1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN HÓA HỌC
________________v
vv________________
LÊ THỊ HỒNG NHUNG
NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ THĂM DÒ HOẠT TÍNH SINH HỌC
CỦA LOÀI THÔNG LÁ DẸT (PINUS KREMPFII LECOMTE) VÀ
NGŨ GIA BÌ HƯƠNG (ACANTHOPANAX TRIFOLIATUS L. MERR.)
Chuyên ngành : Hóa học hữu cơ
Mã số: 62.44.27.01
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC
HÀ NỘI - 2014
2
Công trình được hoàn thành tại:
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam.
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Trịnh Thị Thủy
2. TS. Nguyễn Thanh Tâm
Phản biện 1: PGS.TS. Phan Văn Kiệm
Phản biện 2: PGS. TS. Trần Thị Như Mai
Phản biện 3: GS. TS. Đinh Thị Ngọ
Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại:
Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Số 18, Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội.
Vào hồi
giờ
ngày 8 tháng 11 năm 2014
Có thể tìm hiểu luận án tại:
Thư viện Quốc gia Việt nam
Thư viện Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam
3
I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
I.1. Đặt vấn đề
Việt Nam có nguồn thực vật rất phong phú và đa dạng. Theo các số
liệu thống kê của Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Thế giới (IUCN), hệ thực
vật Việt Nam có trên 12.000 loài và khoảng 4.000 loài được sử dụng
trong dân gian làm thuốc chữa bệnh. Tuy nhiên hầu hết các loài cây
thuốc này được dùng theo kinh nghiệm dân gian. Vì vậy, việc nghiên
cứu về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các đối
tượng này để tạo cơ sở khoa học nhằm bảo tồn các giá trị truyền thống
trong y học dân tộc và phát huy các tiềm năng của chúng theo hướng
hiện đại là việc làm cần thiết.
Loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) thuộc chi Pinus, họ
Pinaceae. Loài này mới chỉ có một công bố trên thế giới từ 1966 và là
loài đặc hữu của Việt Nam, một thực vật cổ “hóa thạch sống” hiếm hoi
còn sót lại cho đến ngày nay. Việc nghiên cứu về thành phần hóa học và
hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt ngoài ý nghĩa về khoa học còn
có ý nghĩa rất lớn về mặt xã hội.
Loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) thuộc
chi Acanthopanax, họ Araliaceae. Ngay từ những năm 80 của thế kỷ
trước, đã có nhiều công trình công bố về thành phần hóa học của cây
này. Nhiều hợp chất triterpene acid có khung lupan với hàm lượng khá
cao đã được phân lập và xác định. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có công
trình khoa học nào về nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất triterpene từ cây
này được công bố.
Do đó, luận án được thực hiện với tên đề tài: “Nghiên cứu hoá học và
thăm dò hoạt tính sinh học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
và Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.)”.
I.2. Mục tiêu của luận án
- Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii
Lecomte).
4
- Nghiên cứu chiết tách các chất, đặc biệt là các triterpene khung lupane có
hàm lượng cao từ Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.Merr.) để
làm nguyên liệu cho quá trình chuyển hóa.
- Tổng hợp các dẫn xuất từ các triterpene phân lập được.
- Khảo sát hoạt tính sinh học như khả năng kháng chủng Bacillus subtilis,
khả năng gây độc với một số dòng tế bào ung thư, khả năng chống oxi hóa
của các dịch chiết và các chất phân lập được làm cơ sở khoa học định hướng
cho việc nghiên cứu ứng dụng các hợp chất này trong công nghệ hóa dược.
I.3. Những đóng góp mới của luận án
- Đây là lần đầu tiên loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) được
nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học) ở Việt Nam.
- Từ rễ Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) đã phân lập và xác
định được cấu trúc của 7 hợp chất, trong đó 2 chất Galangin (PK4),
Isolariciresinol (PK7) lần đầu phân lập từ loài này.
- Từ thân và lá của loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus
(L.) Merr.) đã phân lập và xác định cấu trúc của một hợp chất mới là
11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3).
- Bằng các phản ứng chuyển hóa ở các vị trí khác nhau đã tổng hợp
được 23 dẫn xuất mới từ 2 hợp chất có hàm lượng lớn AT1 và AT2
phân lập được từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.)
Merr.).
- Đây là kết quả mới về hoạt tính gây độc tế bào, kháng chủng Bacillus
subtilis và chống oxi hóa của một số dịch chiết, hợp chất phân lập và
tổng hợp được từ hai loài nghiên cứu. Đặc biệt, dẫn xuất N-[24-nor3α,11α-diacetoxy-lup-20(29)-ene-28-oyl]-1,9-diaminononane (AT22) có
hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh trên các dòng tế bào ung thư biểu mô
(KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7) với
IC50 = 3,65 ÷ 4,42µg/ml.
