Tài liệu Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời yeallow head virus(yhv), taura syndrome virus(tsv) và gill-associated virus(gav) trên tôm bằng kỹ thuật multiplex reverse transcription polymerase chain reaction

  • Số trang: 59 |
  • Loại file: PDF |
  • Lượt xem: 113 |
  • Lượt tải: 0

Mô tả:

1 LỜI CẢM ƠN Con xin cám ơn bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên con. Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Viện CNSH& MT trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu trong những năm qua. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài. Tôi xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Hải Thanh - Viện CNSH&MT Đại học Nha Trang, anh Nguyễn Trọng Hiếu công ty CPCN Việt Á, đã hướng dẫn tôi tận tình trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị phòng R&D và phòng Dịch vụ công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi về mặt tài liệu và thực nghiệm để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài. Ngoài ra, tôi cũng xin được cảm ơn tất cả những người đã chia sẻ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành Trang 2 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN....................................................................................................................... 1 MỤC LỤC ............................................................................................................................ 2 DANH MỤC CÁC BẢNG ................................................................................................... 5 DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................................... 6 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................. 8 1.1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới........................................................ 11 1.1.2. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam ....................................................... 12 1.2. Tác nhân gây bệnh ...................................................................................................... 13 1.2.1. Yellow head virus (YHV) .......................................................................................... 13 1.2.1.1. Hình thái cấu trúc.................................................................................................... 13 1.2.1.2. Cách thức lan truyền ............................................................................................... 13 1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý ..................................................................................................... 14 1.2.2. Taura syndrome virus (TSV) .................................................................................... 15 1.2.2.1. Hình thái cấu trúc.................................................................................................... 15 1.2.2.2. Cách thức lan truyền ............................................................................................... 16 1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý ..................................................................................................... 16 1.2.3.1. Hình thái cấu trúc.................................................................................................... 17 1.2.3.2. Cách thức lan truyền ............................................................................................... 17 1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý ..................................................................................................... 17 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh ............................................................................. 18 1.3.1. Phương pháp mô bệnh học ...................................................................................... 18 1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ...................................................... 20 1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử ................................................................................ 20 1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) ....... 20 3 1.3.3.3. Các thành phần trong phản ứng PCR...................................................................... 23 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 27 2.1. Vật liệu ......................................................................................................................... 27 2.1.1. Chủng virus ............................................................................................................... 