Tài liệu Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp pcr gen 16s ty thể

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG -----------NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI ThS. HỒ THỊ THANH THỦY Nha Trang 2011 BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ------------ NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số sinh viên : 4913044007 Lớp : 49SH Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội ThS. Hồ Thị Thanh Thủy Nha Trang - 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS. Hồ Thị Thanh Thủy - Phó Giám đốc Công ty CPCN Việt Á và TS. Lê Huyền Ái Thúy - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Công ty CPCN Việt Á đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Người thực hiện NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................................i DANH MỤC CÁC BẢNG ...........................................................................................ii DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................iii ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................1 PHẦN I. TỔNG QUAN................................................................................................3 1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY................................................................4 1.1. Sơ lược về ăn chay................................................................................................4 1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước ...............................4 2. TỔNG QUAN VỀ HỆ GEN TY THỂ ......................................................................5 2.1. Cấu trúc hệ gen ty thể...........................................................................................5 2.2. Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật .....................................................8 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM..............................................................................................................10 3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein ......................................10 3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di ........................................................11 3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) ..............11 3.2. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA .........................................12 3.2.1. Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) ...........................................12 3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .......................................13 3.2.3. Phương pháp Real time PCR ........................................................................15 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................17 1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ.......................................................................................18 1.1. Vật liệu- hóa chất..................................................................................................18 1.1.1. Mẫu thực phẩm ..............................................................................................18 1.1.2. Mồi .................................................................................................................18 1.1.3. Hóa chất. ........................................................................................................18 1.2. Dụng cụ thiết bị .......................................................................................................19 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........................................................................20 2.1. Phương pháp xử lý mẫu .......................................................................................20 2.2. Phương pháp tách chiết DNA ..............................................................................20 2.2.1. Nguyên tắc .....................................................................................................20 2.2.2. Tiến hành........................................................................................................21 2.3 .Tiến hành phản ứng PCR .....................................................................................21 2.3.1. Thành phần.....................................................................................................21 