5
I.4. Bố cục của luận án
Luận án gồm 144 trang với 4 chương, 20 sơ đồ, 21 bảng, 48 hình, 100
tài liệu tham khảo và phụ lục.
Luận án được bố cục như sau: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan
tài liệu (29 trang); Chương 2: Nguyên liệu, hóa chất và phương pháp
nghiên cứu (7 trang); Chương 3: Thực nghiệm (25 trang); Chương 4: Kết
quả và thảo luận (58 trang); Bảng tổng hợp các hợp chất phân lập và
chuyển hóa hóa học từ 2 loài nghiên cứu (6 trang); Kết luận và kiến nghị
(2 trang); Danh mục các công trình khoa học đã công bố trong khuôn khổ
luận án (2 trang); Những đóng góp mới của luận án bằng tiếng Anh (1
trang); Tài liệu tham khảo (12 trang). Ngoài ra còn có 59 trang phần Phụ
lục với các hình phổ và kết quả hoạt tính sinh học.
II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN
MỞ ĐẦU: Đề cập tính cần thiết, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận
án.
Chương 1. TỔNG QUAN
Phần Tổng quan tài liệu tập hợp và phân tích các nghiên cứu trong
nước và quốc tế về các vấn đề liên quan đến nội dung luận án:
• Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về loài Thông lá dẹt
(Pinus krempfii Lecomte) và Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus
L.Merr.)
• Các hợp chất flavonoid.
• Các hợp chất triterpene khung lupane.
• Chuyển hóa hóa học hợp chất triterpene khung lupane và hoạt tính
sinh học của chúng.
Chương 2: NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
Mẫu rễ Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte) được thu hái tại tỉnh
Lâm Đồng, Việt Nam vào tháng 8 năm 2012. Tên khoa học do TS. Nguyễn
6
Tiến Hiệp xác định và Tiêu bản số CPC-4711 được lưu giữ tại Bảo tàng
Thiên nhiên Việt Nam, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Mẫu cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.)
được thu hái ở Mai Châu, Tỉnh Hòa Bình, Việt Nam vào tháng 10 năm
2009. Tên khoa học do CN. Ngô Văn Trại, Viện Dược liệu, Bộ Y tế xác
định. Tiêu bản được lưu giữ tại Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hóa chất và thiết bị được liệt kê đầy đủ trong luận án.
2.2.Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp chiết tách: Các phương pháp nghiên cứu chủ yếu
gồm: chiết ở nhiệt độ phòng, chiết phân lớp, sắc ký lớp mỏng, sắc ký
cột...
Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất: Cấu trúc
của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp giữa các phương pháp
phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS),
phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-, 13C-NMR, DEPT) và hai
chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY …).
Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học:
* Hoạt tính gây độc tế bào: các dòng tế bào ung thư ở người được cung
cấp bởi ATCC, gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2),
ung thư phổi (Lu), ung thư vú (MCF7).
* Hoạt tính kháng chủng Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633.
* Hoạt tính chống oxi hóa: Thực hiện theo phương pháp DPPH.
Chương 3: THỰC NGHIỆM
Trình bày về cách phân lập, tổng hợp và liệt kê tính chất, hằng số
vật lý như tính tan, điểm nóng chảy (đnc), năng suất quay cực ([α]D)…,
số liệu phổ của các chất thu được từ hai đối tượng nghiên cứu.
3.1. Loài Thông lá dẹt
Đã tiến hành xác định thành phần của cặn chiết n-hexane bằng
phương pháp GC-MS.
7
Đã phân lập được 7 hợp chất (PK1-PK7) từ hai cặn chiết ethyl
acetate và n-butanol.
3.2. Loài Ngũ gia bì hương
Đã phân lập được 3 hợp chất (AT1-AT3) từ cặn chiết
dichloromethane, trong đó AT1, AT2 thu được với hàm lượng tương đối
cao.
Từ hai hợp chất AT1, AT2 đã chuyển hóa hóa học được 23 dẫn xuất
mới.
Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và hoạt tính gây độc tế
bào các cặn chiết và một số chất phân lập được.