27 2.1.2. Mẫu thí nghiệm ......................................................................................................... 27 2.1.3. Mồi cho phản ứng..................................................................................................... 27 2.1.4. Hóa chất tách chiết RNA .......................................................................................... 28 2.1.5. Hóa chất cho phản ứng RT ...................................................................................... 28 2.1.6. Hóa chất cho phản ứng PCR ................................................................................... 28 2.1.7. Hóa chất cho điện di ................................................................................................. 28 2.1.8. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................................ 29 2.2. PHUƠNG PHÁP ......................................................................................................... 30 2.2.1. Chuẩn bị mẫu............................................................................................................ 30 2.2.2. Tách chiết RNA ......................................................................................................... 30 2.2.2.1. Nguyên tắc .............................................................................................................. 30 2.2.2.2. Tiến hành ................................................................................................................ 30 2.2.3. Phản ứng RT ............................................................................................................. 31 2.2.3.1. Nguyên tắc .............................................................................................................. 31 2.2.3.2. Tiến hành ................................................................................................................ 31 2.2.4. Khuếch đại bằng phản ứng PCR ............................................................................. 31 2.2.4.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 31 2.2.4.2. Tiến hành ................................................................................................................ 32 1. Thành phần phản ứng PCR .............................................................................................. 32 2.2.5. Điện di trên gel agarose ...................................................................................... 32 2.2.5.1. Nguyên tắc ........................................................................................................... 32 4 2.2.5.2. Tiến hành ................................................................................................................ 32 1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu ............................................................................... 32 2.2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lý thuyết ......................................................... 33 2.2.6.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi..................................................................................... 33 2.2.6.2. Phương pháp đánh giá mồi. .................................................................................... 33 2.2.7. Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi. ................................................ 33 2.2.8. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của qui trình ....................................................... 34 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................... 35 Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời Yellow head virus(YHV), Taura syndrome virus (TSV), và Gill-associated virus (GAV)Error! Bookmark not defined. 3.1. Kết quả khảo sát các đặc tính của mồi ..................................................................... 35 3.2. Khảo sát độ đặc hiệu và khả năng nhân bản của mồi của mồi trên lý thuyết. ...... 39 3.3. Kết quả xây dựng qui trình Multiplex RT- PCR bằng thực nghiệm ..................... 45 3.3.1. Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer ......................................................... 45 3.3.2. Khảo sát tỉ lệ nồng độ giữa ba cặp mồi .............................................................. 47 3.3.3. Khảo sát nhiệt độ lai(Ta) cho 3 cặp mồi. ................................................................. 48 3.3.3. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu cho ba cặp mồi .................................................... 49 3.3.4. Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi............................................................ 51 3.3.5. Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh. ................................ 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................................................... 56 1. Kết luận ........................................................................................................................... 56 2. Đề nghị ............................................................................................................................ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 57 5 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1: Trình tự các mồi .................................................................................................. 27 Bảng 2: Kích thƣớc của thang DNA 100bp ..................................................................... 29 Bảng 3: Khảo sát đặc tính của mồi ................................................................................... 35 6 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV ............................................................ 14 Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV. ..................................................................... 15 Hình 3: Hội chứng Taura .................................................................................................. 16 Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR ....................................................................... 22 Hình 5 : Các dạng cấu trúc self-dimer của các mồi ...................................................... 36 Hình 6: Các dạng cấu trúc hetrodimer của các mồi ...................................................... 38 Hình 7: Khảo sát mồi YHVf trên BLAST...................................................................... 39 Hình 8: Khảo sát độ dặc hiệu của mồi YHVr ................................................................ 40 Hình 9: Khảo sát độ dặc hiệu trên BLAST của GAVf ................................................. 40 Hinh 10: Khảo sát độ đặc hiệu của mồi GAVr trên BLAST ....................................... 41 Hình 11: Khảo sát dộ đặc hiệu của mồi TSVf trên BLAST ........................................ 41 Hình 12: Khảo sát độ đặc hiệu của TSVr trên BLAST ................................................ 42 Hình 13: Kết quả sắp gióng mồi YHVf .......................................................................... 42 Hình 14: Kết quả sắp gióng của mồi YHVr ................................................................... 43 Hình 15: Kết quả sắp gióng mồi GAVf .......................................................................... 43 Hình 16: Kết quả sắp gióng của mồi GAVr ................................................................... 44 Hình 17: Kết quả sắp gióng của mồi TSVf .................................................................... 44 Hình 18: Kết quả sắp gióng của mồi TSVr .................................................................... 45 Hình 19: Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer ............................................... 46 Hình 20: Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi ................................................................................ 48 Hình 21: Khảo sát nhiệt độ lai ......................................................................................... 49 Hình 22 : Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của 3 cặp mồi ................................................. 50 7 Hình 23: Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi........................................................ 51 Hình 24 : Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh ............................ 53 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT YHV: Yeallow heat virus TSV: Taura syndrome virus GAV: Gill-associated virus CTV: Cộng tác viên ARN: Acid ribonucleic DNA: Acid deoxyribonucleic PCR: Transcription polymerase chain reaction dNTP: Deoxynucleotide triphotphat DMSO: Dimethylsulfoxide dATP: Deoxy adenosine triphosphate dTTP: Thymedine triphosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate UTRs: Untranslated regions RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction kDa: kilo dalton H&E: Hematoxylin EoSin 9 LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay việc khai thác các nguồn lợi thủy sản biển đã làm cho trữ lượng của các đối tượng thủy sản có giá trị kinh tế cao ngày càng trở nên cạn kiệt. Do đó nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao và do sự ưu đãi của thiên