2.3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng........................................................................21 2.3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm...............................................................22 2.4. Điện di trên gel agarose........................................................................................23 2.4.1. Nguyên tắc .....................................................................................................23 2.4.2. Pha hóa chất ...................................................................................................23 2.4.3. Tiến hành........................................................................................................23 2.5. Phương pháp thiết kế mồi. ...................................................................................23 2.5.1. Tiêu chuẩn thiết kế mồi..................................................................................23 2.5.2. Các phần mềm sử dụng .................................................................................24 2.5.3. Phương pháp tiến hành..................................................................................24 2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lí thuyết ..............................................................25 2.7. Phương pháp đánh giá mồi trên thực nghiệm.......................................................25 2.7.1. Phương pháp đánh giá khả năng hoạt động của mồi...................................25 2.7.2. Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi.......................................25 2.7.3. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi.................................................25 2.7.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của phản ứng..............................................26 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN....................................................................27 1. THIẾT KẾ MỒI..........................................................................................................28 2. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỒI TRÊN LÝ THUYẾT ...........................28 2.1. Khảo sát kích thước, %GC, nhiệt độ nóng chảy (Tm). .......................................28 2.2. Khảo sát cấu trúc thứ cấp của mồi.......................................................................29 2.3. Khảo sát tính đặc hiệu và sự nhân bản chọn lọc của mồi theo lý thuyết...........31 3. KHẢO SÁT MỒI TRÊN THỰC NGHIỆM .............................................................35 3.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi............................................................................35 3.2. Kết quả giải trình tự..............................................................................................36 3.3. Khảo sát nhiệt độ lai .............................................................................................39 3.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi ..............................................................................40 3.5. Khảo sát độ nhạy của quy trình ...........................................................................41 4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU THỰC PHẨM CHAY ..........................42 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................................45 1 KẾT LUẬN.................................................................................................................45 2 KIẾN NGHỊ................................................................................................................45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................46 i CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat bp base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid ELISA Enzyme Link Immuno Sorbent Assay FDA Food and Drug Administration IDT Intergrated DNA Technologies IEF Isoelectric Focusing mtDNA mitochondrial DNA PCR Polymerase Chain Reaction PAGE Polyacrylamide gel SDS Sodium Dodecyl Sulphate RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA ribosome ribonucleic acid tRNA transport ribonucleic acid ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Ribosome của các loài................................................................................... 9 Bảng 3.1: Trình tự mồi thiết kế .................................................................................... 