Tài liệu Xác định dư lượng ochratoxin a trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (lc msms) và đề xuất giải pháp nhằm đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn buôn ma thuột

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ BỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP NHẰM ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG AN TOÀN THỰC PHẨM TẠI ĐỊA BÀN BUÔN MA THUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm HUẾ - 2019 ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THU XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG OCHRATOXIN A TRONG CÀ PHÊ BỘT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS/MS) VÀ ĐỀ XUẤT GIẢI PHÁP NHẰM ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG AN TOÀN THỰC PHẨM TẠI ĐỊA BÀN BUÔN MA THUỘT LUẬN VĂN THẠC SĨ CHẾ BIẾN LƯƠNG THỰC, THỰC PHẨM VÀ ĐỒ UỐNG Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. NGUYỄN VĂN HUẾ HUẾ - 2019 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn Buôn Ma Thuột” là một công trình nghiên cứu độc lập không có sự sao chép của người khác. Đề tài là sản phẩm mà Tôi đã nổ lực nghiên cứu trong quá trình học tập tại Trường. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong các công trình khác.Trong quá trình viết bài có sự tham khảo của một số tài liệu có nguồn gốc rõ ràng. Nếu không đúng như trên, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đề tài của mình. Huế, tháng 6 năm 2019 Người thực hiện Nguyễn Thị Phương Thu ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ, động viên sâu sắc của Thầy Cô, bạn bè và người thân, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn đến: Ban Lãnh đạo Viện vệ sinh Dịch tễ Tây Nguyên, các cô chú anh chị và các bạn đồng nghiệp trong Trung tâm kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm khu vực Tây Nguyên đã luôn quan tâm và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực hiện nghiên cứu đề tài luận văn. Bằng tình cảm chân thành nhất, tôi xin cảm ơn toàn bộ Quý Thầy Cô giáo trường Đại Học Nông Lâm Huế đặc biệt là Quý Thầy Cô trong Khoa Cơ Khí Công Nghệ, đã cho tôi những kiến thức quý giá, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu trong môi trường hiện đại. Đặc biệt tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc nhất đến: Thầy TS. Nguyễn Văn Huế Người động viên, giúp đỡ và hướng dẫn trực tiếp tôi hoàn thành báo cáo luận văn tốt nghiệp này. Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và tập thể lớp CNTP K23 đã đóng góp ý kiến xây dựng để tôi hoàn thành bài báo cáo luận văn này. Huế, tháng 6 năm 2019 Học viên Nguyễn Thị Phương Thu iii TÓM TẮT Ochratoxin A là một chất chuyển hóa thứ cấp được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum. Theo tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC) thì Ochratoxins được xếp vào loại chất có khả năng gây ung thư nhóm IIB. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm Ochratoxins nó không gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người. Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể và là rào cản đối với thương mại ảnh hưởng đến nền kinh tế của cả nước. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên cà phê. Để kiểm soát mức độ nhiễm Ochratoxins trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ Ochratoxins ở lượng vết hay siêu vết. Vì những lý do đó, chúng tôi chọn đề tài: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn Buôn Ma Thuột”. Nhằm xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng của Ochratoxin A trong cà phê bột bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. Đồng thời khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột với mong muốn góp phần với các cơ quan chức năng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước. Từ các kết quả nghiên cứu đã lựa chọn được điều kiện phân tích phù hợp để định lượng Ochratoxin A trong cà phê bột: Tối ưu hoá điều kiện MS/MS, tối ưu hoá điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao, khảo sát quy trình xử lý mẫu và thẩm định phương pháp (Phương pháp có LOD=0,63 ng/ml, LOQ=2,11 ng/ml, hiệu suất thu hồi của Ochratoxin A trong nền mẫu cà phê bột ở tại 3 mức 2,5; 5 và 10 µg/kg thu được nằm trong khoảng 70 đến 110%). Áp dụng vào phân tích mẫu thực tế, thực trạng nhiễm Ochratoxin A vẫn còn hiện hữu mặc dù đã có những cảnh báo về khả năng nhiễm độc và độc tính cao của loại độc tố này. Kết quả phân tích cho thấy có 9 mẫu nhiễm Ochratoxin A trong tổng số 55 mẫu (chiếm 16,36%). Các mẫu nhiễm Ochratoxin A đều nằm trong giới hạn cho phép của Bộ Y tế. iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ......................