tên nước ngoài: white weed, goat weed, bastard arimony (Anh), agérate conyzoϊde (Pháp). 2.1.2 Đặc điểm hình thái Cỏ sống hàng năm, thân có nhiều lông nhỏ, mềm, cao chừng 25 – 50 cm. Lá đối xứng hình trứng hoặc ba cạnh, dài 2 – 6 cm, rộng 1 – 3 cm, mép có hình răng cưa tròn, hai mặt đều có lông. Hoa nhỏ, màu tím xanh.Quả màu đen, có năm sống dọc (Đỗ Tất Lợi, 2004). Theo Đỗ Huy Bíchvà ctv.(2004), thân Cỏ cứt lợn có lông mềm, màu lục hoặc tím đỏ.Hai mặt lá có lông mịn, vò lá có mùi đặc biệt. Cụm hoa hình đầu xếp thành ngũ ở ngọn thân hoặc đầu cành, cụm hoa có lông mềm, tổng bao hình đầu gồm những lá bắc xếp thành hai đầu, đầu nhỏ chứa toàn hoa hình ống bé và đều nhau, tràng ngắn, có năm thùy tam giác, màu lam nhạt, tím hoặc trắng. Hình 2.1 Cây Cỏ cứt lợn(Ageratum conyzoides L.) (http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2y_c%E1%BB%A9t_l%E1%BB%A3n) 2 2.1.3 Phân bố sinh thái Chi Ageratum L. có khoảng 45 loài trên thế giới, hầu hết là cây nhỏ, phân bố ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.Cỏ cứt lợn có nguồn gốc ở châu Mỹ, sau phát tán ra khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới.Ở Việt Nam, cây phân bố khắp nơi từ vùng núi cao trên 1500m đến các tỉnh vùng trung du và cả ở đồng bằng.Cây thường mọc ở các nương ngô, bãi sông, ven đường và trong vườn. Cây con được mọc lên từ hạt, hạt có túm lông và phát tán nhờ gió (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004). 2.1.4 Bộ phận dùng Toàn cây, lá và rễ (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004). 2.1.5 Thành phần hóa học Cỏ cứt lợn Việt Nam chứa tinh dầu (0,7 – 2%), carotenoid, phytosterol (ít), tannin, đường khử saponin (hàm lượng trong thân và lá là 4,7%), chất uronic. Ngoài ra một số hợp chất hóa học chứa alkaloid, flavonoid, chromenes, benzofurans và tepenoid cũng được phân lập từ loài này (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004). Theo Adowole (2002), lượng tinh dầu có trong lá (0,11 – 0,58%), rễ (0,03 – 0,18%), nước chưng cất từ hoa tươi (0,20%), chiết xuất ether của hạt giống (0,26%).Tinh dầu có 51 thành phần, trong đó thành phần chủ yếu là precocene I, precocene II và caryophyllen (có hiệu quả chống lại hai loại nấm Penicillin chrysogenum và Penicillin jaanicum và ức chế sự phát triển của vi khuẩn) .Ba thành phần này chiếm 77% tinh dầu (Ling Chau Ming, 1999). 2.1.6 Tác dụng dược lý Cỏ cứt lợn có tác dụng chữa viêm xoang mũi dị ứng (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trên một số động vật thí nghiệm có tác dụng chống viêm ở giai đoạn cấp tính và bán cấp tính, giảm phù, gây teo tuyến ức…. Những thí nghiệm chứng tỏ Cỏ cứt lợn có tác dụng gây teo tuyến ức ở chuột và đối kháng với tác dụng gây co bóp ruột cô lập của histamin trên chuột lang. Ở nồng độ thấp, Cỏ cứt lợn có tác dụng gây giãn mạch ngoại biên, nồng độ cao có tác dụng co mạch nhẹ (Đỗ Huy Bích và ctv., 2004). 2.1.7 Tính vị Theo Đông y, Cỏ cứt lợn có vị cay, đắng, tính mát, tác dụng thanh nhiệt, giải độc, sát trùng, tiêu thũng, trục ứ, dùng chữa cảm mạo, mụn nhọt… (http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C3%A2y_c%E1%BB%A9t_l%E1%BB%A3 n). 