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả từ loài Thông lá dẹt (Pinus krempfii Lecomte)
4.1.1. Thành phần hóa học của cặn n-hexane
Cặn chiết n-hexane thu được từ rễ loài Thông lá dẹt chiếm 0,27%
(so với lượng mẫu rễ khô), có đặc điểm sánh, trong và màu vàng nhạt, có
mùi đặc trưng của tinh dầu thông. Khảo sát sơ bộ bằng sắc ký lớp mỏng
cho thấy cặn chiết n-hexane chủ yếu là chất kém phân cực, vì vậy cặn
chiết này được tập trung xác định thành phần hóa học bằng phương pháp
sắc ký khí gắn khối phổ (GC-MS) và cho kết quả ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của
cặn chiết n-hexane bằng phương pháp GC-MS
TT
Hợp chất
Thời gian lưu Hàm lượng
(RT, phút)
(%)
1 α-terpineol
13,332
1,02
2
3
1-tert-butyl-1,5-cyclooctadiene
α-amorphene
20,038
20,839
0,23
0,22
4
5
δ-cadiene
Nerolidol
21,962
22,871
0,28
13,79
6
7
α-copaene
Farnesol
24,839
22,022
1,10
0,50
8
8
9
10
11
12
13
14
15
(E,E)-α-farnesene
α-bisabolol
Caryophylla-2(12),6(13)-dien-5-one
(+)α-atlantone
Todomatuic acid
Trans-Octadec-9-enoic acid
Octadecanoic acid
O-(3,5-dimethoxyphenyl)-2phenylethene
25,354
25,640
26,310
27,580
33,079
34,486
34,875
36,260
1,08
0,63
0,32
2,31
4,10
0,98
0,43
8,18
Theo số liệu ở Bảng 4.1, từ cặn chiết n-hexane đã xác định được 15
hợp chất, trong đó có mặt của α-terpineol (1,02%), một hợp chất đặc
trưng của tinh dầu thông và chất thơm như nerolidol (13,79%).
4.1.2. Các chất phân lập được từ cặn ethyl acetate
Từ cặn chiết EtOAc, đã phân lập được 6 chất PK1-PK6 sạch. Cả
sáu chất này đều hấp thụ ánh sáng dưới đèn tử ngoại (254nm) và hiện
màu vàng hoặc đỏ với thuốc thử Vanilin/H2SO4 khi hơ nóng và được dự
đoán là các hợp chất flavonoid. Bằng các phương pháp phổ (cộng hưởng
từ hạt nhân, phổ khối, phổ hồng ngoại) và so sánh với các số liệu đã
công bố 6 hợp chất phân lập được từ loài Thông lá dẹt được xác định là:
Tectochrysin (PK1), Pinostrobin (PK2), Pinobanksin (PK3), Galangin
(PK4), Strobopinin (PK5), Cryptostrobin (PK6).
3'
2'
O
8
9
7
A
6
5
O
1
C
10
OH
4
3'
4'
2'
B
2
5'
1'
6'
O
8
9 O
A
C
7
3
1
6
5
O
10
OH
4
B
2
3
1'
9
A
6
5
OH
1
10
4
O
PK4
9 O
A
C
1
6
5
10
OH
2
6'
OH
8
HO
9
7
6
A
5
OH
O
1
C
10
4
2
3
B
1'
6'
OH
O
3'
4'
5'
1'
6'
2'
8
HO
7
6
PK5
9
A
5
O
4'
5'
3
3'
5'
1'
3
4
2
B
PK3
2'
4'
B
O
C
8
7
6'
3'
8
HO
PK2
2'
7
5'
O
PK1
HO
3'
2'
4'
OH
O
1
C
10
4
4'
B
2
3
O
PK6
5'
1'
6'
9
4.1.3. Chất phân lập được từ cặn n-butanol
Từ cặn n-butanol đã phân lập được chất Isolariciresinol (PK7).
Hợp chất PK7 dạng chất rắn màu trắng đã phân lập được từ cặn
chiết n-BuOH. Kết hợp dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR và pic ion phân tử ở m/z
383,1470 [M+Na]+ (tính toán cho công thức C20H24O6 Na+ là 383,1465) ở phổ
khối phân giải cao (HR-ESI-MS), đã xác định được công thức phân tử của
chất PK7 là C20H24O6.
3'
HO
1'
8'
B
4'
5'
9'
7'
2'
O
OH
C
7
6'
8
OH
9
1
2
6
A
5
3
4
O
OH
PK7
13
Phổ C-NMR và DEPT cho thấy chất PK7 có tín hiệu của 20
nguyên tử cacbon, bao gồm 7 cacbon bậc 4 (7xCq) trong đó có bốn
cacbon bậc 4 nối với oxy (oxy-quartenary carbon, δC 145,1 - 148,9 ppm);
8 nhóm methine (8xCH) trong đó có 5 nhóm methine của vòng thơm (δC
112,3 - 123,1); 3 nhóm methylene (3xCH2), trong đó có 2 nhóm
oxymethylene (δC 62,3; 66,0 ppm); 1 tín hiệu có cường độ lớn gấp đôi
của 2 nhóm methoxy (δC 56,36 ppm, 2xC). Phổ 1H-NMR của PK7 phù
hợp với số liệu phổ 13C-NMR và DEPT. Sự xuất hiện các tín hiệu proton
ở δH 6,68 (1H, br s, H-2) và hai proton có tương tác ortho ở δH 6,76 (1H,
d, J = 8,0, H-5) 6,63 (1H, d, J = 8,0, H-6) cho thấy chất này có chứa vòng
thơm bị thế ở C-1, C-3 và C-4. Ngoài ra, hai singlet ở δH 6,22 (1H, s, H-5’) và
6,66 (1H, s, H-2’) cho biết vòng B bị thế ở bốn vị trí C-1’, C-3’, C-4’ và C-6’.
Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy hợp chất này có những dữ liệu phổ đặc
trưng của lớp chất lignan có vòng thơm gắn tại C-7.
Vị trí chính xác của các nhóm hydroxyl methylene, methoxy được
xác định qua tương tác ở phổ HMBC. Dựa vào sự tương tác mạnh của H7’với C-9’; H-8’ với C-9’ và H-7 với C-9; H-8 với C-9 cho thấy có một
nhóm hydroxyl methylene gắn vào C-8’; nhóm thứ hai gắn với C-8. Hai
10
nhóm methoxy được xác định ở vị trí C-3 và C-3’ dựa trên sự tương tác
proton của nhóm methoxy với C-3 và C-3’. Bên cạnh đấy, có thể khẳng
định vòng A gắn với vòng C tại C-7 thông qua tương tác của H-2 với C7; H-6 với C-7. (Hình 4.1).
H
2
2'
O
3'
4'
5'
H
OH
8
H
6'
9'
8'
C
B
HO
H
1' 7'
OH
H
7
1
6
9
2 H
A
5
4
3
O
OH
Hình 4.1. Một số tương tác chính trong phổ HMBC của chất PK7
Cấu hình tương đối của các trung tâm bất đối (C*) được xác định
dựa vào hằng số tương tác trong phổ 1H-NMR và dữ liệu phổ NOESY.
Tương tác của H-7’β/H2-9’ và H-8/ H2-9’ trên phổ NOESY cho thấy
nhóm hydroxyl methyl ở C-8’ có cấu hình β. Tương tác của H-7/ H-8’
cũng cho thấy nhân thơm gắn với C-7 có cấu hình β. Điều này được
khẳng định thêm qua độ chuyển dịch khác nhau của C-7 (∆δC -1,67 ppm)
so với cấu hình α của đồng phân PK7a (Bảng 4.2). Bên cạnh tương tác
H-2/H-8 ở phổ NOESY thì tín hiệu doublet của H-7 (δH 3,79 d) và H-8
(δH 1,79 tt) trên phổ 1H-NMR cho cùng một hằng số tương tác lớn (J =
11 Hz ), cho thấy hai proton này ở khác phía đối với nhau, và khẳng định
được nhóm methylene ở C-8 có cấu hình α.
H
2'
O
3'
HO
H
7'
5'
H
9'
8'
B
4'
H2
H
1'
H
6'
8
9
H
7
1
6
2 H
OH
2'
O
9'
7'
1'
8'
OH
3'
OH
HO
4'
6'
7
OH
8
9
5'
1
2
6
A
5
4
OH
3
5
O
3
4
O
OH
Hình 4.2. Một số tương tác chính
Hình 4.3. Chất burselignan
trong phổ NOESY của chất PK7
(PK7a)
Dữ liệu phổ của chất PK7 hoàn toàn phù hợp với phổ của
11
isolariciresinol ở từng vị trí tương ứng và chất này được xác định chính
là isolariciresinol (Bảng 4.2). Gần đây isolariciresinol và một đồng phân
lập thể của nó là burselignan (PK7a) cùng được tìm thấy từ loài Bursela
tonkinensis của Việt Nam.