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii TÓM TẮT ................................................................................................................. iii MỤC LỤC .................................................................................................................. iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ..................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG BIỂU ......................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ẢNH .......................................................................................... ix MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề................................................................................................................ 1 2. Mục tiêu của đề tài................................................................................................... 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu ................................................ 3 3.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................................. 3 3.2. Ý nghĩa thực tiễn................................................................................................... 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU............................................................... 4 1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê .................................................................... 4 1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê tại địa bàn tỉnh Đăk Lăk ........................... 4 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của Việt Nam ........................................... 5 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của thế giới .............................................. 6 1.2. Ochratoxins........................................................................................................... 7 1.2.1. Các loại độc tố Ochratoxins ............................................................................... 7 1.2.2. Tính chất hoá lý của độc tố Ochratoxins............................................................. 8 1.2.3. Sự tạo độc tố Ochratoxin A do các nấm mốc ...................................................... 9 1.2.4. Độc tính của Ochratoxin A................................................................................. 9 1.3. Giới hạn tồn dư tối đa cho phép (MRL) .............................................................. 10 1.4. Các phương pháp phân tích ................................................................................. 12 1.5. Lí thuyết phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ .............................................. 14 1.5.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................................ 14 v 1.5.2. Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ................................................................... 14 1.5.3. Sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS) ................................................................ 15 1.6. Một số quy định của Châu Âu về phương pháp phân tích mẫu bằng LC-MS/MS (theo quyết định 2002/657/EC) .................................................................................. 21 1.6.1. Quy định về lựa chọn thông số thẩm định ........................................................ 21 1.6.2. Quy định về hiệu suất thu hồi ........................................................................... 21 1.6.3. Quy định về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng ........................................ 22 1.6.4. Quy định về quy tắc 4 điểm nhận danh............................................................. 22 1.7. Mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố và độc tố Ochratoxin A trên cà phê ở Việt Nam .................................................................................................................. 22 1.8. Tình hình nhiễm Ochratoxin A trên cà phê và các nông sản khác trên thế giới .... 23 CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 25 2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ....................................................................... 25 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu....................................................................................... 25 2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .......................................................................................... 25 2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 25 2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 25 2.3.1 Thiết bị dụng cụ và hóa chất.............................................................................. 25 2.3.2. Tối ưu các thông số kĩ thuật điều kiện chạy của máy khối phổ MS/MS ............ 28 2.3.3. Thẩm định phương pháp phân tích ................................................................... 