3 2.1.8 Công dụng và liều dùng Theo Đỗ Tất Lợi (2004), Cỏ cứt lợn có các công dụng sau: lá và ngọn non vò kỹ, rửa sạch tới khi hết bọt, luộc bỏ nước, vắt kiệt nước, xào hoặc nấu canh với mắm tôm, cá .Phần cây trên mặt đất có tinh dầu chứa phenol được sử dụng làm thuốc. Thường chống phù nề, chống dị ứng trong các trường hợp: sổ mũi, viêm xoang mũi dị ứng cấp và mãn, chảy máu ngoài do chấn thương, bị thương sưng đau, mụn nhọt, ngứa lở, eczema. Liều dùng: 15 – 30 cây sắc nước uống, hoặc dùng cây tươi giã đắp vết thương chảy máu, mụn nhọt, eczema hoặc nấu nước tắm ghẻ, chốc đầu. Theo Đỗ Huy Bích và ctv. (2004), nghiên cứu:Cỏ cứt lợn có tác dụng điều trị viêm mũi, xoang mãn và viêm mũi xoang dị ứng. Không gây tác dụng phụ gì đối với cơ thể người bệnh, trừ tác dụng gây sốt trong thời gian ngắn khi nhỏ mũi.Nhân dân thường dùng cây Cỏ cứt lợn làm thuốc chữa bệnh phụ nữ bị rong huyết sau khi sinh nở. Liều dùng: hái chừng 30 – 50g cây tươi, rửa sạch, giã nát, vắt lấy nước, chia 3 lần uống trong ngày. Uống liên tục 3 – 4 ngày.Ngoài ra còn có thể phối hợp với bồ kết gội đầu vừa thơm vừa sạch gàu, trơn tóc. Lá Cỏ cứt lợn làm thuốc đắp chữa vết thương phần mềm.Ở Ấn Độ, lá Cỏ cứt lợn được dùng làm thuốc chữa vết đứt, vết thương và lở loét.Trong y học dân gian Nepan, nước ép rễ cây Cỏ cứt lợn được dùng để chữa bệnh sỏi thận. Lá làm thuốc săn da, chữa vết thương lở loét. Ngoài ra còn có cách dùng: chọn lấy cây tươi về ngâm rửa sạch rồi để ráo, giã nát, vắt lấy nước tẩm vào bông. Dùng bông này nhét vào lỗ mũi bên đau khoảng 15 – 20 phút.Rút bông ra để dịch mủ từ trong xoang và mũi được giải phóng ra ngoài rồi xì nhẹ nhàng. Tránh xì mũi mạnh vì lúc đó, mủ từ trong mũi xong có thể đi qua đường nối thông giữa mũi và tai (gọi là vòi nhĩ) gây viêm tai giữa cấp (http://www.khoahoc.com.vn/doisong/yhoc/suckhoe/4691Chua-viem-xoang-bang-cay-hoa-cut-lon.aspx). Cỏ cứt lợn có tác dụng giãn cơ, giảm đau hiệu quả và được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh thấp khớp.Tại Brazil, chiết xuất Cỏ cứt lợn đượcthử nghiệm trên các bệnh nhân bị viêm khớp: 66% giảm đau và giảm viêm; 24% cải thiện khả năng vận động sau một tuần điều trị mà không có tác dụng phụ (http://www.rain-tree.com/ageratum.htm#.UqPh4NL3Oe0). 2.1.9 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước Precocene I và precocene II (thành phần chính trong tinh dầu Cỏ cứt lợn) có hiệu quả chống lại hai loại nấm Penicillin chrysogenum và Penicillin jaanicum và ức chế sự phát triển của vi khuẩn (Adowole, 2002). 4 Theo Osho et al. (2011), sử dụng phương pháp khuyếch tán và nồng độ ức chế tối thiểu để nghiên cứu sự nhạy cảm của vi khuẩn và nấm men với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn. Các nồng độ ức chế tối thiểu dao động từ 2,0 – 4,0 mg/ml cho thấy các vi khuẩn thử nghiệm (Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Candida albicans) đều nhạy cảm với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn, trừ vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa là không nhạy cảm với tinh dầu từ thân, lá, rễ của Cỏ cứt lợn. Theo Lin Chau Ming (1999), chiết xuất Cỏ cứt lợn từ ether và chloroform ức chế sự phát triển in vitro của vi khuẩn Staphylococcus aureus. Chiết xuất toàn cây Cỏ cứt lợn từ methanol ức chế sự phát triển của Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli. Nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng chiết xuất của Cỏ cứt lợn có khả năng kháng khuẩn chống Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, và Pseudomonas aeruginosa. Các nhà khoa học cũng đã phát hiện ra rằng Cỏ cứt lợn có tác dụng diệt côn trùng bằng cách can thiệp vào chu kỳ sinh sản của nhiều loài côn trùng. Nghiên cứu độc tính cấp và mãn tính đã được thực hiện ở Brazil với chuột và các nhà nghiên cứu báo cáo rằng Cỏ cứt lợn không độc ở tất cả các liều thử nghiệm(Saxena et al., 1992). 2.2GIỚI THIỆU MỘT SỐ VI KHUẨN GÂY BỆNH 2.2.1 Nhóm vi khuẩn Gram dương 2.