Tài liệu Thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật và những ứng dụng của enzyme protease.

Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật LỜI MỞ ĐẦU Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thực phẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới công nghệ thu nhận Protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme Protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease chủ yếu tập trung vào các Protease thực vật và động vật còn Protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây. Công nghệ enzyme ở nước ta hiện còn rất mới mẽ, đang trong giai đoạn hưởng ứng và ngày hoàn thiện dần lĩnh vực này trong tương lai. Do vậy việc đi sâu và tìm hiểu enzyme Protease, nguồn thu nhận Protease từ vi sinh vật cũng như những ứng dụng của nó là một đề tài mang tính thời đại, cấp thiết trong tình hình Việt Nam đang hội nhập mạnh mẽ với nền kinh tế thế giới. Qua nhiều năm, việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp Protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn. Tuy nhiên giá thành Protease còn khá cao, do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất. Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chiếm 20-30% [6]. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu được chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Và với đề tài “Thu nhận enzyme Protease từ vi sinh vật và những ứng dụng của enzyme Protease” mong muốn sẽ góp phần làm rõ những đặc điểm, tính chất liên quan đến enzyme Protease cũng như các phương pháp thu nhận, tinh chế và những ứng dụng mang tính thực tế của nó. Hy vọng trong tương lai lĩnh vực này sẽ được nghiên cứu nhiều hơn nữa ở các nước, đặc biệt ở Việt Nam chúng ta để phục vụ tốt hơn cho đời sống của con người. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 1 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Phần I - Tổng quan về enzyme protease và nguồn thu nhận 1.1. Tổng quan về enzyme Protease [2] 1.1.1 Giới thiệu chung - Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử protein và các cơ chất tương tự. Hình 1.1. Phản ứng thủy phân liên kết peptide Nhiều Protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin. Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ: - Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch polypeptit - Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase. - Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit. - Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...) [12]. Trong cơ thể, các Protease đảm nhiệm nhiều chức nǎng sinh lý như: hoạt hóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phóng hormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyển protein qua màng...[3]. Ngoài ra, các Protease có thể hoạt động như các yếu tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tǎng sự phân chia tế bào, sinh tổng hợp ADN...[2]. So với Protease động vật và thực vật, Protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ Protease vi SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 2 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên Protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2. Cấu trúc không gian enzyme Protease 1.1.2 Đặc điểm và tính chất của Protease vi sinh vật [7] Các công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các Protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau về nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động thích hợp,… các nhà khoa học đã phân loại các Protease vi sinh vật thành bốn nhóm như sau: P-xerin; P-thiol; P-kim loại; P-acid Một số tác giả khác chia Protease ra ba nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: Protease-acid; Protease trung tính; Protease kiềm. Trong bốn Protease kể trên, các Protease-xerin và Protease-thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của aa. Ngược lại các Protease kim loại, Protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn suất của aa. Hình 1.3. Cấu trúc tinh thể của Tripsin (1 Protease xerin tiêu biểu) Nhiều Protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạo SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 3 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tử thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 Dalton. Tuy nhiên, cũng có một số P-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme của Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp, oryzae OUT 5038 (52.000). Trọng lượng phân tử của các Protease kim loại lớn hơn so với P-xerin (vào khoảng 33.800 - 48.400). Protease tiol và nhiều Protease-acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.00040.000 Dalton. Có thể tóm tắt những đặc tính của