28 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát kích thước, %GC, Tm của mồi.................................... 28 Bảng 3.3: Năng lượng tự do ΔG của các cấu trúc thứ cấp ....................................... 29 Bảng 3.4a: Kết quả BLAST mồi xuôi trên NCBI ...................................................... 33 Bảng 3.4b: Kết quả BLAST mồi ngược trên NCBI................................................... 34 Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ chứng dương............................ 36 Bảng 3.6: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với sản phẩm PCR trên GeneBank bằng phầm mềm BLAST.......................................................... 38 Bảng 3.7: Thống kê kết quả khảo sát 29 mẫu thực phẩm chay trên thị trường ... 43 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của ty thể........................................................................................ 6 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gene ty thể................................................................................. 8 Hình 1.3. Nguyên tắc trong phản ứng PCR ................................................................ 15 Hình 3.1: Cấu trúc selt-dimer của hai mồi (a, b: cấu trúc của mồi xuôi, c: cấu trúc của mồi ngược) ................................................................................................ 30 Hình 3.2: Dạng cấu trúc hetero-dimer ....................................................................... 30 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi bằng Annhyb.................... 31 Hình 3.4a: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi xuôi trên ClustalX ................ 32 Hình 3.4b: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi ngược trên ClustalX............. 32 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của mồi.......................................................................................................................... 35 Hình 3.6: Kết quả giải trình tự mẫu chứng dương DNA thịt heo ........................... 37 Hình 3.7: Kết quả kiểm tra độ tương đồng của sản phẩm PCR trên ClustalX .... 38 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát nhiệt độ lai................... 39 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ đặc hiệu của mồi ... 40 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ nhạy của quy trình ................................................................................................................. 41 Hình 3.11: Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay .... 42 Sơ đồ : Quy trình tiến hành thí nghiệm ...................................................................... 22 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới ẩm thực là vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt phải kể đến là thực phẩm dành cho những người ăn chay. Khoa học cũng đã chứng minh, ăn chay là một hình thức ăn uống có lợi cho sức khỏe như giúp giảm cân, giảm huyết áp, giảm bệnh động mạch vành tim, giảm nguy cơ bị sỏi thận, bị ung thư, giảm triệu chứng bệnh về xương và khớp… Do đó, xu hướng ăn chay ngày càng được nhiều người tiêu dùng có xu thế sử dụng. Trên thị trường thực phẩm chay, hàng hoá rất đa dạng từ thực phẩm khô đến hàng đóng hộp, ăn liền, chế biến sẵn với giá thành cao hơn nhiều so với những sản phẩm mặn thông thường. Thế nhưng, mức độ đáp ứng “đúng” tiêu chí của một loại thực phẩm ăn chay theo nghĩa: nguyên liệu dùng để sản xuất phải có nguồn gốc từ thực vật. Hiện tại, chỉ có một vài cơ sở lớn, chuyên sản xuất và kinh doanh thực phẩm chay như Âu Lạc, Kim Chi có ghi rõ đầy đủ thành phần nguyên liệu trên sản phẩm, trong khi đó sản phẩm của các cơ sở chế biến nhỏ, lẻ lại chưa được kiểm soát và rất thiếu thông tin về thành phần nguyên liệu [30]. Một số nghiên cứu mới đây cho thấy những thành phần hương liệu mà các nhà sản xuất đưa vào sản xuất thực phẩm chay có chứa thịt hoặc nước xương hầm thịt vì vậy khiến cho những người ăn chay vô tình phá giới và làm cho thực phẩm ăn chay chưa đúng với tên gọi của nó. Vấn đề đặt ra là làm sao để xác định được thành phần của sản phẩm chay có chứa thịt động vật hay hay không là một yêu cầu bức thiết. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số nhà khoa học đã đưa ra một số phương pháp để nhận biết các loại thịt và xác định nguồn gốc của thịt nhưng vẫn chưa được các cấp quản lý thực phẩm quan tâm nhiều. Các phương pháp phát hiện thịt chủ yếu là dựa vào phát hiện trình tự gen ty thể để phát hiện loài. Bởi DNA ty thể có nhiều ưu điểm thích hợp làm đối tượng nghiên cứu như: DNA ty thể có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ; Số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào; trong khi tách chiết, DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân do có cấu trúc dạng vòng, khó bị phá vỡ và dễ dàng tách chiết hơn [2]. Đặc biệt, gen 16S ty thể là trình tự có những vùng 2 bảo tồn ở hầu hết các loài động vật nên có thể dựa vào đặc điểm này để xây dựng quy trình phát hiện DNA của động vật khi chúng có mặt trong thực phẩm chay. Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể”. Mục đích của đồ án: đánh giá chính xác và nhận biết nhanh chóng sự có mặt của thịt trong các sản phẩm chay. Nội dung: 1) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR. 2) Khảo sát các đặc tính của mồi đã thiết kế về mặt lý thuyết. 3) Khảo sát khả năng hoạt động của mồi khi thực hiện phản ứng PCR. 4) Thử nghiệm phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phản ứng PCR gen 16S ty thể. Về phương diện khoa học, đây là quy trình mới có thể nhận biết được sự có mặt của DNA các loài động vật nói chung. Về mặt thực tiễn, phương pháp sẽ giúp cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm kiểm soát được các mặt hàng thực phẩm chay trên thị trường, giúp người tiêu dùng an tâm hơn khi sử dụng các sản phẩm chay. 3 PHẦN I. TỔNG QUAN 4 1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 1.1. Giới thiệu về thực phẩm chay Thực phẩm chay là thực phẩm không chứa các thành phần động vật và những chất có nguồn gốc động vật. Thực phẩm chay giả mặn là những thực phẩm được chế biến chủ yếu từ tinh bột được tạo hình mô phỏng thành các món ăn mặn như tôm, mực, thịt heo, bò, cá... Thuật ngữ “ăn chay” được biết đến ở đạo Phật và một vài tôn giáo khác. Ngày nay, ăn chay đang trở thành một trào lưu trên thế giới, nhất là trong giới tri thức và các chuyên gia. Ở các nước phương Tây, theo thống kê chưa đầy đủ, có khoảng 5% dân số Anh và Mỹ cho biết họ ăn chay trường hay ăn chay thường xuyên [26]. Rất nhiều nghiên cứu khoa học trong hơn 20 năm qua đã cho thấy ăn chay còn được xem như một liệu pháp để giảm bớt nguy cơ xảy ra nhiều loại bệnh tật nguy hiểm như tim mạch, cao huyết áp, đái tháo đường, ung thư,... Trong một nghiên cứu trên 47.000 người Mỹ cho thấy nhóm người ăn chay có nguy cơ mắc bệnh tim mạch thấp hơn nhóm ăn mặn khoảng 20%. Ăn chay và ăn nhiều rau quả còn giảm nguy cơ tai biến mạch máu não đến 22%. Ngoài ra, ăn chay còn giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú, ruột và phổi so với ăn mặn. Một nghiên cứu khác trên 26.000 người Mỹ cho thấy người ăn chay có tỉ lệ mắc bệnh đái tháo đường thấp hơn người ăn mặn khoảng 25%[28]. Hơn nữa, ăn chay được xem như một biện pháp bảo vệ môi trường. Do đó, nhu cầu về thực phẩm chay trên thị trường hiện nay là rất lớn. 1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước. Cơ quan tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm (FDA) tại Đài Bắc đã khám phá ra rằng 15 loại trong 21 loại thực phẩm chay giả thịt lấy từ các khu chợ có chứa DNA động vật, chiếm hơn 70%.[30] Theo các nghiên cứu này, DNA của các loài động vật thường được phát hiện trong thực phẩm chay như: động vật nuôi có sừng (trâu, bò,…), gia cầm (gà, vịt, đà điểu,…), heo và cá. Ngày 1 tháng 7 năm 2009, Đài Loan đã ban hành các đạo luật về việc dán nhãn các thực phẩm chay với mục đích đảm bảo các thực phẩm 5 này là chay[31]. Như vậy, trên thế giới, số sản phẩm chay bị nhiễm thịt tăng cao đến mức báo động. Ở Việt Nam, các sản phẩm chay giả mặn đang ngày càng thịnh hành trên thị trường từ các siêu thị, nhà hàng, quán ăn cho đến các chợ, quán tạp hoá lớn nhỏ trên khắp cả nước như: thịt bò chay, thịt heo chay, sườn non chay, bóng cá chay, tôm chay, cánh gà chay, đùi gà chay, cá thu chay, mực chay… Giá thành của các sản phẩm chay giả mặn thường cao hơn so với các sản phẩm mặn. Theo khảo sát thị trường giá một số loại như sau: tôm chay 120.000đ/kg, mực chay cắt lát 50.000đ/kg, cá viên chay 30.000đ/kg, Sườn non chay: 65.000 đồng/kg, Chả lụa chay: 13.000 đồng/cây 400gr, Chà bông chay các loại: 112.000 đồng/kg, Thịt gà xé /bò xé kim chi: 8.000 đồng/gói 50gr, Bò viên/cá viên chay: 10.500 đồng/gói 180gr… Thị trường thực phẩm chay tại các chợ lớn tại thành phố Hồ Chí Minh như chợ An Đông, Bình Tây, Bến Thành…rất đáng ngờ vì các sản phẩm chủ yếu được nhập từ Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc không ghi rõ thành phần, nguồn gốc, hạn sử dụng nhưng được bày bán rất phổ biến. Ngoài ra còn có những sản phẩm chay nội địa được sản xuất tại các cơ sở nhỏ lẻ tại địa phương với hình dáng và mùi vị rất giống với món mặn[32]. Vấn đề thực phẩm chay bị nhiễm thịt đang được nhiều người quan tâm nên việc tìm ra phương pháp để phát hiện thịt trong thực phẩm chay là rất cần thiết. 