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus (S. aureus) Tụ cầu khuẩn là vi khuẩn hình cầu, tụ lại từng đám giống hình chùm nho, có đường kính 0,7 – 1μm, không di động, không sinh nha bào, vi khuẩn có thể gây nhiều biểu hiện khác nhau như các nhiễm trùng của da, tổ chức dưới da, hoặc trong các cơ quan nội tạng, gây mưng mủ điển hình, một số trường hợp chuyển sang chứng huyết nhiễm trùng, chứng bại huyết (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). S. aureuslà loài gây bệnh thường gặp nhất, khi có những tổn thương trên da và niêm mạc hoặc những rối loạn về chức năng thì các nhiễm trùng do S. aureusdễ dàng xuất hiện.S. aureus là nguyên nhân gây viêm xoang, viêm amydale, viêm vú cho người (Trần Thị Phận, 2000). Sức đề kháng: do vikhuẩn không sinh nha bào nên có sức đề kháng kém với tác nhân lý hóa. Vi khuẩn chết ở 70oC trong 1 giờ, ở 80oC trong vòng 10 – 30 phút, đun sôi 100oC vài phút vi khuẩn mới chết. Vi khuẩn chết với tác dụng của thuốc sát trùng: axit fenic 3 – 5% giết vi khuẩn trong 3 – 15 phút, HgCl2 1% trong 30 phút hoặc lâu hơn, cồn 70% diệt trong vài phút, tím gentian 5 1/300000 có thể ngăn được tạp vi khuẩn phát triển (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Tính kháng thuốc: đa số tụ cầu kháng lại penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase. Một số còn kháng lại được methicillin (MRSA: methicillin resistantStaphylococcus aureus) do nó tạo được các protein gắn vào vị trí tác dụng của kháng sinh (Lê Huy Chính, 2007).Theo Nguyễn Thị Kê và ctv. (2006), khảo sát tính đề kháng kháng sinh tại Thành phố Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy các chủng S.aureus phân lập từ bệnh phẩm có đến 94,1% chủng kháng penicillin, 52,9% kháng ciprofloxacin, 52% kháng amoxillin và 12,5% kháng getamicin. Tính sinh độc tố: vikhuẩn có thể sinh các loại độc tố như độc tố dung huyết, diệt bạch cầu, gây hoại tử, độc tố đường ruột. Ngoài các nhân tố trên còn thấy những nhân tố gây bệnh sau: men đông huyết tương, chất làm tan tơ huyết, nhân tố khuyếch tán (Lưu Hữu Mãnh, 2010). Tính gây bệnh: trong tự nhiên, vi khuẩn làm mưng mủ các vết thương, nơi xây sát trên da, làm cáctổ chức bị sưng, tạo thành ổ mủ (áp xe). Một số trường hợp gây chứng huyết nhiễm mủ.Trong phòng thí nghiệm, thỏ cảm nhiễm nhất.Tiêm canh trùng tụ cầu khuẩn vào tĩnh mạch thỏ thì thỏ chết trong vòng 1 – 2 ngày vì chứng huyết nhiễm mủ. Mổ khám thấy nhiều ổ áp xe trong phủ tạng (Trần Thị Phận, 2000). 2.2.1.2 Vi khuẩn Streptococcus faecalis (S. faecalis) Liên cầu khuẩn là các cầu khuẩn Gram dương có dạng hình cầu hoặc hình bầu dục, xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn, chiều dài chuỗi tùy thuộc vào điều kiện môi trường, đường kính có khi đến 1μ, đôi khi có vỏ, bắt màu Gram dương, không di động, hiếu khí tùy nghi (Lưu Hữu Mãnh, 2010). Sức đề kháng: liên cầu khuẩn có sức đề kháng kém với nhiệt độ và hóa chất. Ở 70oC liên cầu chết trong 35 – 40 phút, ở 100oC chết trong 1 phút. Chất sát trùng thông thường dễ tiêu diệt được liên cầu khuẩn (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). Tính kháng thuốc: Streptococcus faecaliskháng gentamicin (7%), streptomycin (21%), gentamicin + streptomycin (22%), tất cả các chủng S. faecalis đều nhạy cảm với ampicillin (Jonhson et al., 1998).S. faecalis được phân lập ở vết thương cho thấy mức độ mẫn cảm cao với các kháng sinh: ofloxacin (83,7%), penicillin (42,9%), streptomycin (57%), ampicillin (71,4%), tetracycline (28,6%), amtyo (85,7%) (Vũ Như Quán, 2010). Tính sinh độc tố: liên