Tài liệu Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật và ly trích enzyme để chuyển hóa lipid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA CÔNG NGHỆ ----- o0o ----- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ HÓA HỌC ĐỀ TÀI: BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY VI SINH VẬT VÀ LY TRÍCH ENZYME ĐỂ CHUYỂN HÓA LIPID GVHD: SVTH: TS. LÊ THANH PHƯỚC ĐÀO THỊ PHƯƠNG THẢO ThS. NGUYỄN THỊ PHI OANH MSSV: 2041670 LÊ THỊ THÙY LINH MSSV: 2041638 CẦN THƠ, THÁNG 12 NĂM 2008 LỜI CẢM ƠN Chúng em xin chân thành gửi lời cảm tạ và lòng biết ơn sâu sắc đến: Thầy Lê Thanh Phước đã hướng dẫn, truyền thụ kinh nghiệm và những tri thức khoa học, tạo điều kiện tốt giúp em hòan thành luận văn tốt nghiệp. Cô Nguyễn Thị Phi Oanh đã tận tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức ban đầu về đề tài và tạo điều kiện giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài. Chúng em xin chân thành cám ơn các thầy, cô ở bộ môn Hóa và bộ môn Sinh, khoa Khoa Học, trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ chúng em về phương tiện nghiên cứu cũng như kiến thức. Chân thành cám ơn thầy Chơn, anh chị ở bộ môn Sinh - Hóa, khoa Nông Nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện cho chúng em hoàn thành luận văn. Chúng em xin cảm ơn cô Thoa và các anh, chị học viên cao học đang làm việc tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, khoa Khoa Học đã giúp đỡ chúng em trong quá trình thực hiện đề tài. Và người mà chúng em ngàn lần biết ơn đó là cha mẹ, người luôn sát cánh động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em hoàn thành luận văn. Cần Thơ, Ngày 27 tháng 11 năm 2008 Đào Thị Phương Thảo Lê Thị Thùy Linh MỤC LỤC ----- o0o ----- LỜI CẢM TẠ MỤC LỤC DANH SÁCH BẢNG DANH SÁCH HÌNH TÓM LƯỢC Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.............................................................................3 I. Giới thiệu lipase.....................................................................................................3 I.1. Lipase...........................................................................................................3 I.2. Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lipase ...............................4 I.3. Phương pháp tách và làm sạch lipase trong nghiên cứu..............................4 I.4. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzym ..................................7 II. Lipid .....................................................................................................................8 II.1. Khái niệm ...................................................................................................8 II.2. Phân loại.....................................................................................................8 II.3. Tính chất vật lý và hóa học của lipid .........................................................9 III. Nguyên liệu sản xuất một số lipase quan trọng .................................................15 III.1. Lipase từ động vật.....................................................................................17 III.2. Lipase từ thực vật......................................................................................18 III.3. Lipase từ vi sinh vật .................................................................................18 IV. Ứng dụng của lipase ...........................................................................................23 IV.1. Lipase trong công nghiệp chất tẩy rửa......................................................23 IV.2. Lipase trong công nghiệp thực phẩm .......................................................23 IV.3. Lipase trong công nghiệp giấy .................................................................23 IV.4. Lipase trong tổng hợp hữu cơ...................................................................24 Chương 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..........................25 I. Phương tiện nghiên cứu.........................................................................................25 I.1. Địa điểm thu mẫu và thời gian thí nghiệm ..................................................25 I.2. Nguyên liệu .................................................................................................25 I.3 Dụng cụ và thiết bị .......................................................................................27 I.4. Hóa chất.......................................................................................................28 II. Phương pháp nghiên cứu......................................................................................28 II.1. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu................................................................28 II.2. Nuôi cấy vi sinh vật đất..............................................................................30 II.3. Khảo sát sự chuyển hóa của lipid với xúc tác lipase..................................38 II.4. Kết tủa lipase thô........................................................................................39 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.....................................................................41 I. Kiểm tra chất lượng nguyên liệu ...........................................................................41 II. Sự hiện diện của vi sinh vật thủy phân dầu trong đất ..........................................43 II.1. Sự sinh trưởng của vi sinh đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không có dầu ............................................................................................................................43 II.2.Sự sinh trưởng của vi sinh vật trong môi trường agar có hoặc không có dầu ............................................................................................................................47 II.3. Định lượng acid sinh ra do sự thủy phân dầu từ lipase của vi sinh vật .....49 II.4. Mật số vi sinh vật .......................................................................................55 II.5. Enzyme do vi sinh vật sinh ra tham gia quá trình thủy phân lipid ............56 III. Sự chuyển hóa của lipid với xúc tác lipase.........................................................58 IV. Chế phẩm enzym thô từ vi sinh vật ....................................................................64 IV.1. Thu chế phẩm enzym thô..........................................................................64 IV.2. Thử hoạt tính enzym thô...........................................................................64 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................66 I. Kết luận ..................................................................................................................66 II. Đề nghị..................................................................................................................66 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH SÁCH BẢNG BIỂU ----- o0o ----Bảng 1: Một số nguồn enzym và enzym quan trọng..........................................................16 Bảng 2: Kết quả dùng KOH để trung hòa acid béo tự do trong dầu ..................................41 Bảng 3: Thể tích HCl 0.1 M để trung hòa KOH 0.1 N thừa ..............................................41 Bảng 4: Thể tích Na2S2O3 0.01N dùng để chuẩn độ lượng Iod thừa.................................42 Bảng 5: Tổng hợp chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa và chỉ số Iod của các loại dầu ..........42 Bảng 6: Lượng lipase sinh ra ở các mẫu sau 24 và 48 giờ .................................................51 Bảng 7: Hoạt độ của lipase do VSV tạo ra (U/ ml) khi nuôi cấy trong môi trường có dầu và không dầu sau 24 và 48 giờ ..........................................................................................53 Bảng 8: Mật số VSV theo thời gian (OD 600 nm).............................................................55 Bảng 9: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 30 phút...............................56 Bảng 10: Thể tích NaOH 0,05 M dùng để chuẩn độ các mẫu nuôi cấy với các loại dầu sau 60 phút.......................................................................................................................... 57 Bảng 11: Hoạt độ của enzyme trong phản ứng