nhiên, nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre, Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng với khoảng 260.000 ha với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã được áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi chưa được đảm bảo. Hơn nữa việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá vỡ môi trường sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và đã gây ra nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993 đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể. Nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi tôm, nhất là bệnh do virus gây ra như virus gây hội chứng Taura (Taura syndrome virus -TSV), virus gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV) và virus gây bệnh mang (gillassociated virus - GAV). Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Hiện nay, ba loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm và gây thiệt hại lớn trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm giám sát ba mầm bệnh này từ lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương 10 pháp sinh học phân tử trong đó có phương pháp multiplex RT-PCR để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm là nguồn công cụ rất hữu ích và đem lại nhiều hiệu quả cao. Đề tài “Xây dựng qui trình phát hiện đồng thời Yeallow head virus(YHV), Taura syndrome virus(TSV) và Gill-associated virus(GAV) trên tôm bằng kỹ thuật Multiplex Reverse transcription polymerase chain reaction” được thực hiện nhằm mục đích trên. 11 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh 1.1.1. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh trên thế giới Lịch sử phát triển nghề nuôi tôm ở nhiều nước, nhất là ở vùng Trung Quốc và Đông Nam Á cho thấy vấn đề thiệt hại do dịch bệnh trong nghề nuôi tôm là điều không thể tránh khỏi. Các mô hình nuôi tôm, sau một thời gian khai thác thì nhất định bệnh sẽ xuất hiện [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994]. Trung Quốc là nước có sản lượng tôm cao nhất thế giới, năm 1992 là 150.000 tấn; năm 1993 do dịch bệnh thiệt hại 50% tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm sú nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh. Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong quý ba năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%. Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994]. Bệnh đầu vàng gây chết tôm sú nuôi ở miền Trung và miền nam Thái lan, đặc biệt nguy hiểm cho các vùng nuôi thâm canh [Boonyaratpalin và CTV, 1992]. Virus đầu vàng có thể liên quan đến đợt dịch bệnh của tôm sú nuôi ở Đài loan năm 1987-1988. Những nơi khác thuộc Đông Nam Á như: Indonesia, Malaysia, Trung quốc, Philippine gặp ít nhưng nguy hiểm cho tôm sú nuôi [Linhtner, 1996]. Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển. Bệnh do Taura syndrome virus (TSV) gây chết trên tôm thẻ chân trắng được phát hiện lần đầu tiên ở khu vực cửa sông Taura tỉnh Guayas, Ecuador, do nhà khoa học Jimenez công bố, sau đó lây lan khắp lãnh thổ nước này. Nạn nhân tiếp theo của dịch bệnh này là các nước Peru, Columbia, Honduras, Guatemala, El Salvador, vùng đông bắc Brazil, Nicaragua, Mexico và các bang ở miền bắc nước Mỹ cùng với quần đảo Hawaii… gây nên đại dịch đã làm thiệt hại nặng về kịnh tế: năm 12 1993-1994 Châu Mỹ thiệt hại 132.000 tấn, năm 1998-1999 có đến 90% ao nuôi tôm thẻ chân trắng ở Đài Loan bị nhiễm bệnh khi nhập giống từ Ecuador. Virus GAV được phát hiện ở Úc liên quan đến phức hợp bệnh đầu vàng. Virus tồn tại cục bộ trong quần thể tôm sú ở Queensland - Úc, Malaysia và Thái Lan.. Lây nhiễm tự nhiên với GAV chỉ được tìm thấy ở tôm Penaeus monodon, nhưng lây nhiễm thực nghiệm đã gây ra tử vong ở tôm P. esculentus, P.merguiensis và P.japonicus. Với tôm P.japonicus tính kháng bệnh có liên quan đến tuổi và kích cỡ tôm. Bệnh đã gây những thiệt hại rất lớn. 1.1.2. Tình hình nuôi tôm và dịch bệnh tại Việt Nam Hơn 10 năm trở lại đây, nghề nuôi tôm ở nước ta phát triển mạnh. Năm 2001, diện tích nuôi tôm thương phẩm đạt hơn 230.000ha, năng suất bình quân 462kg/ha, cá biệt có mô hình đạt 9-11tấn/ha, tổng sản lượng tôm nuôi 155.000 tấn. Ðồng bằng sông Cửu Long là khu vực có phong trào nuôi tôm phát triển mạnh, tỷ lệ sản lượng tôm nuôi chiếm hơn 50% của cả nước. Diện tích nuôi tôm nước lợ đạt 546.757 ha (2003), trong đó diện tích nuôi thâm canh là trên 15.534 ha (chiếm khoảng 2,84 % tổng diện tích nuôi tôm), nuôi bán thâm canh trên 20.116 ha (chiếm 3,67 %), còn lại là nuôi quảng canh cải tiến và quảng canh. Từ năm 1997 đã phát triển những mô hình nuôi tôm công nghiệp (thâm canh) đưa năng suất lên trung bình 5 