33 2.4. Đánh giá thực trạng nhiễm dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột trên địa bàn Thành phố Buôn Ma Thuột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng. ....................... 37 2.5. Phương pháp xử lý số liệu - Thống kê mô tả: ..................................................... 38 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ..................................... 39 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chạy máy sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) ........ 39 3.2. Tối ưu các điều kiện MS ..................................................................................... 39 3.3. Tối ưu các điều kiện chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................. 40 3.3.1. Khảo sát thành phần pha động.......................................................................... 40 3.3.2. Khảo sát tốc độ pha động ................................................................................ 42 3.4. Chọn quy trình xử lý mẫu ................................................................................... 43 vi 3.5. Chọn cột chiết pha rắn ........................................................................................ 46 3.6. Thẩm định phương pháp phân tích ...................................................................... 48 3.6.1. Tính đặc hiệu/ chọn lọc .................................................................................... 48 3.6.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn .................................................................. 51 3.6.3. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) .................................... 55 3.6.4. Độ chính xác (độ chụm và độ đúng) ................................................................. 57 3.6.5. Giới hạn lặp lại (r), giới hạn tái lặp nội bộ phòng thí nghiệm (R) ..................... 58 3.7. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột ................. 59 3.7.1. Kết quả khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột ................................................................................................... 59 3.7.2 Đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê.................................................... 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................................ 66 I. Kết luận .................................................................................................................. 66 II. Kiến nghị .............................................................................................................. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................... 68 PHỤ LỤC .................................................................................................................. 72 vii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN Tiếng Anh Tiếng Việt Acetonenitril Acetonenitril Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hóa phân tích chính thức CE Collision energy Năng lượng va chạm EC European Commission Ủy ban Châu Âu EI Electron Ionization Ion hóa bằng dòng electron ESI Eelectrospray ionization Chế độ ion hóa phun điện tử EU European Union Châu Âu ICO International Coffee Organization Tổ chức cà phê thế giới FDA Food and Drug Administration Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao IARC International Agency for Research oncancer Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế Identification point Điểm nhận dạng International Union of Pure and Applied Chemistry Liquid chromatography mass spectrometry Liên minh quốc tế về hóa học cơ bản và ứng dụng LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantity Giới hạn định lượng MeOH Methanol metanol MS/MS Mass spectrometry Khối phổ MRL Maximum Residue Limit Giới hạn dư lượng tối đa OTA Ochratoxin A Ochratoxin A AOAC IP IUPAC LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ Quy chuẩn Việt Nam QCVN RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE solid phase extraction Chiết pha rắn TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Đặc tính lý hóa của các Ochratoxins. .......................................................... 9 Bảng 1.2. Mức dư lượng tối đa cho phép của Ochratoxin A ở Việt Nam, theo QCVN 8-1:2011/BYT, Quy chuẩn kỹ thuật Quốc Gia đối với giới hạn ô nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm. ........................................................................................................ 11 Bảng 1.3. Lựa chọn thông số thẩm định .................................................................... 21 Bảng 1.4. Quy định của Châu Âu về hiệu suất thu hồi ............................................... 21 Bảng 1.5. Qui định của Châu Âu về tỉ lệ ion xác định so với ion định lượng .............. 