thủy phân sau 60 phút..............................57 Bảng 12: Thể tích NaOH 0.05 M dùng để chuẩn độ các loại dầu và hoạt độ của lipase ngoại bào sau 30 phút .........................................................................................................58 Bảng 13: Họat tính của lipase ngoại bào theo thời gian được định lượng bằng NaOH 0.05M..................................................................................................................................59 Bảng 14: Họat độ lipase ngoại bào theo thời gian..............................................................59 Bảng 15 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 1 ở các thời điểm khảo sát ........................62 Bảng 16 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 1b ở các thời điểm khảo sát ......................62 Bảng 17 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 2 ở các thời điểm khảo sát .......................63 Bảng 18 : Giá trị Rf của các vết chấm của dầu 4 ở các thời điểm khảo sát ........................63 Bảng 19: Hàm lượng lipase ngoại bào thô thu được ở các mẫu.........................................64 Bảng 20: Hoạt độ của lipase thô ngoại bào sau 30 phút.....................................................64 DANH SÁCH HÌNH ẢNH ----- o0o ----Hình 1: Sự sinh trưởng của vi sinh vật đất trong môi trường lỏng khi có hoặc không có dầu ......................................................................................................................................43 Hình 2: Sự sinh trưởng của VSV ở đất chưa nhiễm dầu ở Cồn Ấu, Cần Thơ khi nuôi trong môi trường có các loại dầu đã sử dụng...............................................................................44 Hình 3: Sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất Bến Tre khi nuôi trong môi trường dầu tương ứng..................... ....................................................................................................45 Hình 4: Sự sinh trưởng của VSV ở mẫu đất chưa nhiễm dầu ............................................46 Hình 5: sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất đã nhiễm dầu qua sử dụng trên môi trường có và không bổ sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ ................................................................47 Hình 6: Sự sinh trưởng của VSV đất Cồn Ấu, Cần Thơ trên môi trường có và không bổ sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ..........................................................................................48 Hình 7: Sự sinh trưởng của VSV ở các mẫu đất đã nhiễm dầu chưa sử dụng trên môi trường có và không bổ sung dầu đã sử dụng sau 24 giờ. ..................................................49 Hình 8: Màu đối chứng của acid với chất chỉ thị màu heliantin ........................................50 Hình 9: Sự chuyển màu trên bề mặt môi trường nuôi cấy VSV trong các mẫu đất ở Cần Thơ khi có hoặc không có sự hiện diện của dầu với chất chỉ thị heliantin ........................51 Hình 10: Sự chuyển màu trên bề mặt môi trường nuôi cấy VSV trong các mẫu đất ở Bến Tre khi có hoặc không có sự hiện diện của dầu với chất chỉ thị heliantin .........................51 Hình 11: Họat độ của lipase ngoại bào theo thời gian đối với dầu chưa sử dụng..............60 Hình 12: Họat độ của lipase ngoại bào theo thời gian đối với dầu đã sử dụng..................60 Hình 13: Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng của mẫu nuôi cấy từ dầu chưa sử dụng (dầu 1b và 2) ...............................................................................................................................61 Hình 14: Kết quả phân tích sắc ký bản mỏng của mẫu nuôi cấy từ dầu đã sử dụng (dầu 1 và 4) ....................................................................................................................................62 TÓM LƯỢC Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật từ những mẫu đất nhiễm dầu, dầu mỡ đã qua sử dụng và chưa sử dụng ở hai tỉnh Cần Thơ và Bến Tre để ly trích lipase thô nhằm thực hiện chuyển hóa lipid, chúng tôi nhận thấy hệ vi sinh vật trong các mẫu đất khảo sát có khả năng thủy phân