các nhóm Proteinase này ở bảng 1.1 Bảng 1.1 Một số tính chất của Protease (P) vi sinh vật Nhóm Nguồn E Chất kìm Đặc điểm hãm DFP+ P Xerin Bac.subtilis pH TTHĐ Xerin thích Kiềm -SH 7,5 Bac.pumilus Str.griseus Str.fradiae Art hrobacter B22 Asp.oryzae Asp.flavus Asp.sojae P-tiol P loại E.coli Streplococcus Indoaxeta-mit Clostridium histoly-ticum Ps.cloromer- 7,0 curbenzoat EDTA++ Kim loại hóa Trung Bac.subtilus NRRL B3411 1,10octa- trị hai Bac. Subtilisamy fenantrolin kim Bac.subtilus Losaccarilicis Bac. Megaterium Psuedomonasaeruginoa SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 4 tính tối Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Atreptomeces naraensis Asp. Oryzae Acremonium kiliense P Acid Clostridiumhisttolytium Asp.niger Dizoaxetil Asp.Awamori Dlnorlox- Sailoi,penicillium inmetil este COOH Acid Janthinellum Rhizopus chinensis Mucor pucillus Endothia parasilica 1.1.3. Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của Protease [7] Trong TTHĐ của Protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: - TTHĐ của Protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả cofactơ kim loại. + Các Protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 0A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. + Đối với các Protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã cho thấy phân tử các Protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 200A. Khe hở này là phần xúc tác của các E, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các Protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các Protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau: E+S enzyme – S SVTH: Võ Thành Hoàng enzyme – S + P1 Trang 5 enzyme + P2 Hình 1.4 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enxyme Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, enzyme - S: Phức chất enzym- cơ chất, P 1: Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng. 1.2. Nguồn thu nhận Protease [3] - Enzyme là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là ba nguồn chính: Động vật, thực vật và vi sinh vật. - Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên nguồn enzyme ở vi sinh vật phong phú nhất, có ở hầu hết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn… có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống [3]. - Enzyme Protease từ nguồn động vật và thực vật được loài người khai thác và ứng dụng hàng ngàn năm để sản xuất và phục vụ trong cuộc sống. Nhưng hiện nay lượng enzyme thu nhận từ thực vật và động vật được thay thế dần bằng enzyme vi sinh vật. enzyme thu nhận từ các nguồn này thường rất khó và hiệu quả kinh tế không cao. Nguồn enzyme từ vi sinh vật dần dần thay thế enzyme từ động vật và thực vật do hàng loạt những ưu điểm về sinh lý vi sinh vật và về kỹ thuật sản xuất được liệt kê như sau: + Vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể chúng hàng ngàn lần sau một ngày đêm. + Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao. + Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh, trong thời gian ngắn có thể thu được lượng sinh khối vi sinh vật rất lớn, giúp trong một thời gian ngắn thu được một lượng enzyme nhiều hoặc lượng các sản phẩm trao đổi chất cao. + Một đặc điểm riêng có của vi sinh vật đó là cơ thể nhỏ bé nên việc vận hành, kiểm soát thiết bị lên men trong quá trình sản xuất đơn giản hơn rất nhiều. + Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp: SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 6 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Trong sản xuất, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được. + Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẽ tiền và dễ kiếm, không chỉ có ý nghĩa về mặt kinh tế mà còn có ý nghĩa rất lớn về mặt môi trường sống. vi sinh vật không đòi hỏi quá khắc khe những yếu tố dinh dưỡng của môi trường, nhất là những vi sinh vật tổng hợp enzyne. Chính vì thế enzyme được sản xuất từ vi sinh vật thường rẻ tiền hơn enzyme từ các nguồn khác. + vi sinh vật có thể sinh tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau [7]. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 7 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Phần II - Tình hình nghiên cứu enzyme protease 2.1 Tình hình nghiên cứu enzyme trong nước Hầu như mọi phản ứng hoá học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme - chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, các nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của các cán bộ hoá sinh học, sinh học thực nghiệm và nhiều nhà nghiên cứu ở các lĩnh vực liên quan khác. Các nghiên cứu nhằm theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo các chế phẩm có độ sạch khác nhau, nghiên cứu cấu trúc, mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enayme, khả năng ứng dụng enzyme trong thực tế [3]. Và gần đây nhất là những sáng tạo mới mẽ, mang tính ứng dụng lớn được sử dụng rộng rãi như: + Trần Quốc Hiền, Lê Văn Việt Mẫn, Trung tâm Công nghệ sau thu hoạch, Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II, Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia Hồ Chí Minh đã “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm Protease từ ruột cá Basa (pangasius bocourti)” thực hiện năm 2006. Nghiên cứu này khảo sát quá trình trích ly và tinh sạch enzyme Protease từ ruột cá Basa (Pangasius bocourti). Dịch chiết protease kiềm thu được từ ruột có tổng hoạt tính cao nhất là 15,79UI/gCKNT (chất khô nội tạng) trong điều kiện chiết: tỷ lệ mẫu/dung môi 1/1(w/w); pH 9,5; nhiệt độ 35oC; thời gian chiết 10 phút. [14]. + Tối ưu một số điều kiện nuôi cấy chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease được thực hiện của Quyền Đình Thi, Trần Thị Quỳnh Anh, Nguyễn Thị Thảo (2007), viện CNSH đã chứng minh các điều kiện thuận lợi nhằm nuôi cấy với hiệu suất cao nhất đối với chủng vi sinh vật biển Acinetobacter sp. QN6 sinh tổng hợp Prơtease [15]. + Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phạm Thị Ánh Hồng, Đại học Cần Thơ, Trường ĐHKH Tự nhiên, ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh đã tiến hành “Tinh sạch và khảo sát đặc điểm của các Serine Protease từ Trùn Quế” ( 2007). Bước đầu khảo sát hệ enzyme Protease từ trùn quế (Perionyx excavatus) cho thấy phần lớn các protease trong dịch chiết enzyme thô có thể tinh sạch sơ bộ bằng tủa phân đoạn với ammonium sulfat nồng độ trong khoảng 30-80%. Nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme thô hoạt động trên cơ chất casein là 550C và pH trong khoảng kiềm 10 -12. [16],[4]. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 8 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật + “Nghiên cứu ứng dụng Protease bacillus subtilis trong sản xuất bột đạm thủy phân từ cá Mối”, Vũ Ngọc Bội, trường Đại học thủy sản Nha Trang. Qua nghiên cứu cho thấy protease B. subtilis có thể thủy phân mạnh mẽ cơ thịt cá mối và hoàn toàn có thể sử dụng enzyme này trong sản xuất bột đạm thủy phân. Khi bổ sung protease B. subtilis với nồng độ enzyme 0,3% vào hỗn hợp cơ thịt cá mối và thủy phân ở 500C. + Nghiên cứu ứng dụng Protease trong sản xuất Bia, thực hiện trong các năm 1993-1994, Thực hiện: TS.Trương Thị Hòa và các công tác viên Viện Công nghiệp thực phẩm. Protease của Aps. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn. [8] 2.2. Vấn đề sản xuất enzyme Protease trên thế giới Trong các Protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớm hơn cả. Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là Protease đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm. Năm 1861 Brucke cũng đã tách được Pepxin từ dịch dạ dày Chó ở dạng tương đối tinh khiết. Ngoài các enzyme của hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [11]. Các Protease thực vật được phát hiện muộn hơn. Năm 1879 Wurtz được xem là người đầu tiên tách được Protease thực vật. Đến nay người ta đã nghiên cứu được khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều Protease như: papain, tripxin, kimotripxin, subtilizin… [11]. Các Protease của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải Protein của Xạ khuẩn. Trong hơn 10 năm nay số công trình nghiên cứu Protease vi sinh vật tăng lên đáng kể nhiều hơn các Protease của động và thực vật. Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần mở rộng quy mô sản xuất chees pha enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế [11]. Trong CNTP, người ta sử dụng Protease để sản xuất phomat từ sửa (Mohanty et al.,1999), xản xuất bánh từ bột mì (Hozova et al., 2003) hay chế biến các sản phẩm giàu protein từ đậu tương (Ghazi et al., 2003; Ma et al., 2004); trong công nghiệp thuộc da, SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 9 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Protease được dùng để thủy phân một số thành phần phi collagen của da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin (Gupta, Rammani, 2006); trong chất tẩy rửa, Protease là một trong những thành phần quan trọng của tất cả các loại chất tẩy rửa, từ các chất tẩy rửa dùng trong gia đình đến những chất làm sạch kính hoặc răng giả, kem đánh răng (Rao et al., 1998). Trong những năm gần đây, giá trị thương mại của các enzyme công nghiệp trên toàn thế giới đạt khoảng 1 tỷ USD, trong đó chủ yếu là các enzyme thủy phân (75%), và Protease là mô ̣t trong ba nhóm enzyme lớn nhất sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao et al., 1998) [13]. Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt Protease động vật, thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu. Thời gian gần đây các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về Protease vi sinh vật và đã đạt nhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (Protease từ vi sinh vật chiếm tới 40% tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) [13]). Hiện nay, số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nước phát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn với doanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD. Trong đó khoảng 600 tấn Protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vật bao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc. Những nước có công nghệ sản xuất và ứng dụng Protease tiên tiến trên thế giới là: Đan Mạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo. Các nước này đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Protease từ VSV. Chính vì thế nhịp độ sản xuất Protease ở quy mô công nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5%- 10%. Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mang không tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần. Vì vậy mà việc ứng dụng Protease ngày càng gia tăng[4],[1]. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 10 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Phần III - Đặc điểm nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme protease - Trong nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme có một số kỹ thuật chung và một số kỹ thuật riêng. Những kỹ thuật chung bao gồm: [7] + Kỹ thuật tạo giống + Lựa chọn phương pháp nuôi cấy + Thiết kế thiết bị nuôi cấy + Kỹ thuật lên men + Tách, tinh chế thu nhận E. - Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease, các enzyme này có thể ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy. Một số Protease ngoại bào đã sản xuất quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp, trong nông nghiệp và trong y học. - Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme Protease chủ yếu gồm: vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn. 3.1 Vi khuẩn Lượng Protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng [6]. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả liên kết peptide trong phân tử protein [6]. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 11 Hình 3.1 Baccillus subtilis năng phân hủy tới 80% các Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp Protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các Protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.[2] Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các Protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với Protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo và thơm và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [2]. Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000-30.000dalton. Ổn định trong khoảng pH 6-12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7-12. [2] 3.2 Nấm mốc Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn Protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicilliumchysogenum)…các loại nấm mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại P: acid, kiềm và trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các Protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5-3 [2]. Hình 3.2 Aspergillus oryzae Hình 3.3 Condium of Aspergillus oryzae Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp Protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomát. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 12 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật 3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp Protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus…[2]. Hình 3.4 Xạ khuẩn Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin. Từ S. fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin. Ở Mỹ, CP được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da [2]. Protease từ S. fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công nghiệp chế biến thịt. Bảng 1.2 Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Protease (P) Vi khuẩn VSV Bac. Subtilispha Ghi chú P trung tính, P kiềm (subtillzin) Bac. Cireulans Bac. Sphaericus Bac. Thermophilus Bac. Aerothermophilus Bac. Thermoacidurans Bac.Thermoproteoly ticus P kiềm Bac. Brevis Bac. Licheniformis P trung tính Bac. Mesenlericus P Trung tính, P acid SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 13 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Bac. Megaterium P acid và P kiềm Bac. Cereus Bac. Pumilus { colagenase