Bảng 4.2. Số liệu phổ 1H, 13C-NMR của PK7,
(+)-Isolariciresinol và Burselignan
Vị
trí
1
2
3
4
5
6
7α
7β
8
9α
9β
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7’α
7’β
PK7
δHa,b
6,68 br s
6,76 d(8,0)
6,63 d(8,0)
3,8d d (11)
1,79 tt(3,7;11)
3,42 dd(4;11)
3,66 m
6,66 s
6,22 s
2,78 d(7,5),1H
2,79 d(7,5),1H
8'
9'
3OMe
3'OMe
δCa,c
138,5
113,8
148,9
145,7
115,9
123,1
48,1*
48,1*
62,3
128,9
112,3
147,0
145,1
117,3
134,0
(+)-Isolariciresinol
δH#
δC#
138,6
6,66 d(1,8)
113,8
149,0
145,9
6,73 d(8,0)
115,9
6,60 dd(1,8;8)
123,2
3,79 d(10,7)
48,1
1,75 tt(3,9;10)
3,38 dd(3,9;11)
3,65 dd(4,5;11)
6,64 s
6,17 s
33,6
2,07 m
3,38 dd(6,7;10,6)
3,53 dd(6,0;10,4)
6,71 s
6,36 s
2,65 dd(9,3;16,7),1H
2,96 dd(4,3;16,7),1H
129,0
112,4
147,2
145,3
117,3
134,2
2,77 d(7,7)
33,5
δC#
135,9
115,2
148,2
145,8
115,4
124,0
46,5
44,7
63,4
128,4
112,3
147,8
145,5
117,0
133,0
33,1
2,01 m
3,70 m
40,0
66,0
1,99 m
3,66 m
40,0
65,9
2,07 m
3,58 dd(4,6; 7)
35,5
65,8
3,81 s
56,36*
3,76 s
56,3
3,76 s*
56,3
3,78 s
56,39*
3,79 s
56,4
3,84 s*
56,3
Tín hiệu có thể trao đổi trong cùng một cột
Đo trong CD3OD, b500 MHz, c125 MHz
#
Số liệu phổ của isolariciresinol và burselignan đo trong CD3OD
*
a
48,0
62,2
Burselignan
δH#
6,70 d(1,7)
6,66 d(8,1)
6,46 dd(1,7; 8,1)
4,21 d(3,2)
12
Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của chất PK7 (500 MHz, CD3OD)
Hình 4.4. Phổ 3H-NMR và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD)
Hình 4.5. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất PK7 (125 MHz, CD3OD)
13
***Nhận xét về thành phần hóa học loài Thông Lá dẹt
Đây là lần đầu tiên ở Việt Nam và là lần thứ hai trên thế giới (lần
đầu từ năm 1966), thành phần hóa học của loài Thông lá dẹt (Pinus
krempfii Lecomte) được công bố. Kết quả của luận án cho thấy loài
Thông lá dẹt có chứa nhiều flavonoid, lớp chất thường được tìm thấy ở
chi này. Ngoài 6 flavonoid, một hợp chất lignan là isolariciresinol đã
được phân lập và xác định. Trong 7 hợp chất phân lập được, galangin và
isolariciresinol là hai hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ loài này.
Theo tài liệu năm 1966, một số chất chỉ được nhận dạng qua sắc ký
khí gắn khối phổ (GC-MS) và phổ 1H-NMR, do vậy rất có thể chúng có
hàm lượng rất bé không thu nhận được trong quá trình chiết, tách - điều
này giải thích nguyên nhân vì sao so với công bố năm 1966, một vài hợp
chất đã không được nhận dạng.
Theo như nhiều tài liệu đã công bố, các hợp chất flavonoid có nhiều
hoạt tính sinh học quý báu và hoạt tính chống oxi hóa là một hoạt tính
đặc trưng của lớp chất này. Kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy hai chất
pinostrobin và tectochrysin đều có khả năng ức chế tế bào ung thư vú,
còn hai hợp chất strobopinin và crytostrobin có hoạt tính chống lại các vi
khuẩn Staphylococcus aureus (ATCC 25923) và aeruginosa (ATCC
27853). Với hai hợp chất lần đầu phân lập được từ loài này, galangin
ngoài khả năng kháng khuẩn tốt còn có khả năng ức chế lại enzyme oxi
hóa khử thuộc nhóm polyphenol oxidase (OPD) và isolariciresinol có
khả năng chống oxi hóa rất mạnh, thậm chí còn cao hơn cả vitamin E và
butylated hydroxytoluene (BHT). Ở nồng độ 2,5 μg/ml, nếu Vitamin E
chỉ ức chế được 18,7% zymosan, hợp chất kích hoạt polymorphonuclear
leukocytes (PMNL) để tạo ra oxy gốc tự do, thì hợp chất isolariciresinol
có thể ức chế lên đến 23,8%.
14
4.2. Kết quả từ loài Ngũ gia bì hương (Acanthopanax trifoliatus L.
Merr.)
4.2.1. Các hợp chất được phân lập và xác định từ loài Ngũ gia bì
hương
Từ dịch chiết dichloromethane của thân và lá cây Ngũ gia bì hương,
đã phân lập và xác định được ba hợp chất triterpene acid khung lupane:
24-nor-11α-hydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT1); 24-nor3α,11α-dihydroxy-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT2); 11α,23-dihydroxy3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid (AT3).