các loại dầu này. Tuy nhiên, hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đã nhiễm dầu có khả năng thủy phân dầu cao hơn hệ vi sinh vật trong các mẫu đất đối chứng. Vi sinh vật trong các mẫu đất có mật số cao ở 72 giờ khi được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung dầu. Trong các mẫu khảo sát, nhìn chung, lipase do vi sinh vật trong các mẫu đất đã nhiễm dầu tổng hợp có hoạt tính cao sau 24 giờ nuôi cấy. Lipase do vi sinh vật được nuôi trong môi trường có bổ sung dầu tổng hợp vẫn hiện diện trong tế bào (lipase nội bào), một phần được tiết ra môi trường nuôi cấy tham gia vào quá trình thủy phân lipid (lipase ngoại bào). Hàm lượng lipase thô ngoại bào thu được là 20, 29, 24 và 16 mg/ml tương ứng với hoạt độ 56.7, 94,5, 65.0 và 94,5 U/ml khi nuôi cấy vi sinh vật trong môi trường có các mẫu dầu 1, 4, 2 và 1b, theo thứ tự. LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Chất xúc tác sinh học - enzyme là những hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học cao. Với bản chất là protein, enzyme xúc tác các phản ứng đến cùng tạo ra 100% sản phẩm, đồng thời không tạo ra sản phẩm phụ, tốn ít năng lượng nhất và thân thiện với môi trường… Ngày nay, gần 4000 enzyme đã được phát hiện và nghiên cứu trong đó khoảng 200 loại được sử dụng trên thị trường. Phần lớn enzyme trong công nghiệp có nguồn gốc từ vi sinh vật. Vào những năm 1960, tổng enzyme bán được chỉ có vài triệu đô la hàng năm, nhưng đến nay thị trường đã phát triển ngoạn mục do những hiểu biết về sản xuất chất xúc tác sinh học và quá trình lên men, các phương pháp ly trích được cải tiến và nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng cao. Hơn nữa, đặc tính xúc tác enzyme không giống nhau, do đó số enzyme hiện nay có mặt trên thị trường cũng tăng gấp nhiều lần [17]. Trên thế giới, khoảng 60% trong số enzyme công nghiệp được sản xuất ở Châu Âu trong đó 75% của tổng enzyme công nghiệp (gồm cả lipase) có hoạt tính thủy phân [17]. Ở Việt Nam, việc ứng dụng enzyme làm chất xúc tác trong công nghiệp vẫn còn rất mới. Trước đây các enzyme thường được trích từ động vật và thực vật nên quy trình sản xuất còn gặp nhiều khó khăn và giá thành khá đắt. Trong 30 năm gần đây, các nhà khoa học đã và đang quan tâm đến nguồn enzyme vô cùng phong phú và rẻ tiền là enzyme từ vi sinh vật. Nguồn enzyme này có những ưu điểm như: vi sinh vật tổng hợp enzyme có tốc độ sinh trưởng nhanh, enzyme ly trích có hoạt tính cao, nguyên liệu dùng để sản xuất rẻ tiền, dễ kiếm, nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào thời tiết và có thể thực hiện ở qui mô công nghiệp. Lipase là một nhóm của enzyme có khả năng xúc tác quá trình thủy phân của triglycerol và xúc tác một số phản ứng của transeter hóa dưới những điều kiện nhất định [8]. Lipase cũng tham gia vào chu trình hòa tan các chất hữu cơ không hòa tan trong tự nhiên và tổng hợp được những sản phẩm có giá trị cao, có lợi thế hơn những sản phẩm truyền thống. Chu kỳ của những vật liệu này gọi là “công nghệ làm sạch”, là những vật liệu tổng hợp sử dụng và tái sử dụng đã và đang mang lại sự gia tăng rất lớn những sản Trang 1 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ phẩm dự trữ cần thiết cho những hoạt động của con người. Nhóm lipase này tham gia vào sự chuyển hóa sinh học của những cơ chất kỵ nước tạo thành những sản phẩm hữu ích. Sử dụng những lipase tạo ra từ vi sinh vật để xử lí và phân hủy chất béo và dầu ở dạng thô, được xem là một chiến lược rất thú vị, những sản phẩm mới này có ưu thế trong ứng dụng công nghiệp, nó có khả năng phân hủy mỡ và dầu trong nước thải và khử quá trình xử lí sơ bộ [18]. Trong những năm gần đây, lipase được sử dụng nhiều trong công nghiệp như: bột giặt, công nghiệp giấy, tổng hợp chất hữu cơ…. Trong tương lai, triển vọng ứng dụng các thuộc tính vốn có của lipase sẽ được phát huy xa hơn nhờ vào thành tựu của công nghệ sinh học và công nghệ hóa học. Lipase có nguồn gốc từ động vật, thực vật và vi sinh vật, tuy nhiên phần lớn các lipase thương mại thì có nguồn gốc từ vi sinh vật (R.Sharma et al, 2001). Các vi sinh vật tổng hợp lipase hiện diện trong nước thải công nghiệp, trong đất ở những nơi sản xuất dầu