tấn/ha/vụ. Các tỉnh duyên hải Nam Bộ có tổng diện tích nuôi lớn nhất, chiếm 87,17 % của cả nước với 476.528 ha. Năm 2003 sản lượng nuôi tôm nước lợ đạt hơn 200.000 tấn. Tuy nhiên, cùng với việc tăng nhanh diện tích nuôi tôm, tình hình dịch bệnh cũng phát triển. Theo thống kê của Bộ Thuỷ Sản (1995), từ năm 1993 - 1995 báo động trên toàn quốc dịch bệnh tôm đã làm thiệt hại hàng trăm tỷ đồng. Trong đó, dịch đầu vàng (YHV), đỏ đuôi (TSV), bệnh trên mang (GAV) gây ra những thiệt hại lớn với tỉ lệ tôm chết rất cao. Trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn, trị giá khoảng 294 tỷ đồng. Đến nay dịch bệnh vẫn tồn tại và lây lan ngày càng rộng gây tổn thất nghiêm 13 trọng. Đồng Bằng Sông Cửu Long bị thiệt hại lớn nhất do nơi đây tập trung khoảng 87 % diện tích nuôi tôm của cả nước. 1.2. Tác nhân gây bệnh 1.2.1. Yellow head virus (YHV) 1.2.1.1. Hình thái cấu trúc Virus YHV hình que, có kích thước 44±6 x 173±13nm. Nhân của virus có đường kính gần 15 nm, chiều dài có thể tới 800 nm. Cấu trúc nhân là ARN, kích thước 26.662bp và mã hóa cho 4 tiểu phần protein cấu trúc 170, 135, 67 và 22 kDa. Hiện nay virus YHV cùng với GAV được coi là thành viên của loài Gill-associated virus, giống Okavirus, họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV, 2005] Bộ gen bao gồm bốn khung đọc mở dài (ORFs). ORF1a và ORF1b mã hóa protein phi cấu trúc là các polyproteins (pp1a và pp1ab). ORF1b là một phần mở rộng của ORF1a thông qua một frameshift ribosome. ORF2 mã hóa protein nucleocapsid (P20). ORF3 mã hóa lớp vỏ glycoprotein. Sử dụng những phương pháp phát hiện gene trên đối tượng là tôm Penaeus monodon đã tìm ra 6 genenotyp của YHV. Sử dụng mồi kiểm tra giới hạn và mục tiêu là vùng gene ORF1b đã xác định được trình tự gen được bảo tồn cao trong số 57 chủng trong sáu kiểu gen phát hiện ở P. monodon nguồn gốc từ các vùng khác nhau của Ấn Độ-Thái Bình Dương [5]. 1.2.1.2. Cách thức lan truyền Bệnh đầu vàng lây truyền theo đường nằm ngang, virus từ tôm nhiễm bệnh bài tiết ra môi trường hoặc từ một số tôm tự nhiên nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các tôm trong ao nuôi. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đầu vàng từ ao khác và bay đến ao nuôi và mang theo mầm bệnh. 14 1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý Theo báo cáo của các nhà khoa học, từ năm 2001 đến nay phát hiện thấy tôm bị bệnh vàng đầu có độ tuổi từ 25 ngày đến 70 ngày. Nếu là tôm nhỏ từ 25-35 ngày thì nhiễm bệnh càng nặng và sẽ chết toàn bộ trong vòng 2-3 ngày. Bệnh gây hại chủ yếu trên tôm sú.  Biểu hiện đầu tiên tôm phát triển rất nhanh và ăn nhiều hơn mức bình thường. Tôm đột ngột dừng ăn, sau một hai ngày tôm dạt vào gần bờ và chết.  Mang và gan tụy có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt  Bệnh có thể gây ra tỷ lệ chết nghiêm trọng đến 100% trong vòng 3-5 ngày.  Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá kết đặc lại hoặc bị phá huỷ phân mảnh.  Kiểm tra mô bệnh học tế bào có hiện tượng hoại tử ở nhiều cơ quan và xuất hiện các thể vùi trong tế bào chất, nhân thoái hoá kết đặc và thấy phân mảnh của nhiều tế bào khác nhau: hệ bạch huyết (Lymphoid), tế bào mang, tế bào kẽ gan tụy, tế bào biểu bì ruột.[Bệnh học thủy sản, 2005]. Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV 15 1.2.2. Taura syndrome virus (TSV) 1.2.2.1. Hình thái cấu trúc Tác nhân gây ra hội chứng này là Taura Syndrome Virus (TSV) hay Picornavirus thuộc họ Picornaviridae. Virus hình cầu có 20 mặt, đường kính 30 – 32 nm, hệ thống gen là RNA mạch đơn có chiều dài 10,205 nucleotit, cấu trúc capsid có ba phần (55, 40 và 24kD) và một đoạn polypeptide phụ (58kD) tương ứng với ký hiệu VP1, VP2, VP3 và VP4. [4]. Virus ký sinh tế bào biểu mô và dưới biểu mô đuôi. Ký chủ chính: P. vannamei, P. setiferus, P. stylirostris [3], các loài tôm nhiễm thực nghiệm như P. aztecus, P. duorarum [Lightner, 1996; Overstreet và CTV, 1997]. Cấu trúc gene của TSV được miêu tả có hai khung đọc mở lớn là ORF1 và ORF2, phân biệt bởi một vùng gồm có 2 gene với 207 nucleotid. ORFs 1 và 2 chiếm đến 92% gene của TSV, 8% còn lại là của vùng không mã hóa. Một khu vực gồm có hai gene 207 nucleotide phân cách khung đọc mở 1 và 2. ORF1 chứa trình tự motif của các protein phi cấu trúc như helicase (NTP-binding protein), protease và RNA polymerase phụ thuộc RNA. ORF2 có chứa trình tự cho các protein cấu trúc của TSV, trong đó có 3 protein capsid chính là VP1 tới VP3 ( tương ứng có khối lượng 55, 40, 24 kDa) và một protein phụ là VP0 (58 kDa). Để phát hiện hội chứng Taura trên tôm người ta thường nghiên cứu trên gene protein capsid hoặc protein áo (coat protein) nằm trong gene protein capsid (vùng gene VP1) [4]. Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV. Số: chỉ vị trí nucleotide. ORFs 1 và 2 được hiển thị như là các hộp mở. ORF1 chứa gene qui định trình tự của các protein phi cấu trúc như Bir, helicase (H), protease (P) và RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp). ORF2 qui định trình tự của các protein cấu trúc VP1, VP2, VP3. Mũi tên đại diện cho đầu cuối N của protein capsid. 16 1.2.2.2. Cách thức lan truyền Bệnh TSV có thể lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều thẳng đứng. Sự lan truyền theo đường ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau của tôm hoặc do nguồn nước bị nhiễm. Ấu trùng tôm giống ở giai đoạn sớm có thể nhiễm virus nếu bố mẹ mang mầm bệnh (lây lan theo chiều thẳng đứng). 1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý Virus này xuất phát từ trong tế bào chất và sau đó lây sang các biểu mô và biểu bì con bệnh. Bệnh gây hại trên tôm thẻ ngay trong giai đoạn trưởng thành, trọng lượng phổ biến từ 0,1-0,5 gram từ 2-4 tuần tuổi. Đây được xác định là loại virus cực kỳ nguy hiểm, thời gian ủ bệnh dài và khả năng chết lên tới 95%. Bệnh kéo dài cho tới giai đoạn tôm lột xác và có khả năng cấp tính làm cho tôm èo uột, mềm vỏ, phá huỷ hệ tiêu hoá và khuếch tán, lan truyền rất nhanh. Tôm sống sót giai đoạn cấp tính đi qua một giai đoạn chuyển tiếp vào giai đoạn mãn tính. Trong giai đoạn này, tôm không có triệu chứng, và chỉ bị phát hiện tổn thương mô học là tạng lymphoid . Cơ thể và các bộ phận khác có màu đỏ hoặc đen hồng, biếng ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước hoặc rúc vào đìa nuôi. Gan tụy có màu vàng hơn bình thường, mang có thể bị sưng, thường bị chết lúc lột xác. Trong thời gian đầu không thấy tôm chết quanh bờ ao nhưng lại có tôm chết dưới đáy, khoảng 2 ngày sau tôm sẽ nổi lên mặt nước và tìm thấy nhiều tôm chết ở rìa ao[Bệnh học thủy sản,2005]. Hình 3: Hội chứng Taura 17 1.2.3. Gillassociated virus (GAV) 1.2.3.1. Hình thái cấu trúc GAV được coi là thành viên của loài Gill-associated virus, giống Okavirus, họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV., 2005] (YHV typ 2) được phát hiện ở Úc, có khả năng gây bệnh mang trên tôm sú. GAV có quan hệ rất gần gũi với YHV do những đặc điểm hình thái cấu trúc rất giống nhau. Chúng phân bổ 95.8% trình tự nucleotide và có 85,1% nucleotide giống nhau [Cowley và CTV, 1999]. Với sự đồng nhất 98,5% giữa các nucleotide cho thấy YHV và GAV là biểu trưng cho một loài chung nguồn gốc nhưng khác biệt di truyền do địa lý gọi là topotypes. Nadala và cộng sự (1997) đã xác định được 4 cấu trúc protein (170, 135, 67 và 22 kDa) từ YHV tinh khiết và bằng cách suy luận đó đã tìm ra GAV và xác định rằng protein 135 KDA là qui định cho GAV [18]. Vùng trình tự khuếch đại gen mục tiêu ORF1b được sử dụng để phát hiện GAV trong các xét nghiệm. 1.2.3.2. Cách thức lan truyền Dạng lan truyền theo phương nằm ngang có hiệu quả nhất do chúng ăn thịt lẫn nhau, nhưng việc lan truyền cũng có thể bằng nguồn nước. GAV cũng có thể truyền theo phương thẳng đứng từ tôm bố mẹ còn khoẻ. Virus có thể lan truyền hoặc từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai nhưng không rõ là sự lây nhiễm có ở trong trứng hay không. 1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt nước hoặc quanh bờ ao. Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ bộ, cánh đuôi và phần miệng; mang biến sang vàng-hồng, còn quan sát thấy giun hình ống và con hà bám trên mang bẩn. Những biểu hiện chung của nhiễm GAV cấp tính luôn thay đổi và không phải luôn nhận thấy được, vì thế chúng không đáng 18 tin cậy ngay cả chẩn đoán sơ bộ. Bệnh có thể gây chết 80-90%, hoặc giảm chất lượng thương phẩm.[Bệnh học thủy sản, 2005]. 1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh 1.3.1. Phương pháp mô bệnh học Dựa vào biểu hiện trên các cơ quan của tôm để có thể đánh giá mức độ bệnh và chủng gây bệnh.Có thể dùng để chuẩn đoán các bệnh do YHV, GAV, TSV gây ra bằng các biểu hiện mô biểu bì, mang, gan có những dấu hiệu đặc trưng cho từng loại bệnh. Như: - Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng, kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá, kết đặc lại hoặc bị phá huỷ phân mảnh. Mang và gan tuỵ có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt. Cố định tôm nghi bị bệnh đầu vàng sắp chết trong dung dịch Davidson và xử lý cho nhuộm màu chuẩn H&E. Hầu hết các mô nõi có huyết tương đều có thể bị nhiễm bệnh, tuy nhiên những vị trí quan trọng như cơ quan bạch huyết, các tế bào gan tụy trung gian (không phải các tế bào biểu mô ống), tim, cơ và các mô liên kết (không phải các