2. GIỚI THIỆU VỀ HỆ GEN TY THỂ 2.1. Cấu trúc của hệ gen ty thể[2,4,6,7,12,13,16]  Đặc điểm cấu trúc ty thể Ty thể được Altmann mô tả lần đầu vào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi của ty thể đã được nghiên cứu chi tiết bởi Palade (1952) và Sjostrand (1953)[7]. Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, kích thước 2-5 µm. Toàn bộ cấu trúc ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng. Lớp màng ngoài bao trùm tạo nên ranh giới ngoài của ty thể, lớp màng trong tạo thành nếp gấp hướng vào tâm là nơi khu trú 6 của các enzyme hô hấp. Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng.[2] Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lượng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lượng dưới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lượng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào.  Cấu trúc hệ gen ty thể Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng (H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine. Khác với DNA nhân, DNA ty thể không liên kết với protein histon do đó DNA ty thể rất giống với DNA vi khuẩn[4][16]. Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 – 5% DNA của tế bào. Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở động vật vào khoảng 15 - 17kb[13]. 7 DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau: - Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân. - Số lượng bản sao lớn. - Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp. - Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài. MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ theo dòng mẹ. Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào. Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng, nên mtDNA được sử dụng như là một công cụ phân tử trong việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài có nhiều thuận lợi. Tất cả genome ty thể động vật có chứa 37 gen, 2 rRNA, 22 tRNA và 13 mRNA. Gen rRNA mã hóa cho các RNA ribosome[13]. 8 Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể 2.2. Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật[10,19,20,22]  Đặc điểm cấu trúc và vai trò của ribosome RNA (rRNA) Ribosome là một bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật sống, ribosome của vi khuẩn, sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào tuy có sự khác nhau về cấu trúc nhưng đều có chức năng dịch thông tin di truyền được "mã hóa" bởi các phân tử DNA sang các phân tử protein (các đơn vị cấu tạo và thực hiện nhiều chức năng khác nhau của cơ thể sinh vật). Ribosome được cấu tạo từ vài phân tử rRNA và hơn 50 protein, được tập hợp thành 2 tiểu phần (tiểu đơn vị) hoàn toàn thích hợp về cấu trúc và hoạt động. Hai tiểu phần này hoạt động thống nhất để thực hiện quá trình dịch mã từ DNA sang chuỗi polypeptide gồm các axít amin trong quá trình tổng hợp protein. Theo quy ước các tiểu đơn vị được đặt tên theo tốc độ lắng của chúng dưới lực ly tâm. Đơn vị đo tốc độ lắng là Svedberg và được viết tắt là “S”. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau, 9 chúng cũng đặc trưng bởi hằng số lắng S, rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến 75 % của tổng RNA. Ở vi khuẩn thực và vi khuẩn cổ không có ty thể. Ở nấm chia thành 2 nhóm, nhóm 1 có ribosome ty thể 70S, tiểu phần lớn 24S, tiêu phần nhỏ 17S; nhóm 2 có ribosome ty thể 72S, tiểu phần lớn 21S và tiểu phần nhỏ 15S. Ở thực vật, có ribosome ty thể 75S, tiểu phần lớn gồm 5S và 26S, tiểu phần nhỏ 18S. Ở động vật, ribosome ty thể 55S, tiểu phần lớn 16S, tiểu phần nhỏ 12S. (Bảng 1.1) Bảng 1.1. Ribosome của các loài (R. Kumar, The molecular biology of plant mitochondria) Loài Vi khuẩn thực Vi khuẩn cổ Nấm (Fungi) + Nấm sợi - Tế bào chất - Ty thể + Nấm men - Tế bào chất - Ty thể Thực vật - Tế bào chất - Lục lạp - Ty thể Động vật - Tế bào chất - Ty thể Ribosome 70S 70S rRNA Tiểu phần lớn Tiểu phần nhỏ 5S, 23S 16S 5S, 23S 16S 80S 70S 5S, 5.8S, 26S 24S 17S 17S 80S 72S 5S, 5.8S, 25S 21S 18S 15S 80S 70S 75S 5S, 5.8S, 25S 5S,(4.5S), 23S (5S), 26S 17S 16S 18S 80S 55S 5S, 5.8S, 28S 16S 18S 12S  Cơ sở sử dụng gen 16S trong phát hiện thịt động vật Trong hệ gen ty thể động vật chứa hai gen rRNA là 12S và 16S rRNA. Gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA trong tiểu phần lớn của ribosome