cầu khuẩn nhóm A tiết ra độc tố bản chất protein gây ra nốt ban đỏ (liên cầu nhóm B,C ít tiết ra độc tố này) (Nguyễn Như 6 Thanh và ctv., 1997). S. faecalis sinh ngoại độc tố có khả năng dung huyết, diệt bạch cầu, gây hoại tử, làm tan tơ huyết, gây khuếch tán (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Tính gây bệnh:liên cầu khuẩn có khắp cơ thể người và động vật, thường cư trú ở trong họng và ruột. Ở người, vi khuẩn gây những chứng nhiễm trùng như mưng mủ ở phủ tạng, tương mạc, bại huyết, mẫn đỏ. Ở động vật, vi khuẩn gây những chứng mưng mủ, bệnh viêm buồng trứng truyền nhiễm (bò sữa), bại huyết (bê). Trong phòng thí nghiệm, thỏ là động vật dễ cảm thụ nhất. Nếu tiêm liên cầu vào dưới da thỏ sẽ thấy áp xe tại nơi tiêm, nếu tiêm liên cầu vào tĩnh mạch hay phúc mạc, thỏ chết nhanh do nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra cũng có thể gây bệnh trên chuột(Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). 2.2.2 Nhóm vi khuẩn Gram âm 2.2.2.1 Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) Escherichia colilà một trực khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, kích thước 2 – 3 x 0,6 µm, hai đầu tròn, trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, có lông ở xung quanh thân nên có thể di động, không sinh nha bào, có thể có giáp mô (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Sức đề kháng: Escherichia colikhông chịu được nhiệt độ, chết khi đun ở 55 C trong 1 giờ, đun sôi 100oC chết ngay. Các chất sát trùng thông thường axit phenic, biclorua thủy ngân, formol, hydropenoxit 1o/oo diệt vi khuẩn sau 5 phút (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). Theo Merchant and Packer (1967), trực khuẩn này thường bị phá hủy ở 60oC trong 30 phút, ngoại trừ những chủng chịu nhiệt có thể tồn tại; 95% của các tế bào bị phá hủy trong 2 giờ bằng cách làm lạnh trong không khí lỏng. o Tính kháng thuốc: theo nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh Trang và ctv. (2011), thực hiện trên heo con 1 - 60 ngày tuổi tại tỉnh Trà Vinh đã cho kết quả, vi khuẩn Escherichia colinhạy cảm mạnh với imipeneme (97,06%), nhạy cảm tương đối với gentamycin (46,03%), streptomycin (39,68%), ciprofloxacin (38,97%), enrofloxacin (32,35%), clavulanic acid (30,15%). Theo Phan Trọng Hổ (2001), vi khuẩn đề kháng cao với nhiều loại kháng sinh gồm tetracycline (97,06%), trimethoprim/sulphamethazole (86,51%), colistin (86,51%), florfenicol (80,95%), streptomycin (60,32%), gentamycin (53,17%), cephalothin (25%).E. coli có khả năng đề kháng với chloramphenicol (86,7%), penicillin (83,02%), neomycin (11,32%), polymicin B (13,21%), furazolidon (15,09%). Tính sinh độc tố: E. colicó thể sinh ra hai loại độc tố: nội độc tố phá hủy thành mạch máu, làm tăng huyết áp, ngộ độc thần kinh và ngoại độc tố làm 7 phá hủy thành niêm mạc, hấp thu qua đường bạch huyết gây hoại tử và gây nhiễm độc thần kinh (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). Tính gây bệnh: mặc dù có sẵn trong ruột động vật nhưng chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của con vật kém, chăm sóc quản lí chăn nuôi kém. Vi khuẩn thường gây bệnh cho con vật mới đẻ 2 – 3 ngày, có khi từ 4 – 8 ngày, gây bệnh đường ruột cho ngựa, bê, cừu, heo con, gia cầm non. Ở động vật lớn, E. coli có thể gây một số bệnh như viêm phúc mạc, viêm gan, thận, bàng quang, túi mật, buồng vú, khớp xương(Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Người ta gọi bệnh Colibacillosis là bệnh đường ruột do E. coli gây ra cho bê, cừu, heo, gia cầm. Trong phòng thí nghiệm, tiêm dưới da vi khuẩn cho chuột bạch, chuột lang, thỏ có thể gây viêm cục bộ, nếu tiêm liều lớn có thể gây sinh ra bại huyết giết chết con vật (Nguyễn Thị Chính và Trương Thị Hòa, 2005). 