Cl. Perfringens Cl. Histolyticum Cl. Sporogens P trung tính,P kiềm Xạ Ps. Aerruginosa Str. Griseus Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ, gồm ít khuẩn Str. Rimosus nhất 11 enzyme với cơ chất procolagen Str. fradiae phân giải 70% Str. faeca is peptidase Str. reetus var. pro-teolyticus cacboxypeptidase), hai P: P- serin. Nấm Asp. Oryzae P-kim loại, P xerin, có 3 loại mốc Asp. Satoi P acid, đến aa có 5 P, hai (lơxinamino-peptidase, P trung tính, P kiềm. P acid (aspergilopepti- dase A) Asp. Awamori P acid Asp. Niegr Hai P acid Asp. Shirousami P acid Asp. Fumigatus Hai P: Pacid, và P kiềm Asp. Tericola P acid có tác dụng làm đông sữa P trung tính Asp. Candidus P kiềm Hai P: P kiềm và P trung tính Asp. Ochraceus P acid P kiềm Asp. Sojae P acid có tác dụng làm đông sữa đã được Asp. Flavus dùng ở Nhật để thay thế cho rennin. Pen. Janthinellum Pen. Chrysogenum SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 14 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Pen. Cyaneo fulvum Mucor. Pusillus Rh. Chinensis Ph. Delemar Ph. Niveus Ph. Nodous Ph. Pseudokinensis Ph. Peka Phymatorrichum omnivorum SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 15 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Phần IV – Phương pháp thu nhận enzyme protease từ vi sinh vật 4.1 Tuyển chọn giống vi sinh vật cho enzyme Protease có hoạt lực cao Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khẳ năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. Có thể thông qua các phương pháp sau: - Phương pháp gây đột biến - Phương pháp biến nạp - Phương pháp tiếp hợp gene - Phương pháp tải 4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật tổng hợp enzyme Protease Để tổng hợp enzyme Protease cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãm nhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, N, H, O. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác. 4.2.1 Nguồn cacbon [1],[11] Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit, tùy thuộc vào đặc tính của enzyme và nòi vi sinh vật mà người ta lựa chọn cho thích hợp. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 16 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật - Có nhiều hợp chất hydratcacbon và các hợp chất khác là nguồn cacbon thích hợp đối với nấm mốc sinh ra enzyme Protease có hoạt lực cao. Các nguồn cacbon có tác dụng đến sinh tổng hợp Protease của Asp. oryzae 79có thể theo thứ tự: fructoza→ sacaroza→ maltoza→ glucoza→ manit→ arabinoza→ galactoza. - Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme Protease. 4.2.2 Nguồn nitơ [1] Nguồn nitơ sử dụng rất phong phú, bao gồm 2 nhóm: vô cơ và hữu cơ. Đối với một số loài nấm mốc thuộc họ (A. oryzae, A. awamori, A. niger, A. flavus) trên môi trường có các nguồn nitơ hữu cơ sinh tổng hợp Protease axit cao. Nhiều kết quả nghiên cứu cho thấy sinh tổng hợp enzyme được nâng cao khi trong môi trường có đồng thời cả nguồn nitơ hữu cơ và nitơ vô cơ. Cho thêm vào môi trường có cám mì, bột đậu tương đã tách chất béo, các nguồn nitơ và hữu cơ hoạt lực enzyme Protease tăng 22- 74%. Còn trường hợp dùng các nguồn nitơ vô cơ duy nhất trong môi trường sẽ dẫn đến ngừng sinh tổng hợp Protease nói chung. Các acid amin có ảnh hưởng rõ rệt tới sinh tổng hợp enzyme bằng vi sinh vật. Glyxin, alanin, metionin và lơxin có tác dụng làm tăng hoạt lực Protease của chủng đột biến A. oryzae 251- 90 đến 6- 9% và nguyên chủng A. oryzae 132- 63 tới 7- 24%. Ngoài ra, các bazơ purin như A (adenin), G (guanin) và các dẫn xuất của chúng, ARN và các sản phẩm thuỷ phân cũng làm tăng đáng kể sinh tổng hợp proteinza VSV. 4.2.3 Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố kích thích sinh trưởng [1] - Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động vi sinh vật. Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao. - Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trường nuôi cấy. Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25-300C. Trị số pH ban đầu của môi trường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thành E, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi VSV. + Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợp enzyme. Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ở môi trường bề sâu (môi SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 17 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắc thì việc này cực kỳ quan trọng). Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường bề mặt. + Khi lựa chọn môi trường cần chú ý đến cả thành phần định tính và định lượng sao cho quá trình sinh tổng hợp enzyme mong muốn là cao nhất 4.3 Nuôi cấy thu nhận chế phẩm enzyme Protease bằng phương pháp bề mặt [3] Là phương pháp tạo môi trường cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường. Có thể là môi trường lỏng hoặc đặc. Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh, nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đâm sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Đối với một số mục đích đặc biệt, người ta nuôi vi sinh vật trực tiếp trên bề mặt hạt gạo (sản xuất tương), hạt đậu tương (đậu tương lên men- misô) đã được nấu chín trộn hạt cốc còn sống (làm men thuốc bắc, men dân tộc, làm tương). Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh… có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu, có bề mặt tiếp xúc lớn, mông, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỉ lệ các chất phụ gia phải bảo đảm sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. - Ưu, nhược điểm + Nồng độ enzyme tạo thành cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật. Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme. Chế phẩm khô, dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme. Tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản dễ thực hiện và dễ dàng xử lý khi bị nhiễm vi sinh vật lạ, có thể thực hiện qui mô gia đình, trang trại cũng như ở qui mô lớn đến 20Tấn/ngày. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 18 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật + Tuy nhiên phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hoá, tự động hoá, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều. Ngoài ra phương pháp nuôi cấy bề mặt có một nhược điểm rất lớn là tốn nhiều diện tích. Do vậy mà phương pháp này dần được thay thế bằng nuôi cấy chìm để nuôi cấy vi khuẩn. 4.4 Thu nhận enzyme (E) 4.4.1. Tách và làm sạch chế phẩm enzyme [3] Enzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme nội bào (intracellular enzyme), nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống. Đó là các enzyme ngoại bào (extracellular enzyme). Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào. - Các phân tử enzyme nội bào không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các cấu tử của tế bào. Do đó để có thể chiết rút các enzyme này, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vào dung dịch. Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate... và chất detergent. Các hóa chất có tác dụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ. Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính. + Có một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý. Trước hết đó là nhiệt độ. Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C). Các thao tác phải nhanh. Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút. - Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex. SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 19 Thu nhận và ứng dụng enzyme Protease vi sinh vật Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tử lượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc ký (sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel. -Mục đích yêu cầu: Các chế phẩm enzyme được sử dụng ở các dạng khác nhau theo mức độ tinh khiết (hoạt độ riêng). Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật có chứa enzyme được sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu chúng không gây ảnh hưởng đáng kể đến sản phẩm và quy trình công nghệ sau này (Ví dụ: sản xuất rượu, nước chấm thực vật, da). Cũng có khi người ta cần sử dụng chế phẩm enzyme tinh khiết trong công nghiệp dệt, công nghiệp mạch nha, y học, nghiên cứu khoa học. Enzyme nói chung rất dễ bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài do đó khi tách và tinh chế enzyme để tránh sự biến hình protein ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme cần tiến hành nhanh chóng ở nhiệt độ thấp, độ pH thích hợp không có mặt các chất gây biến hình enzyme. - Để trích ly enzyme ra khỏi tế bào trước hết cần phải phá vỡ thành tế bào, màng tế bào và những cấu trúc dưới tế bào bằng những phương pháp lý học hoặc hóa học. Đối với trường hợp enzyme còn nằm trong tế bào (E nội bào nuôi bằng phương pháp bề mặt) thì cần phải giải phóng enzyme bằng cách phá vỡ tế bào thu nhiều cách như: + Nghiền nhỏ, nghiền với cát, nghiền với vụn thủy tinh, nghiền bi. + Để tế bào tự phân hủy + Dùng tác dụng của siêu âm hoặc tạo áp suất thẩm thấu cao, trích ly bằng muối, dung dịch muối trung tính, dung môi hữu cơ. + Kết tủa enzyme bằng các chất điện ly thích hợp. - Thẩm tích [9] Trong quá trình tinh sạch các enzyme để loại bỏ các phân tử hòa tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như amoni sulfat sau khi kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh dùng trong sắc SVTH: Võ Thành Hoàng Trang 20