ăn, đất nhiễm dầu (Sztajer et al., 1998). Trong môi trường đất, vi sinh vật có khả năng tổng hợp lipase rất phổ biến (W.H. Ko, I.T.Wang & P.J Ann, 2005), đây là nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ tìm. Với những ưu điểm và khả năng ứng dụng của lipase, mục tiêu của đề tài là: “Bước đầu nghiên cứu nuôi cấy vi sinh vật đất để ly trích lipase và thực hiện chuyển hóa lipid”. Các nội dung nghiên cứu bao gồm: - Chọn lọc và gia tăng mật số vi sinh vật phân hủy dầu từ những nguồn đất nhiễm dầu - dầu mỡ đã qua sử dụng và chưa sử dụng - Xác định thời gian nuôi cấy đạt mật số vi sinh vật cao nhất - Xác định lipase do vi sinh vật tổng hợp để thủy phân chất béo là lipase nội bào hay ngoại bào - Khảo sát phản ứng thủy phân từ nguồn lipase thu được - Ly trích lipase thô từ nguồn vi sinh vật đã nuôi cấy - Thực hiện sự chuyển hóa lipid từ chế phẩm lipase thô thu được Trang 2 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu lipase 1.1. Lipase Lipase (triacylglycerol acylhydrolase) là nhóm enzyme xúc tác phản ứng thủy phân triacylglycerols thành diacylglycerols, monoacylglycerols, các acid béo và glycerol ở bề mặt phân cách pha giữa nước và lipid. Lipase xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên kết ester trong phân tử mà không cắt đứt cả ba liên kết ester cùng một lúc. Một vài lipase không có tính đặc hiệu, chúng xúc tác phản ứng ở tất cả các vị trí trong triacylglycerols. Phần lớn lipases có tính đặc hiệu và tính chọn lọc, các enzyme này xúc tác phản ứng bằng cách bám vào các vị trí đặc biệt trên phân tử [7]. Phản ứng thủy phân với xúc tác lipase có thể làm dịch chuyển phản ứng thủy phân của liên kết glycerol ester và tổng hợp những glycerol ester. Phản ứng được minh họa như sau: [8]. Lipase Esterification R1COOR2 + H2O R1COOH + R2OH hydrolysis Tùy theo mục đích tổng hợp và tùy vào tính đặc hiệu của lipase. Phản ứng thủy phân có thể xảy ra theo cơ chế sau [14] O O C O O C O O TG C R OH lipase R R lip lipase O O C O R O C R 1,2-DG as e O O C R OH lip as acyl migration OH 2-MG e lip as e acyl migration O O C OH OH R lipase lipase OH OH O O 1,3-DG C R O OH O C 1-MG R OH glycerol Trang 3 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Lipase có thể xúc tác phản ứng thuận nghịch để hình thành các sản phẩm khác nhau. Hiểu được cơ chế hoạt động của lipase giúp chúng ta có thể kiểm soát được sản phẩm tạo ra để đạt hiệu suất cao nhất. 1.2. Ưu và nhược điểm của phản ứng thủy phân với lipase [6] a. Ưu điểm - Do lipase có tính đặc hiệu cao nên không tạo thành sản phẩm phụ, dịch thủy phân thu được có độ thuần khiết cao. - Phản ứng thủy phân bởi enzyme tiến hành ở nhiệt độ thấp và pH cao, nghĩa là ở điều kiện tạo thành rất ít tạp chất. Do đó vừa giảm được yêu cầu về độ thuần khiết của nguyên liệu, vừa có hiệu xuất cao. - Khi thủy phân bằng enzyme còn cho phép điều chỉnh được thành phần hóa học của sản phẩm - Lipase có thể thủy phân trong điều kiện nồng độ cơ chất rất cao do đó giảm được chi phí hơi. b. Nhược điểm - Thời gian thủy phân của lipase dài hơn so với acid. - Dung dịch do lipase thủy phân thường khó lọc hơn khi thủy phân bằng acid, do có chu kỳ sản xuất kéo dài. - Muốn có hiệu suất cao và chất lượng sản phẩm tốt phải có chế phẩm enzyme tinh khiết. 1.3. Phương pháp tách và làm sạch lipase trong nghiên cứu [19] Enzyme là một loại protein tổng hợp trong tế bào. Phần lớn chúng tồn tại trong tế bào do các enzyme thường không có khả năng di chuyển qua màng tế bào. Ly trích enzyme ra khỏi tế bảo rất khó bởi vì: Hàm lượng enzyme trong tế bào sinh vật không lớn so với các thành phần khác. Do đó việc tách để thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó. Hơn nữa enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài như nhiệt độ, pH… Do bản chất là protein, enzyme thường liên kết với những loại protein khác không có thuộc tính của một enzyme nhưng các protein này lại có đặc tính lý hóa tương tự enzyme. Trang 4 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Như vậy việc ly trích enzyme là làm sao loại được các protein không phải enzyme, nước, và các thành phần khác của tế bào ra khỏi enzyme. Một trong những phương pháp tinh sạch enzyme hiện