30
30
30
20
29
29
12
11 26
9
1
2
10
3
O
4
23
5
19 21
22
H
HO
25
H
6
13
14
18
17
16
25
COOH
1
2
27
10
3
HO
AT1
12
11 26
9
4
23
5
H
13
14
18
15
17
16
25
28
COOH
7
2
10
3
27
6
AT2
12
11 26
9
1
8
O
HO
4
23
5
24
19 21
22
H
HO
19 21
22
H
HO
28
15
8
7
29
20
20
H
13
14
17
16
28
COOH
15
8
7
18
27
6
AT3
Hợp chất AT3 phân lập được có dạng bột màu trắng. Công thức
phân tử của AT3 là C30H46O5 được xác định nhờ pic ion phân tử tại m/z
487,3424 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C30H47O5 là
487,3423) ở phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS..Phổ hồng ngoại cho
đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl tại νmax 3447cm-1, nhóm
carbonyl tại νmax 1695cm-1 và nhóm C=C ở νmax 1642cm-1 và 891cm-1.
Phổ 1H-NMR của AT3 cho thấy sự xuất hiện của 2 proton olefinic ở
δH 4,65 (1H, br s, H-29A), δH 4,79 (1H, br s, H-29B), hai doublet của
nhóm oxymethylene tại δH 3,51 và 3,42 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 10,5);
một nhóm oxymethine ở δH 3,86 (1H, dt, J = 11,0 và 5,0 Hz) và 5
singlet của năm nhóm methyl ở δH 0,95; 1,04; 1,09; 1,10; 1,75 ppm. Phổ
13
C và DEPT cho thấy trong phân tử có 30 cacbon, bao gồm một nhóm
ketone tại δC 220,9; một nhóm cacboxylic acid ở δC 179,8; một liên kết
đôi ở δC151,5 và 110,6; một nhóm hydroxymethine tại δC 71,1; một
nhóm hydroxymethylene tại δC 68,5; 5 tín hiệu của nhóm methyl tại
15
δC14,8; 17,2; 17,3; 17,4; 19,7 ppm; chín nhóm methylene, năm nhóm
methine và năm cacbon bậc bốn. Từ các dữ liệu phổ ở trên cho thấy hợp
chất AT3 là một triterpene acid khung lupane.
Bảng 4.3. Số liệu phổ 1H-, 13C-NMR của AT3 (CD3OD, 500/125MHz)
δC
Vị trí
δH
δC
Vị trí
δH
1
2,39 (m, 1H) 37,2
16
1,48 (m, 1H)
33,3
2,47 (m, 1H)
2,29 (m, 1H)
2
1,68 (m, 1H) 41,8
17
57,4
2,78 (m, 1H)
3
220,9
18
1,72 (m, 1H)
50,0
4
54,0
19
3,08
48,2
(dt, J = 10,5;4,5,1H)
5
2,04 (m, 1H) 48,5
20
151,5
6
1,45 (m, 2H) 20,6
21
1,54 (m,1H)
37,9
1,95 (m, 1H)
7
1,47 (m, 1H) 31,7
22
1,52 (m, 2H)
35,1
1,98 (m, 1H)
68,5
8
43,4
23
3,42;3,51
(dAB, J = 10,5, 2H)
9
1,64 (d, J =
55,5
24
0,95 (s, 3H)
17,4
11,0, 1H)
10
39,1
25
1,04 (s, 3H)
17,3
11
3,86 (dt, J = 71,1
26
1,10 (s, 3H)
17,2
11,0;5,0, 1H)
12
1,32 (m, 1H) 38,3
27
1,09 (s, 3H)
14,8
2,02 (m, 1H)
13
2,53 (m, 1H) 38,6
28
179,8
14
43,4
29
4,65 (br s, 1H)
110,6
4,79 (br s, 1H)
15
1,25 (m,1H)
30,8
30
1,75 (s, 3H)
19,7
1,47 (m,1H)
Vị trí của các nhóm hydroxyl và cacboxylic acid được xác định dựa
vào phổ 2D-NMR như HSQC, HMBC, H-H COSY và so sánh với tài
16
liệu. Một nhóm hydroxyl được gắn ở C-11 dựa vào tương tác của H-11
(δH 3,86) với H-9 (δH 1,64) và H-12 (δH 1,32 và 2,02) trên phổ H-H
COSY. Hằng số tương tác của H-9 với H-11 là J11,9 = Jax,ax = 11,0 Hz,
cho thấy nhóm hydroxyl này có cấu hình α. Phổ HMBC của AT3 xuất
hiện tương tác giữa proton của nhóm hydroxymethylene (δH 3,41 và
3,51) với C-3 (δC 220,9), C-4 (δC 54,0), C-5 (δC 48,5) và nhóm methyl tại
vị trí C-4 (δC 17,4). Từ các dữ liệu phổ này, cho phép dự đoán nhóm
hydroxymethylene có thể gắn vào vị trí C-23 hoặc C-24. So sánh độ dịch
chuyển hóa học của cacbon hydroxymethylene và nhóm methyl của AT3
(δC 67,1; 17,0) với 23-hydroxy-3-oxo-urs-12-ene-28-oic (δC 67,0; 17,2)
(đo trong cùng dung môi CDCl3) thấy hoàn toàn đồng nhất (đối với hợp
chất: 24-hydroxy betulone (δC là 65,3 và 22,1). Điều này cho phép khẳng
định nhóm hydroxyl ở C-23 của AT3. Vị trí của nhóm cacboxylic acid
được xác định là ở vị trí C-17 dựa vào sự tương tác của C-28 (δC 179,8)
với H-16 (δH 2,29), H-18 (δH 1,72), H-22 (δH 1,52); và C-17 (δC 57,4) với
H-15 (δH 1, 52), H-16 (δH 2,29) trên phổ HMBC (Hình 4.6).