22 Bảng 1.6. Qui định số điểm nhận danh khi kết hợp các kỹ thuật phân tích ................. 22 Bảng 1.7. Mức nhiễm ochratoxin A trên một số đối tượng ........................................ 24 Bảng 2.1. Bảng pha dung dịch chuẩn chạy máy ......................................................... 28 Bảng 2.2. Công thức tính toán đặc trưng trong phân tích số liệu ................................ 38 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ion mẹ của Ochratoxin A ............................................... 39 Bảng 3.2. Các thông số tối ưu cho ESI-MS/MS ......................................................... 39 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát dung môi pha động.......................................................... 41 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát tốc độ pha động............................................................... 43 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu ........................................................ 44 Bảng 3.6. Kết quả quá trình chiết mẫu ....................................................................... 47 Bảng 3.7. Bảng kết quả khảo sát ion mẹ và 2 ion con của Ochratoxin A .................... 49 Bảng 3.8. Kết quả phân tích chất chuẩn, mẫu trắng và mẫu trắng thêm chuẩn ............ 49 Bảng 3.9. Sự phụ thuộc của diện tích vào nồng độ ..................................................... 51 Bảng 3.10. Kết quả đường chuẩn ............................................................................... 52 Bảng 3.11. Kết quả xác định LOD, LOQ của OTA .................................................... 56 Bảng 3.12. Kết quả xác định RSD, H của OTA ......................................................... 57 Bảng 3.13. Qui định độ đúng và độ chụm của phương pháp phân tích định lượng phụ thuộc nồng độ chất theo 2002/657/EC ....................................................................... 58 Bảng 3.14. Kết quả đánh giá độ tái lặp của Phòng thí nghiệm ................................... 59 Bảng 3.15. Kết quả phân tích mẫu thực tế. ................................................................ 60 ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cấu trúc các Ochratoxins.............................................................................. 8 Hình 1.2. Mô tả tổng quát các bộ phận của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao ............... 15 Hình 1.3. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo kỹ thuật APCI ................................................ 16 Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống ion hóa theo ESI ................................................................ 17 Hình 1.5. Bộ phân tích khối một tứ cực...................................................................... 18 Hình 1.6. Chế độ SIM ................................................................................................ 18 Hình 1.7. Chế độ Full Scan ........................................................................................ 19 Hình 1.8. Sơ đồ bộ phân tích khối ba tứ cực.............................................................. 20 Hình 1.9 Chế độ vận hành khối phổ ba tứ cực............................................................ 20 Hình 2.1. Cấu tạo đầu dò khối phổ Triple Quad Agilent............................................. 26 Hình 2.2. Nguyên tắc hoạt động của cột SPE (SCX) ................................................. 32 Hình 3.1. Sắc kí đồ khảo sát....................................................................................... 40 Hình 3.2. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là Methanol, CH3COONH4 10 mM................................................................................ 41 Hình 3.3. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là Acetonitrile: nước: acetic acid ................................................................................... 42 Hình 3.4. Sắc đồ của Ochratoxin A nồng độ 2,5ppb khi dùng dung môi pha động là Acetonitrile: nước:Acid Formic ................................................................................. 42 Hình 3.5. Sắc đồ rửa giải tại tốc độ dòng 0,1ml/phút.................................................. 43 Hình 3.6. Sắc đồ rửa giải tại tốc độ dòng 0,2ml/phút.................................................. 43 Hình 3.7. Sắc kí đồ cột chiết Mycosep 228 Romer ..................................................... 47 Hình 3.8. Sắc kí đồ cột chiết C18 .............................................................................. 48 Hình 3.9. Sắc kí đồ cột chiết Ochra Test .................................................................... 48 Hình 3.10. Sắc kí đồ chất chuẩn OTA 2,5ppb ............................................................ 