2.2.2.2 Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) Pseudomonas aeruginosa là trực khuẩn hình gậy, kích thước trung bình 0,5 – 1,0 x 1,5 – 3µm, hai đầu tròn, đứng riêng từng đơn vị hoặc từng đôi, từng chuỗi ngắn, thỉnh thoảng có hình sợi hoặc hình dấu phẩy, di động, có 1 đến 3 lông ở đầu, không sinh nha bào, giáp mô, Gram âm, không kháng cồn, kháng toan (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). P. aeruginosa là vi khuẩn hiếu khí và yếm khí không bắt buộc, mọc ở nhiệt độ từ 30 - 37oC, giới hạn nhiệt độ phát triển 5 – 42oC, pH thích hợp là 6,6 – 7,0 (Trần Linh Thước, 2006). Sức đề kháng: vi khuẩn sống rất lâu trong môi trường nuôi cấy và trong thiên nhiên, bị diệt sau khi đun 55oC trong 2 giờ, chết nhanh chóng ở 100oC (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Trong môi trường ẩm, thoáng, không có ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp, chúng sống được hàng tuần; trong môi trường có dinh dưỡng tối thiểu, ở 5oC chúng có thể sống hơn 6 tháng (Lê Huy Chính, 2007). Tính kháng thuốc: P. aeruginosa có tính kháng mạnh với cefoperazone và nhóm aminoglycoside (65 – 70%). Kháng sinh thông dụng như ceftazidime cũng chỉ còn nhạy cảm khoảng 50%. Ngoài ra P. aeruginosa có mang plasmid-R có khả năng truyền gen kháng thuốc qua trung gian plasmid (Hoàng Kim Tuyến và ctv., 2005).Theo Trần Linh Thước (2005), Pseudomonas aeruginosalà vi khuẩn kháng thuốc phổ biến, do đó là một loài gây bệnh nguy hiểm, chỉ còn một số ít kháng sinh có tác dụng với nó như: fluoroquinolone, gentamycin và imipenem. Theo Hossain et al. (2013), 100% P. aeruginosa kháng với ampicillin, amoxicillin, tetracycline. Tính gây bệnh: P. aeruginosa là nguyên nhân gây bệnh mủ xanh. Trong thiên nhiên vi khuẩn được tìm thấy trong bệnh viêm phổi hoại tử, viêm ruột 8 hoại tử, bệnh viêm màng ngoài tim.... Trong phòng thí nghiệm, vi khuẩn không có độc lực cao đối với động vật thí nghiệm. Thỏ, chuột có thể chết do bại huyết, chuột lang có thể có bệnh tích hoại tử hoặc hoại thư sau khi tiêm vi khuẩn dưới da (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Ngoài ra, P. aeruginosa còn gây bệnh viêm loét dạ dày trên rắn, viêm phổi và viêm dạ dày ở trăn. Vi khuẩn còn gây bệnh khi sức đề kháng cơ thể yếu như viêm phế quản, viêm màng não, viêm đường tiết niệu, viêm loét trên da, viêm mắt, nhiễm trùng máu (Trần Linh Thước, 2005). 2.2.2.3 Vi khuẩn Salmonella spp. Salmonella spp. gây bệnh đường ruột cho người, gia súc và gia cầm gọi là bệnh thương hàn và phó thương hàn (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). Salmonella là một loại vi khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4 – 0,6 x 1,3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào. Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có từ 7 – 12 lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum – pullorum). Vi khuẩn Salmonella spp. vừa hiếu khí, vừa yếm khí, dễ nuôi, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH từ 7,2 – 7,6 (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Sức đề kháng: Ở 60oC trực khuẩnSalmonella spp. bị tiêu diệt trong một giờ, 70oC trong 20 phút, 75oC trong 5 phút, có thể sinh trưởng trong môi trường thạch ở nhiệt độ 10oC trong 115 ngày. Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn trong nước sau 5 giờ, trong nước đục sau 9 giờ (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Theo Nguyễn Như Thanh và ctv. (1997), các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn: formol 5%, HgCl 1/500 diệt vi khuẩn trong 15 - 20 phút. Nhưng đối với một số hóa chất như: cristal violet, lục malachite, natrihyposunfit, dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho Escherichia colithì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella spp. Tính kháng thuốc: Salmonella spp. có khả năng đề kháng với chloramphenicol (37,4 – 68,1%), tetracycline (33,4 – 59,6%), streptomycin (74,6 – 89,2%). Những kháng sinh dùng nhiều và rộng rãi thì tỉ lệ kháng thuốc cao như ampicillin, sulfonamide... (Bùi Thị Tho, 2003). Tính sinh độc tố: Salmonella spp. tiết hai loại độc tố đó là nội độc tố (gây xuất huyết và mụn loét), ngoại độc tố (tác động vào thần kinh và ruột) (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). Tính gây bệnh: bình thường có thể phát hiện Salmonella trong ruột của bò, lợn, vịt và một số động vật khỏe mạnh. Khi điều kiện chăm sóc quản lí không tốt làm cho sức đề kháng của con vật yếu kém thì vi khuẩn xâm nhập 9 vào nội tạng gây bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1977). Ngoài ra Salmonella còn gây nhiễm trùng huyết ở bò cái khi đẻ, gây còi ở bò trưởng thành đang cho sữa (Soika et al., 1974). Trong phòng thí nghiệm, chuột bạch cảm nhiễm nhất, khi cho ăn hay tiêm đều gây bệnh được. Chuột lang, thỏ sau khi tiêm dưới da phát sinh phù thủng (Nguyễn Như Thanh và ctv., 1997). 2.2.2.4 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila(A. hydrophila) Aeromonas hydrophila là trực trùng hình gậy ngắn, hai đầu hơi tròn, đầu có tiên mao, kích thước khoảng 0,5 x 1,0 – 1,5 µm, yếm khí tùy tiện (Bùi Quang Tề, 2006). Theo Từ Thanh Dung và ctv. (2005),Aeromonas hydrophilakhông sinh nha bào, không có giác mạc, di động, là vi khuẩn Gram âm. Vi khuẩn có tăng trưởng tối ưu ở 28oC, nhưng cũng có thể phát triển từ 4oC đến 37oC. Sinh trưởng trong môi trường có độ pH thích hợp 7,1 - 7,2. Những chủng vi khuẩn này phân bố rộng rãi trong môi trường, có thể tìm thấy trong đất, nước, thực phẩm và đường ruột của người và động vật (Marcel , 2001). Tính kháng thuốc: Aeromonas hydrophila phân lập từ nước, thịt, cá có tỉ lệ kháng cao với nhiều loại kháng sinh mạnh như ampicillin (100%), tetracycline (26%), oxacillin (100%), bacitracin (100%), streptomycin (26%), clindamycin (43%), nalidixic acid (26%), novobiocin (87%), rifampicin (4%), vancomycin (9%) (Orozoval et al., 2008). Theo Austin and Austin (1993) và Từ Thanh Dung và ctv.(2005), điều trị bằng thuốc doxycycline, hoặc oxytetracycline; vi khuẩn Aeromonas hydrophila đề kháng lại một loạt các hợp chất kháng sinh, bao gồm ampicillin, chloramphenicol, erythromycin, nitrofurantoin, novobiocin, streptomycin, sulphonamides và tetracycline. Tính sinh độc tố: Aeromonas hydrophila có khả năng sinh các độc tố như: độc tố đường ruột (enterotoxins), độc tố dung huyết (hemolysins), phân giải protein (proteinase), độc tố hoại tử da (dermonecrotic), nội độc tố (Cahill, 1990). Tính gây bệnh:A. hydrophila thường gây bệnh nhiễm trùng ở nhiều loài động vật thủy sản nước ngọt. Ở Việt Nam các loại cá nuôi lồng, bè, ao nước ngọt thường gặp bệnh đốm đỏ như trắm cỏ, cá chép, cá ba sa, cá tai tượng.... Vi khuẩn có thể gây bệnh ở ba ba, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm càng xanh. Tỷ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30 – 70%, riêng ở cá giống (ba ba, trê) có thể chết 100% (Bùi Quang Tề, 2006). 10