30
20
29
H
HO
H2 25
H2
1
2
10
3
O
HO
4
24
23
H2
5
12
11 26
9
H
6
H 19 21
13
14
8
7
22
17
18
H2
16
15
H2
COOH
28
H2
27
COSY
HMBC
Hình 4.6. Các tương tác chính trên phổ COSY, HMBC của chất AT3
Từ các dữ liệu phổ đã phân tích ở trên, cấu trúc của chất AT3 được
xác định là 11α,23-dihydroxy-3-oxo-lup-20(29)-ene-28-oic acid. Đây là
một hợp chất mới, lần đầu tiên được phân lập và xác định cấu trúc.
17
Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của chất AT3 (500 MHz, CD3OD)
Hình 4.8. Phổ 13C-NMR và DEPT của chất AT3 (125 MHz, CD3OD)
*** Nhận xét về thành phần hóa học của loài Ngũ gia bì hương
Ba hợp chất AT1, AT2 và AT3 phân lập được từ loài Ngũ gia bì
hương đều thuộc nhóm chất triterpene khung lupane, trong đó AT1 và
AT2 đã được nhóm nghiên cứu Ph.D.Ty phân lập được từ năm 1985, và
AT3 là một chất mới. Hai chất AT1 và AT2 đều có hàm lượng khá cao
(0,26% và 0,25% so với mẫu khô), vì vậy luận án đã sử dụng 2 chất này
làm nguyên liệu đầu để tổng hợp các dẫn xuất mới và nghiên cứu hoạt
tính sinh học của chúng
18
4.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của hợp chất AT1, AT2
Với mục tiêu nghiên cứu tổng hợp tìm kiếm hoạt chất mới, từ ba
hợp chất phân lập được (AT1, AT2, AT3) đã tổng hợp được 23 dẫn xuất
mới. Các dẫn xuất này được khảo sát hoạt tính nhằm tìm ra chất có hoạt tính
cao hướng đến nghiên cứu ứng dụng.
* Tổng hợp dẫn xuất của chất AT1
H
RO
COOH
H
AT5 R = -COC6H4COOH (65%)
AT6 R = -CO(CH2)3COOH (67%)
AT7 R = -COC2H4COOH (65%)
O
acid anhydride,4- DMAP, pyridine
600C,8h
H
HO
H
H3COCO
H3COCO
COOH
(CH3CO)2O, pyridine
rt, 24h
O
2. R1NH2, TEA, CH2Cl2
rt, 24h
O
AT1
H
1. (COCl)2, CH2Cl2
rt, 48h
COOH
CONHR1
O
AT4 (85%)
CrO3, H2SO4/acetone
rt, 4h
(CH 3CO)2O, pyridine
AT9
AT10
AT11
AT12
R1 = (CH2)10COOCH3 (85%)
R1 = (CH2)4CHCH3NH2 (68%)
R1 = (CH2)9NH2 (72%)
R1 = (CH2)3OH (67%)
rt, 24h
AT13 R1 = (CH2)3OCOCH3 (87%)
H
O
H
O
COOH 1. (COCl)2, CH2Cl2
rt, 48h
CONH(CH2) 7NH2
H
H
O
AT8 (67%)
2. NH2(CH2)7NH2, TEA, CH2Cl2
rt, 24h
O
AT14
anhydride, pyridine, 4-DMAP
rt,12h
H
O
CONH(CH2) 7NHR2
H
O
AT15 R2 = COCH3 (52%)
AT16 R2 = CO(CH2)2COOH (58%)
AT17 R2 = COC6H8COOH (55%)
Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất của AT1
19
Các dẫn xuất của AT1 được tổng hợp theo Sơ đồ 4.1. Nhóm
hydroxyl ở vị trí của C-11 được thực hiện phản ứng acyl hóa với các acetic,
phthalic, glutaric và succinic anhydride trong pyridine tạo các ester AT4,
AT5, AT6, AT7 với hiệu suất tương ứng là 85%, 65%, 67%, 65%. Dẫn
xuất acetoxy AT4 được chuyển về dạng chlorua acid nhờ phản ứng với
oxalylchlorid trong dichlomethan ở nhiệt độ phòng. Cất loại dichlomethan
và oxalylchlorid còn dư, thu được hợp chất acyl chlorid tương ứng. Chất này
không cần làm sạch mà dùng ngay cho phản ứng tiếp theo. Sau đó, cho tác
dụng với với các amine: methyl 11-aminoundecanoate, 1,5-diamino
hexane, 1,9-diaminononane hoặc 3-amino-1-propanol với sự có mặt của
triethylamine trong dichloromethane tạo các amide AT9- AT12 (hiệu suất
tương ứng: 85%, 68%, 72% và 67%). Acetyl hóa dẫn xuất AT12 với acetic
anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng cho sản phẩm diacetyl AT13 với
hiệu suất (87%).