50 Hình 3.11. Sắc kí đồ mẫu trắng .................................................................................. 50 Hình 3.12. Sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn 2,5 ppb .................................................. 51 Hình 3.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích Peak vào nồng độ OTA......... 51 Hình 3.14. Đường chuẩn của OTA............................................................................ 52 x Hình 3.15. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1 ng/ml .................................................................. 53 Hình 3.16. Sắc kí đồ chuẩn OTA 10 ng/ml ................................................................ 53 Hình 3.17. Sắc kí đồ chuẩn OTA 50 ng/ml ................................................................ 53 Hình 3.18. Sắc kí đồ chuẩn OTA 100 ng/ml............................................................... 54 Hình 3.19. Sắc kí đồ chuẩn OTA 200 ng/ml............................................................... 54 Hình 3.20. Sắc kí đồ chuẩn OTA 300 ng/ml............................................................... 54 Hình 3.21. Sắc kí đồ chuẩn OTA 500 ng/ml............................................................... 55 Hình 3.22. Sắc kí đồ chuẩn OTA 1000 ng/ml............................................................. 55 Hình 3.23. Sắc kí đồ mẫu thêm chuẩn OTA 5 ng/ml .................................................. 57 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cùng với sự phát triển khoa học công nghệ, kinh tế - xã hội việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe, nâng cao chất lượng cuộc sống của con người ngày càng được quan tâm, trong đó có vấn đề an toàn thực phẩm. Bảo đảm nguồn thực phẩm an toàn sẽ góp phần bảo vệ và cải thiện sức khỏe, chất lượng cuộc sống và giống nòi dân tộc. An toàn thực phẩm không chỉ ảnh hưởng trực tiếp, thường xuyên đến sức khỏe mà còn liên quan chặt chẽ đến năng suất, hiệu quả phát triển kinh tế, thương mại, du lịch và an sinh xã hội. Đảm bảo an toàn thực phẩm góp phần quan trọng thúc đẩy phát triển kinh tế xã hội, xoá đói giảm nghèo và hội nhập quốc tế. Tuy nhiên, công tác bảo đảm an toàn thực phẩm luôn là một thách thức không chỉ với các nước đang phát triển mà ngay cả với các nước phát triển. Sự đa dạng của các chủng loại thực phẩm, công nghệ, các chất phụ gia, các chất hỗ trợ chế biến, các chất ô nhiễm thực phẩm luôn được cải tiến, bổ sung .... là thách thức đối với hệ thống quản lý, kiểm soát an toàn thực phẩm, đặc biệt đối với các phòng kiểm nghiệm. Do đó, việc nâng cao năng lực hệ thống phòng kiểm nghiệm an toàn thực phẩm đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong công tác quản lý an toàn thực phẩm của mỗi Quốc gia, nhất là trong giai đoạn hội nhập kinh tế toàn cầu hiện nay. Đắk Lắk được mệnh danh là thủ phủ cà phê của Việt Nam, sản phẩm cà phê Buôn Ma Thuột hiện nổi tiếng đã có mặt ở gần 80 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới, đóng góp lớn vào tổng giá trị xuất khẩu cà phê của cả nước; góp phần quan trọng đưa kim ngạch xuất khẩu cà phê Việt Nam năm 2018 lên hơn 3,5 tỷ USD [43] . Ở Đắk Lắk gần như huyện nào cũng có trồng cà phê, nhưng cà phê Buôn Ma Thuột vẫn luôn được đánh giá là có chất lượng cao nhất và có hương vị đặc trưng nhất được giới hâm mộ và các nhà rang xay cà phê đánh giá cao. Từ đó, Buôn Ma Thuột hay được ví như một "thủ phủ cà phê". Cây cà phê chiếm giữ một vị trí độc tôn, không loại cây trồng nào sánh được trên cao nguyên đất đỏ bazan này. Trong cơ cấu cây trồng ở Buôn Ma Thuột, có đủ các loài cà phê như: cà phê chè, cà phê vối, cà phê mít nhưng được trồng rộng rãi nhất là cà phê vối. Hiện tại thương hiệu cà phê Buôn Ma Thuột đã được dùng chung cho cà phê Đắk Lắk. Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê đồng thời chế biến chúng thành những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ gìn các giá trị dinh dưỡng, ngăn cản các chất độc hại cao đang ngày càng được quan tâm. Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể và là rào cản đối với thương mại ảnh hưởng đến nền kinh tế của cả nước. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên cà phê. 2 Ochratoxin A (OTA) là một chất chuyển hóa thứ cấp được sinh ra bởi các chủng nấm mốc thuộc các giống Aspergilus ochraceus và Penicillium verrucusum. Theo tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC) thì Ochratoxins được xếp vào loại chất có khả năng gây ung thư nhóm IIB. Độc tố này đã được phát hiện trên nhiều nông sản khác nhau bao gồm ngũ cốc và các sản phẩm của chúng và là loại độc tố có tiềm năng gây ung thư và viêm thận ở người và động vật. Điều đáng lo ngại là khi chúng ta ăn phải thức ăn bị nhiễm Ochratoxins nó không gây ngộ độc cấp tính mà tích lũy dần trong cơ thể - là nguy cơ tiềm ẩn đe dọa sức khỏe cho con người. Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống đã được coi là một vấn đề quan trọng. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO) cũng như Bộ Nông nghiệp, Bộ Y Tế của nhiều nước đã đưa ra những chương trình khuyến cáo về độc tố nấm mốc và xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn cho phép của độc tố nấm mốc trên lương thực. Để kiểm soát mức độ nhiễm Ochratoxins trong thực phẩm, ở Việt Nam cũng như trên thế giới đã có nhiều phương pháp phân tích được nghiên cứu và ứng dụng. Nhưng với những đặc điểm ưu việt và độ chính xác cao nên các phương pháp phân tích sắc ký lỏng khối phổ được coi là phương pháp phân tích có giá trị pháp lý để phát hiện và định lượng nồng độ Ochratoxins ở lượng vết hay siêu vết. Xuất phát từ tính cấp thiết của xã hội và tính ưu việt của phương pháp phân tích, tôi xây dựng phương pháp nghiên cứu: "Xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) và đề xuất giải pháp nhằm đảm bảo chất lượng an toàn thực phẩm tại địa bàn Buôn Ma Thuột”. 2. Mục tiêu của đề tài - Mục tiêu chung: + Xây dựng được phương pháp phân tích dư lượng của Ochratoxin A trong cà phê bột bằng kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ đạt độ nhạy cao, đáp ứng được nhu cầu phân tích của các đơn vị kiểm nghiệm trong nước. + Khảo sát mức độ tồn lưu dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột và đề xuất giải pháp đảm bảo chất lượng cà phê bột tại địa bàn Buôn Ma Thuột với mong muốn góp phần với các cơ quan chức năng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng trong nước. - Mục tiêu cụ thể: + Khảo sát các điều kiện trên máy sắc ký lỏng hai lần khối phổ; + Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu; 3 + Thẩm định phương pháp đã xây dựng; + Phân tích mẫu thực; + Đề xuất giải pháp đảm bảo chất chất lượng cà phê bột. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu 3.1. Ý nghĩa khoa học Thẩm định phương pháp phân tích phù hợp. Kết quả của thẩm định phương pháp được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xây dựng phương pháp xác định dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS), chứng minh rằng phương pháp đáp ứng được các yêu cầu đặt ra. - Thực hiện phương pháp này vào việc phân tích dư lượng Ochratoxin A trong cà phê bột tại Trung tâm kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm khu vực Tây Nguyên; - Nghiên cứu này sẽ góp phần vào việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê 1.1.1. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê tại địa bàn tỉnh Đăk Lăk[42] Theo số liệu của Cục Thống kê tỉnh Đắk Lắk, trong niên vụ 2017 - 2018, diện tích cà phê toàn tỉnh là 204.808 ha, tăng 1.071 ha so với niên vụ trước. Trong đó, diện tích cho sản phẩm 187.279 ha, năng suất bình quân đạt 24,55 tạ/ha. Tổng sản lượng ước đạt 459.785 tấn, tăng 11.975 tấn so với niên vụ 2016 2017.Sản lượng cà phê tỉnh Đắk Lắk niên vụ 2017 - 2018 tăng tăng gần 12.000 tấn Toàn tỉnh có 12 công ty được cấp giấy chứng nhận quyền sử dụng Chỉ dẫn địa lý Buôn Ma Thuột, với tổng diện tích trên 15.600 ha, sản lượng đăng ký 48.691 tấn/năm. Tính đến hết niên vụ 2017 - 2018, các địa phương thực hiện tái canh cà phê được 26.818 ha, riêng năm 2018 thực hiện tái canh được 4.862 ha. Về hoạt động chế biến và xuất khẩu, niên vụ 2017 - 2018 Đắk Lắk có 301 cơ sở chế biến cà phê, tăng 41 cơ sở so với niên vụ 2016 - 2017. Xuất khẩu cà phê đạt 191.169 tấn, giảm 9.993 tấn. Kim ngạch xuất khẩu đạt 365 triệu USD, giảm 80,23 triệu USD so với niên vụ trước. Dự kiến niên vụ 2018 - 2019, diện tích cà phê trên địa bàn tỉnh là 204.577 ha, giảm 231 ha so với niên vụ 2017 - 2018. Năng suất bình quân ước đạt 24,46 tạ/ha; tổng sản lượng ước khoảng 464.175 tấn. Tuy nhiên, nhiều vùng trồng cà phê khác ở Tây Nguyên đang phải đối diện với thách thức mất mùa trong khi giá giảm.Vùng chuyên canh cà phê lớn nhất Việt Nam đang đối mặt với nhiều thách thức như cà phê già cỗi, giá giảm và mất mùa trong niên vụ này. Niên vụ 2017-2018 do sự tác động của biến đổi khí hậu, quá trình tái canh, chuyển đổi cơ cấu cây trồng là một năm khó khăn cho xuất khẩu cà phê của Đắk Lắk, với giá xuất khẩu liên tục giảm kể từ đầu vụ dẫn đến số lượng và kim ngạch đều giảm so với niên vụ 2016-2017. Công tác tái canh diễn ra chậm và gặp nhiều khó khăn về vốn đối với cả nông dân và một số doanh nghiệp sản xuất cà phê trên địa bàn tỉnh... Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, quan điểm của tỉnh Đắk Lắk là không tăng diện tích cà phê ngoài quy hoạch, tập trung tái canh cà phê theo kế hoạch đã được UBND tỉnh phê duyệt, nâng cao năng suất, sản lượng, chất lượng nhằm đáp ứng nhu cầu xuất khẩu. Đặc biệt, tỉnh sẽ quan tâm đến việc phát triển sản phẩm cà phê đặc sản của Đắk Lắk. Cây cà phê vẫn là cây trồng chủ lực và cà phê là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của tỉnh. Đặc biệt, trong niên vụ 2017-2018, Đắk Lắk đã phát triển được sản phẩm 5 cà phê đặc sản, đây là hướng phát triển mới, phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trên thế giới. Trong niên vụ sắp tới, các địa phương chú trọng nâng cao năng suất, chất lượng cà phê trên địa bàn; khuyến khích các nông hộ đầu tư, ứng dụng khoa học kỹ thuật vào canh tác và trồng xen; phát triển nhiều hơn nữa các vùng trồng cà phê đặc sản; tăng cường kêu gọi, thu hút các nhà đầu tư vào chế biến sâu; cần thúc đẩy tiêu thụ thị trường trong nước; đẩy mạnh bảo hộ cà phê có Chỉ dẫn địa lý Buôn Ma Thuột trên các thị trường nước ngoài, đồng thời tận dụng các nguồn nhân lực, tài chính, chính sách của các tổ chức, hiệp hội, doanh nghiệp để đưa tiến bộ khoa học vào sản xuất, nâng cao năng suất, chất lượng sản phẩm. 1.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của Việt Nam [41] Tình hình sản xuất Theo cập nhật mới nhất từ Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA), sản lượng cà phê xanh của Việt Nam trong năm mùa vụ 2018 - 2019 tăng khoảng 2% lên 30,4 triệu bao. Bên cạnh đó, USDA cũng nâng dự báo xuất khẩu cà phê xanh năm 2018 - 2019 của Việt nam lên 25,5 triệu bao, so với mức 25,2 triệu bao trước đó. Trong năm 2017 - 2018, USDA điều chỉnh ước tính xuất khẩu của Việt nam lên 27,9 triệu bao từ con số chính thức 27,7 triệu bao. Nguyên nhân của sự gia tăng là giá xuất khẩu thấp. Tiêu thụ Theo Bộ Công Thương Năm 2018, xuất khẩu cà phê của nước ta đạt 1,882 triệu tấn, trị giá 3,544 tỷ USD, tăng 20,1% về lượng và tăng 1,2% về trị giá so với năm 2017. Tháng 12/2018, giá xuất khẩu bình quân cà phê của Việt Nam đạt mức 1.794 USD/tấn, giảm 3,8% so với tháng 11/2018 và giảm 10,0% so với tháng 12/2017. Năm 2018, giá xuất khẩu bình quân cà phê của Việt Nam đạt mức 1.883 USD/tấn, giảm 15,7% so với năm 2017. Trong 11 tháng năm 2018, xuất khẩu cà phê Robusta đạt 1,47 triệu tấn, trị giá 2,541 tỷ USD, tăng 31,6% về lượng và tăng 8,1% về trị giá so với 11 tháng năm 2017. Giá xuất khẩu bình quân cà phê Robusta 11 tháng năm 2018 đạt mức 1.728 USD/kg, giảm 17,8%. Trong khi đó, giá xuất khẩu bình quân cà phê hòa tan đạt 5.078 USD/tấn, tăng 3,2% so với 11 tháng năm 2017. Theo Hiệp hội Cà phê - Ca Cao Việt Nam, sản lượng cà phê Việt Nam niên vụ 2018/19 giảm khoảng 20% so với dự kiến trước đó do ảnh hưởng của biến đổi khí hậu năm 2018 và diện tích trồng cà phê giảm khoảng 6% trong năm 2017 và năm 2018 do chuyển đổi cây trồng. Hiện Việt Nam là nguồn cung cà phê lớn nhất tại Thái Lan, với tốc độ nhập khẩu tăng trưởng 75,9% về lượng trong 9 tháng, tăng cao nhất trong top 10 nguồn cung cà phê cho Thái Lan. 6 1.1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ cà phê của thế giới [41]. Tình hình sản xuất Tổ chức Cà phê Thế giới (ICO) ước tính sản lượng cà phê niên vụ 2017 - 2018 sản lượng cà phê toàn cầu ước tăng 4,8% lên 163,51 triệu bao so với năm ngoái. Như vậy, sản lượng cà phê cao hơn 3,1% so với lần dự báo ICO đưa ra ở kì trước đó. Sản lượng cà phê Arabica tăng 1,7% lên 101,23 triệu bao; cà phê Robusta tăng 10,5% lên 62,28 triệu bao. Sản lượng tăng tại tất cả khu vực sản xuất cà phê. Khu vực châu Á - Thái Bình Dương tăng trưởng mạnh nhất với sản lượng tăng 8,3% lên 47,95 triệu bao. Theo sau là Mexico - Trung Mỹ, sản lượng tăng 4,3% lên 21,34 triệu bao. Nam Mỹ, khu vực sản xuất lớn nhất thế giới, có sản lượng cà phê tăng 3,3% lên 76,98 triệu bao trong khi châu phi tăng 3,4% lên 17,25 triệu bao. Bộ Nông nghiệp Mỹ dự báo Bộ Nông nghiệp Mỹ (USDA) cho biết tại Mumbai, Ấn Độ ước tính sản lượng cà phê thấp hơn 300.000 bao 60 kg so với ước tính chính thức của USDA đưa ra trước đó là 5,5 triệu bao 60 kg cho năm 2018 - 2019. Theo USDA, sản lượng cà phê Arabica Ấn Độ đạt 1,5 triệu bao 60 kg và sản lượng cà phê Robusta đạt 3,7 triệu bao. Trong đó, tỉnh Karnataka đóng góp 70% sản lượng cà phê trên cả nước, theo sau là Kerala với 20%. Các nguồn thương mại cho biết mưa trong tháng 8 đã gây thiệt hại đang kể không chỉ đối với mùa vụ cà phê, mà còn tới những cây trồng khác như tiêu và cau, hai loại cây đang trở thành nguồn thu nhập lớn của người nông dân. Theo các hiệp hội, sản lượng cà phê mất thêm khoảng 20% so với ước tính trước đó của Cơ quan Quản lí Cà phê Ấn Độ. Sản lượng cà phê Arabica trước đó ước đạt 455 kg/ha, và cà phê Robusta là 991 kg/ha. Ấn Độ là nhà sản xuất chính các loại cà phê Robusta với gần 49% tổng sản lượng. Tiêu thụ Theo ICO, tổng xuất khẩu cà phê tăng mỗi năm kể từ 2010 - 2011 với mức kỉ lục mới đạt được năm 2017 - 2018 là 121,86 triệu bao, tăng 2% so với năm 2016 2017. Xuất khẩu cà phê mùa vụ 2017 - 2018 tăng 2% lên 121,86 triệu bao so với 119,52 triệu bao của năm ngoái, với khối lượng xuất khẩu tháng 9 đạt 9,43 triệu bao, so với 8,75 triệu bao trong cùng kì năm 