ty thể, được sử dụng trong một số nghiên cứu phát hiện các loài động vật khác nhau như Gregory C. 10 Booton, Jennifer R. Carmichael, (2003); Scott Reaney, Trevor Conrad Martin, Jason Paul Sawyer, (2009). Trung bình mỗi tế bào động vật có khoảng 800- 1000 ty thể, mỗi ty thể có chứa ít nhất 2- 6 phân tử DNA dạng vòng có kích thước 16.500 bp, mỗi phân tử DNA có chứa 22 tRNA, 2 rRNA và 13 gen mã hóa protein (Garder & Snustad, 1984). Như vậy ít nhất trong mỗi tế bào có chứa 800x2 = 1.600 copies gen 16S rRNA. Vì vậy, sử dụng trình tự gen này nhạy hơn khi sử dụng các gen khác chỉ có một bản copy trong một tế bào. Theo Johanson (1993) có 5 đặc điểm quan trọng trong việc sử dụng gen rRNA làm phân tử đích trong việc chẩn đoán, đó là: - Trong tế bào sinh vật số lượng ribosome là rất lớn. Việc chẩn đoán sử dụng mẫu dò rRNA sẽ có độ nhạy cao hơn so với các đoạn gen khác chỉ có 1 đoạn copy. - Sự có mặt của các vùng có sự biến đổi khác nhau trên rRNA cho phép xác định được mức độ đặc trưng cho loài, cho giống và cho lớp. Khi xác định đoạn DNA ở vùng S (vùng bán bảo tồn) thì cho phép xác định sự đặc hiệu theo nhóm. - Số lượng trình tự 16S rRNA được nghiên cứu khá chi tiết và khá nhiều trình tự của các loài, giống được giải mã và được công bố trên ngân hàng gen. - Các thủ tục tiêu chuẩn đã được xác lập để giải trình tự gen rRNA. - Sự tiến hoá và biến đổi của ribosome và cấu tạo của nó được xác định là rất thấp và vì vậy sự ổn định trong chẩn đoán dựa trên rRNA là rất cao và có thể xác định được cả những loài có quan hệ họ hàng gần gũi. 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM 3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein Có nhiều phương pháp dựa trên phân tích protein đã được ứng dụng để xác định các loại thịt và các thành phần từ động vật trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, điện di SDS, các phương pháp miễn dịch, ELISA, phân tích hóa học. Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp này chỉ được ứng dụng để phát hiện thịt tươi hoặc thịt chưa bị thoái hóa (biến tính) và độ đặc hiệu của các phương pháp này tương đối thấp. 11 3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di[14][25] Phương pháp này dựa trên sự di chuyển của protein trong điện trường. Sự di chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỉ số điện tích/khối lượng, nhờ đó các chất khác nhau sẽ được tách ra thành những vết riêng và được phát hiện bằng nhiều cách khác nhau. Quá trình điện di có thể thực hiện trên gel polyacrylamide, gel polyacrylamide có chứa yếu tố gây biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE) hoặc điện di tập trung điểm đẳng điện (isoelectric focusing-IEF). Nghiên cứu của Parisi và Aguiari (1985) đã cho thấy rằng phương pháp SDSPAGE có thể được sử dụng để xác định các loại thịt như: động vật có sừng, cừu, dê, nai, thỏ. Trong phương pháp IEF, myoglobin được sử dụng như một chất chỉ thị cho loài. Năm 1997, Hofmann đã nghiên cứu myoglobin của các loài động vật như: động vật có sừng, ngựa, lợn, cừu, nai, kang-ku-ru, lạc đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu bằng phương pháp IEF. Kết quả cho thấy tập hợp các băng myoglobin có những đặc tính riêng cho từng loài, và có thể xác định được loài động vật dựa vào dữ liệu myoglobin mẫu cho từng loài động vật khác nhau. Ưu điểm của các phương pháp này là đặc hiệu cho từng loài và có thể phát hiện chính xác nguồn gốc các loại thịt. Tuy nhiên, phương pháp này không được dùng để phân tích các mẫu thực tế do giá thành cao, tốn nhiều thời gian, kỹ thuật rất phức tạp, cần xây dựng cơ sở dữ liệu lớn (phương pháp IEF). 3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) [8][23][24] Đây là kỹ thuật miễn dịch dựa trên liên kết kết đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể. Kỹ thuật này bao gồm một enzyme (có bản chất protein có khả năng xúc tác phản ứng sinh hóa) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên (antigen) hay kháng thể (antibody) trong mẫu phân tích. Có hai phương pháp ELISA thường được ứng dụng trong phát hiện các loại thịt khác nhau trong thực phẩm: ELISA gián tiếp (indirect ELISA) và Sandwich ELISA. Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng hai kháng thể, kháng thể thứ nhất gắn đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể thứ hai gắn đặc hiệu với kháng thể thứ nhất và có gắn enzyme. Do đó khi thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất để phát tín hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu hóa học. Phương pháp Sandwich ELISA, kháng