Để nhận được các dẫn xuất amide khác của AT1, một cách khác đã
được thực hiện. Oxi hóa AT1 bằng tác nhân Jones CrO3/H2SO4 thu được
hợp chất diketone AT8 với hiệu suất 67%. Nhóm COOH ở vị trí C-17 của
AT8 được tác dụng với oxalylchloride, sau đó với diamine (NH2(CH2)7NH2)
trong môi trường kiềm để tạo amide AT14. Chất này không cần làm sạch
mà thực hiện phản ứng ngưng tụ với các acetic, succinic hoặc 1,2,3,6tetrahydrophthalic anhydride dưới sự có mặt của 4-DMAP trong pyridine
cho sản phẩm tương ứng AT15, AT16, AT17 với hiệu suất là 52%, 58%,
55%.
* Tổng hợp các dẫn xuất của AT2
Tương tự như quá trình tổng hợp các dẫn xuất của AT1, các dẫn
xuất của AT2 được tổng hợp theo Sơ đồ 4.2. Đầu tiên, chất AT2 được acyl
hóa với acetic anhydride trong pyridine ở nhiệt độ phòng tạo dẫn xuất
diacetyl AT18 với hiệu suất 86%. Dẫn xuất AT18 tiếp tục được chuyển hóa
thành acyl chloride, sau đó thực hiện phản ứng amide hóa với dung dịch
NH3 hoặc methyl 11-aminoundecanoate, 1,5-diamino hexane, 1,9diaminononane hoặc 3-amino-1-propanol tạo các amide AT19- AT23 (hiệu
20
suất tương ứng: 78%, 75%, 68% và 72%). Acetyl hóa nhóm ancol bậc một
của AT23 với acetic anhydride thu được sản phẩm AT24 với hiệu suất 87%.
Thủy phân AT19, AT20 bằng dung dịch NaOH 4N trong hỗn hợp
dung môi THF/MeOH (1:1) ở nhiệt độ phòng thu được hai dẫn xuất AT25
(74%), AT26 (78%).
H
HO
H
H 3C OCO
COOH
COOH
(C H3 C O) 2 O, pyr id in e
rt, 24h
H
H
H 3 COCO
HO
AT 2
AT 18 (86%)
1. ( CO C l) 2 , CH 2 Cl 2
r t, 48h
2. R 1 N H 2 , TEA, CH 2C l 2
r t, 24h
H
HO
H
H3C OCO
CONHR 2
N aO H 4N , THF/MeO H (1:1)
CON HR1
r t, 12h
H
H
H3 COCO
HO
AT 25 R 2 = H (74%)
AT 26 R 2 = (CH 2) 10 COOH (7 8%)
AT19
AT20
AT21
AT22
AT23
( CH 3 CO )2 O, pyr idine
rt, 24h
R1 =
R1 =
R1 =
R1 =
R1 =
H (78 %)
(C H2 )1 0COOCH 3 (75%)
(C H2 )4 CHCH 3NH 2 (68%)
(C H2 )9 NH2 (6 5%)
(C H2 )3 OH (7 2%)
AT24 R 1 = (C H2 )3 OC OC H3 (87 %)
H
H3 COCO
H
H 3C OCO
C ONH 2
CN
CH 3 CO Cl, 4- DMA P, C H2 C l 2
rt, 1 5 phut
H
H
H 3COC O
H 3 COCO
AT19
AT27 (7 8%)
Sơ đồ 4.2. Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất của AT2
Bên cạnh đó, dẫn xuất amide AT19 còn có thể bị dehydrat hóa
- Xem thêm -