2017. Trong 12 tháng kết thúc vào tháng 9/2018, tổng khối lượng xuất khẩu cà phê Arabica xanh đạt 70,95 triệu bao so với 70,51 triệu bao của năm ngoái; trong khi xuất khẩu cà phê Robusta tăng từ 38,87 triệu bao của năm 2017 lên 39,24 triệu bao. Trong tháng 9, Brazil và Colombia chiếm 60,4% tổng xuất khẩu cà phê Arabica xanh, trong khi Việt Nam chiếm 60% tổng khối lượng cà phê Robusta xuất khẩu. Năm cà phê 2017 - 2018, tổng xuất khẩu cà phê các loại tăng tại 4 trong số 10 nhà xuất khẩu lớn nhất. 7 Brazil: xuất khẩu 32,34 triệu bao cà phê, tăng so với mức 31,93 triệu bao năm 2016 - 2017. Do năm sản xuất cà phê của quốc gia này được chia làm hai niên vụ, vì vậy xuất khẩu năm 2017 - 2018 tăng phản ánh hai vấn đề đó là: Sự sụt giảm về sản lượng trong năm mùa vụ 2016 - 2017 và sự gia tăng 14,7% trong sản xuất của năm 2017 – 2018. Xuất khẩu giai đoạn tháng 4 - 8 của Brazil đạt 15,52 triệu bao, tăng 11,2% so với cùng kì năm 2017. Colombia: Ngược lại, xuất khẩu cà phê của Colombia năm 2017- 2018 giảm 5,7% xuống 12,72 triệu bao do sản lượng đi xuống hạn chế khối lượng sẵn có để xuất khẩu. Indonesia: Xuất khẩu cà phê tại Indonesia ghi nhận mức giảm lớn nhất khi khối lượng giảm từ 8,72 triệu bao năm 2016 - 2017 xuống 5,64 triệu bao năm 2017 - 2018. Sản lượng giảm cùng với nhu cầu nội địa gia tăng đã dẫn tới sự sụt giảm này. Tiêu thụ cà phê trên thế giới được ước tính tăng 1,8% so với năm ngoái lên 161,93 triệu bao trong năm 2017 - 2018. Trong đó, tăng trưởng nhanh nhất là châu Á - Thái Bình Dương, với lượng tiêu thụ trong tăng 3,1% so với năm ngoái lên 35,9%. Bắc Mỹ là khu vực có tăng trưởng tiêu thụ nhanh thứ hai với 2,6% lên 30,34 triệu bao. Còn châu Phi và Mexico - Trung Mỹ được dự báo tăng 1,7% so với năm ngoái lên lần lượt 11,08 triệu bao và 5,3 triệu bao. Tiêu thụ cà phể tại Châu Âu tăng 0,5% lên 52,32 triệu bao trong năm 2017 – 2018. 1.2. Ochratoxins 1.2.1. Các loại độc tố Ochratoxins Sau Aflatoxin thì Ochratoxins là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện. Độc tố Ochratoxins, là một sản phẩm chuyển hoá thứ cấp của một số loài nấm mốc. Ochratoxin có mặt trong khắp các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia, cà phê... trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước. Ochratoxins được biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong nhiều loại sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi. Ochratoxin A lần đầu tiên được tìm thấy ở nấm mốc A. ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott (1965) trên hạt lúa bị nhiễm A.ochraceus [38]. Hiện nay có 4 loại Ochratoxins được biết đến là Ochratoxin A, Ochratoxin B, Ochratoxin C (este etyl của ochratoxin A) và este metyl của Ochratoxin A. Công thức phân tử của Ochratoxin A: C20H18ClNO6 Ochratoxin A độc là do sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin, khi phân hủy nó tạo chất dihydro-izocumarin, đây là chất gây độc [13]. 8 Hình 1.1. Cấu trúc các Ochratoxins (R)-N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-methyl-1-oxo-1H-2-benzopyran-7yl) carbonyl]-L-phenylalanin. Trọng lượng phân tử OTA: 403,8 Điểm nóng chảy: 169°C Phổ hấp phụ UV: 2 đỉnh: 216 – 333 nm Ochratoxins là độc tố gây tác hại vào các cơ quan quan trọng của cơ thể như: thần kinh, gan, thận và hệ miễn dịch. Ochratoxin A gây hậu quả nghiêm trọng đối với người và động vật nuôi ở nồng độ cực thấp (ppb). Ochratoxin B có tính độc ít hơn ochratoxin A, tuy nhiên chúng đều là chất độc thuộc nhóm IIB theo Tổ chức nghiên cứu ung thư Quốc tế (IARC). Trong các loại trên, Ochratoxin A được nghiên cứu nhiều nhất do đặc tính gây ung thư và viêm thận cũng như sự nhiễm phổ biến của nó trên ngũ cốc. Ochratoxin A gây độc nhiều và mạnh hơn Ochratoxin B và Ochratoxin C do đó được xem là đối tượng chính cho việc xác định Ochratoxin [3]. Trong khuôn khổ luận văn này tôi quan tâm nghiên cứu đến Ochratoxin A. 1.2.2. Tính chất hoá lý của độc tố Ochratoxins Ochratoxins là độc tố tinh thể không màu, bền với nhiệt, tan trong dung môi hữu cơ phân cực như chloroform, methanol, …, ít tan trong nước và tan trong đệm carbonat loãng. Ochratoxins rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất. Độc tố được sản sinh nhiều nhất ở nhiệt độ từ 20-25°C. Sự sản sinh Ochratoxins phụ thuộc chủng nấm mốc, hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ. Ochratoxins dễ bị phân hủy bởi ánh sáng, trong môi trường kiềm hoặc chất tẩy rửa [6]. Ochratoxin A phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực đại tại 365nm. Ochratoxin A có điểm nóng chảy ở 169 0C. Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các Peak có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1 OTA có tính axit yếu pKa1 = 4,2-4,4 và pKa2 = 7,0- 7,3. Ochratoxin A phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị sắc ký lớp mỏng chiếu tia UV ở 366 nm.