tế bào biểu mô), các mô biểu bì dạ dày và mô mang . Bằng kính hiển vi quang học có thể xác định được một lượng lớn thể vùi tế bào chất hình cầu có đường kính khoảng 2mm (nhỏ hơn đối với mô trung bì và ngoại bì) bắt màu thuốc nhuộm kiềm và khá đồng màu. - Việc chẩn đoán hội chứng Taura ở các giai đoạn cấp tính cần đến những biểu hiện mô học (các tiêu bản nhuộm H&E) của các vùng bị hoại tử ở lớp biểu mô cutin trên toàn bộ bề mặt cơ thể, phần phụ, mang, ruột sau, thực quản. Mô liên kết ở dưới lớp cutin và các sợi cơ vân ở dưới hay kề sát với lớp biểu mô cutin cũng có các dấu hiệu hoại tử. Ðôi khi lớp biểu mô ống của tuyến râu cũng bị ảnh hưởng. Các tổn thương của lớp cutin có thể chứa các tế bào có tế bào chất bắt màu Eosin không bình thường (nhuộm màu hồng) và nhân bị ngưng kết (chất nhân cô đặc lại) hoặc bị vỡ (chất nhân bị chia nhiều mảnh). Trong giai đoạn cấp tính các tổn thương thường có rất nhiều các mảnh vụn của các tế bào hoại tử và chúng giống như các thể hình 19 cầu sần sùi (đường kính 1-20 µm) có màu nhuộm thay đổi từ bắt màu Eosin sang bắt màu kiềm sáng (màu xanh da trời). Một đặc tính khác của hội chứng Taura cấp tính là có sự ngưng kết hồng cầu hoặc các biểu hiện khác do phản ứng tự vệ của vật chủ. Các đặc tính này phối hợp lại tạo cho các tổn thương hội chứng Taura cấp tính giống như .rắc hạt tiêu. Điều này coi như để chẩn đoán bệnh và có thể coi là căn cứ kiểm tra cho các loài mẫn cảm ở các vùng nước bị dịch cục bộ. Với những quan sát lần đầu về các đặc điểm mô bệnh này, hoặc việc chúng xuất hiện ở loài tôm he không bình thường hoặc các địa điểm không bình thường thì dùng một kỹ thuật khác đề kiểm khẳng định là cần thiết. Ở giai đoạn chuyển tiếp của hội chứng Taura, số lượng và mức độ ác liệt của các tổn thương lớp cutin là đặc trưng cho bệnh ở giai đoạn cấp tính có giảm đi và bắt đầu có hồng cầu ngưng kết ở các mô bị bệnh. Các tổn thương này sẽ có màu đen. Nếu những tổn thương vỏ cutin cấp tính làm thủng lớp mô sừng ngoài, những mặt ngoài bị tổn thương này có biểu hiện của sự hình thành tập đoàn và xâm nhập của vi khuẩn Vibrio spp. hoặc các bệnh nhiễm thứ cấp khác. Trong giai đoạn mãn tính của hội chứng Taura, biểu hiện lây nhiễm chỉ được thể hiện bằng sự có mặt của các hình cầu trong cơ quan bạch huyết (LOS), nó ứng với việc tích đọng các hồng cầu trong khoảng giữa các khoảng giữa ống của cơ quan bạch huyết. - Trong chẩn đoán bệnh do GAV gây ra ta sẽ chú ý tới những biểu hiện mô học sau: Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ bộ,cánh đuôi và phần miệng; mang biến sang vàng-hồng. Tách giáp đầu ngực của tôm nhiễm bệnh ra khỏi phần bụng và tách ra theo chiều dọc. Sau đó đem cố định mẫu bằng dung dịch Davidson và xử lý dùng cho mô học. Nhuộm các lát cắt bằng H&E. Các cơ quan bạch huyết của tôm bệnh bị mất cấu trúc dạng tiểu quản thông thường. Tại những nơi bị phá vỡ, không có nhân hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng kết hoặc tạo ra không bào. Foci của các tế bào không bình thường thấy ở trong các cơ quan bạch huyết và chúng bắt màu Eosin sẫm. Các mang của tôm bệnh có biểu hiện hư hại về cấu trúc như gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp 20 biểu bì của các lá mang sơ cấp và thứ cấp. Cấu trúc tế bào của mang biểu hiện bình thường tách biệt với foci nhỏ bắt màu kiềm của các tế bào hoại tử. 1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử, trong đó trình tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào. Phương pháp này được sủ dụng để phát hiện RNA của virus YHV, GAV và TSV sử dụng tế bào và mô của ký chủ. Vì vậy phải trải qua một loạt các thao tác xử lý mô (như cố định, khử nước, tẩm paraffin cắt thành những lát mỏng (7-10µ) trải trên lam kính). Đọc kết quả trực tiếp trên lam kính chứa mẫu mô. Phương pháp lai acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn đoán mới dùng acid nucleic đang sử dụng rộng rãi. 1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử tuy là một phương pháp mới nhưng đã thể hiện độ vượt trội về độ nhạy và tính chính xác trong việc phát hiện các bệnh do virus YHV, TSV, GAV gây ra so với các phương pháp khác. Đặc biệt là phương pháp PCR thể hiện sự vượt trội trong chẩn đoán các loại bệnh. Ưu điểm của phương pháp này là: - Thời gian chẩn đoán nhanh - Độ đặc hiệu cao nhờ cặp mồi thiết kế trên vùng bảo tồn của chủng virus cần phát hiện. 1.3.3.1.Phương pháp RT – PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction) Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước chính: - Tách chiết RNA từ bệnh phẩm biểu mô - Tạo cDNA bằng phản ứng sao chép ngược - Thực hiện phản ứng bằng PCR với các cặp mồi đặc hiệu
- Xem thêm -