nay được sử dụng: a. Phương pháp gây biến tính chọn lọc Phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH, làm biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu acid và bền nhiệt. Ở điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp, enzyme sẽ bị biến tính. Sau đó bằng phương pháp ly tâm hoặc phương pháp lọc ta có thể loại bỏ các thành phần không phải là enzyme mà ta mong muốn. b. Phương pháp kết tủa phân đoạn Trong các phương pháp tinh sạch enzyme, phương pháp kết tủa là hữu dụng nhất và phù hợp với các qui mô sản xuất lớn và nhỏ. Phương pháp kết tủa gồm có 4 loại: kết tủa bằng các dung dịch muối, kết tủa bằng dung môi hữu cơ, kết tủa với sự thay đổi pH, và kết tủa bằng dung môi nước polymer. ™ Kết tủa bằng dung dịch muối Ở nồng độ muối thích hợp, tính tan trong nước của các phân tử kích thước lớn tương tự các protein tăng. Hơn nữa, khi tăng nồng độ muối sẽ làm kết tủa protein. Dung dịch muối phụ thuộc vào pH và nhiệt độ. Các enzyme hòa tan ít nhất quanh điểm đẳng điện của chúng và một ít hòa tan thấp hơn trong dung dịch đệm, nói cách khác là trong sự có mặt của muối. Về nhiệt độ, các protein nhìn chung kết tủa ở nhiệt độ cao trong dung dịch đệm. Các muối được dùng để kết tủa enzyme như: (NH4)2SO4; Na2SO4; K2SO4; MgSO4…sự hòa tan của các loại muối này phụ thuộc vào nhiệt độ và các loại muối không ảnh hưởng đến thuộc tính tự nhiên của enzyme. Dựa vào khả năng kết tủa của các enzyme ở các nồng độ muối khác nhau, người ta thường sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Ngoài ra một số dung môi hữu cơ được sử dụng để kết tủa enzyme. Phương pháp kết tủa này thường làm enzyme biến tính rất nhanh. Vì thế trước khi tiến hành kết tủa, người ta phải làm sạch các chất kết tủa và cả dung dịch enzyme. (NH4)2SO4 có hiệu quả nhất cho quá trình kết tủa do chúng có Trang 5 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ thể hòa tan ở bất kỳ nhiệt độ nào và giá thành lại thấp. (NH4)2SO4 cũng hữu ích cho tính bền các enzyme. ™ Quá trình kết tủa bằng dung môi Nước có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, isopropanol và acetone. Sự hòa tan của các enzyme kết tủa là do sự kết tủa của các dung môi nước chứa chất không dẫn điện và nói cách khác nước hình thành quanh các protein. Các dung môi hữu cơ có thể làm dịch chuyển các lipid lân cận đến một protein. Quá trình kết tủa bằng dung môi hữu cơ bị ảnh bởi nhiệt độ, liên kết ion và pH của dung dịch đệm. Các protein phổ biến được kết tủa khoảng 40% trong rượu, nhưng protein với bề mặt kỵ nước như lipase thì tan với ở những điều kiện sau: Nồng độ rượu từ 80 – 90% là cần thiết cho quá trình kết tủa lipase. Nồng độ protein cao hơn 1 mg/ml và dung dịch đệm thấp hơn 50 mM. Dung dịch và dung môi hữu cơ được giữ ấm và hỗn hợp được giữ dưới 0°C trong quá trình thêm dung môi hữu cơ. ™ Quá trình kết tủa bằng cách thay đổi pH Có hai cách kết tủa bởi sự thay đổi pH, kết tủa ở điểm đẳng điện và kết tủa thuộc tính acid. Tuy nhiên, kết tủa thuộc tính acid chỉ thích hợp cho những protein bền, các protein thô thì không bền trong giới hạn acid. ™ Quá trình kết tủa bằng dung dịch nước polymer Quá trình kết tủa bằng dung dịch nước polymer là một phương pháp đơn giản cho sự kết tủa và sự kết dính của protein. Nhiều protein dễ kết tủa khi có sự hiện diện của các dung dịch nước polymer không ion như polyethylene glycerol (PEG 2000, 4000, 6000), methyl celluso, polyvinyl alcohol (PVA) và dextrans (DEX). Các dung môi nước polymer có khả năng lấy nước từ xung quanh các protein. Các protein liên kết với các polymer bằng liên kết hydro, và sau đó hỗn hợp kết tủa như một chất rắn hoặc đôi khi là một chất sền sệt. c. Phương pháp hấp thụ chọn lọc Chất hấp thụ có thể được cho trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho dung dịch enzyme chạy qua một cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ thường sử dụng là hydroxyapatie. Bằng phương pháp này, có thể hoặc hấp thụ enzyme hoặc hấp thụ protein Trang 6 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện các quá trình hấp thụ ở nhiệt độ 0°C. Sau khi hấp thụ các enzyme được ly trích bằng các dung môi thích hợp. d. Phương pháp sắc ký Dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi ion giữa protein tan trong nước và tác nhân trao đổi ion, người ta áp dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch enzyme. Các tác nhân trao đổi ion sau: Nhựa trao đổi ion. Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, dietylamino-etyl-cellulose (DEAE – cellulose). Hoặc Sephadex, dẫn xuất của polysaccaride dextran. Hiện nay chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự có hiệu quả trong việc làm sạch enzyme. Do đó việc làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo ra một hệ thống gồm các phương pháp nối tiếp nhau hài hòa nhất. 1.4. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ của chúng. Enzyme không thể được định lượng trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng. Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong ba nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc tác của enzyme: - Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định và lượng enzyme được xác định trước. Phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là tương đối chính xác. - Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định. - Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi nhất định về cơ chất hay sản phẩm. Trang 7 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ II. Lipid II.1. Khái niệm Lipid hay chất béo là nhóm hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào động vật và thực vật. Các lipid có thành phần hóa học và cấu tạo khác nhau nhưng chúng có những đặc tính chung là không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ (ete, cloroform, bezen, toluen…). Lipid là một trong những thành phần cấu tạo quan trọng của màng tế bào cũng như các bào quan trong tế bào. Ngoài ra, lipid còn là nguồn cung cấp năng lượng, nguồn cung cấp vitamin A, D, E, K và F cho cơ thể [6]. II.2. Phân loại Dựa vào thành phần cấu tạo, có thể chia lipid thành hai nhóm [6]. II.2.1. Lipid đơn giản: là ester của rượu với acid béo. II.2.1.1. Glycerid: Là ester của rượu glycerol và acid béo, là mỡ dự trữ phổ biến ở động vật và thực vật. Glycerol: là triol không màu, vị ngọt, và nhờn. Khi đốt glycerol hay lipid có chứa glycerol với chất hút nước sẽ tạo acrolein có mùi khét. Acid béo: acid béo thường gặp là những acid béo có số carbon chẵn, mạch thẳng, có thể no hay không no và chuỗi C xếp theo hình chữ chi. Tuy nhiên cũng có những acid béo ngoài nhóm chức acid còn chứa những nhóm chức khác như rượu, cetone, mạch carbon có vòng hay nhánh. II.2.1.2. Cerid: là ester của rượu và acid béo, nhiệt độ thường ở thể rắn, có ở động thực vật, ở thực vật nó thường tạo thành một lớp mỏng phủ lên lá, thân, quả của cây. Cerid có công thức tổng quát là: R – O – C - O – R Rượu trong cerid là rượu cao phân tử, chỉ chứa một nhóm OH , mạnh C không phân nhánh, rất ít khi mạch C có vòng (Rượu cetol) Sáp ong, sáp cá voi (spermaceti) là ester của rượu cetol và palmitic acid. Ngoài ra trong sáp ong và sáp cá voi còn có rượu tự do, acid béo tự do và hydrocarbon. Trang 8 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ II.2.1.3. Sterid: là ester của rượu sterol và acid béo. Rưọu sterol có vòng và trọng lượng phân tử rất lớn, sterol tiêu biểu là cholesterol, acid mật. Acid béo thường là palmitic, oleic, ricinoleic. II.2.2. Lipid phức tạp: Trong phân tử lipid phức tạp ngoài acid béo và rượu còn có các thành phần khác như acid phosphoric, bazơ, nitơ, đường. Một số lipid phức tạp gồm: glycerophospholipid (phosphatid), sphingophospholipid, glycolipid. II.3 Tính chất vật lý và hóa học của lipid [6] II.3.1 Tính chất vật lý a. Điểm nóng chảy Điểm nóng chảy phụ thuộc vào số C của acid béo, acid béo có chuỗi C dài thì điểm nóng chảy cao và ngược lại. Những acid béo có C lẻ có điểm nóng chảy thấp hơn acid béo có số C nhỏ hơn nó 1 đơn vị . Ngoài ra độ nóng chảy còn phụ thuộc vào số nối đôi trong phân tử acid béo, acid béo chứa nhiều nối đôi thì điểm nóng chảy càng thấp. b. Độ sôi Acid béo có chuỗi C dài thì độ sôi càng cao, tính chất này thường áp dụng để tách các acid béo ra khỏi nhau. c. Tính hoà tan Trong nước, acid béo có chuỗi C ngắn (4,6,8) dễ tan, C10 khó tan, C12 không tan. Nếu acid béo ở dạng muối thì dễ hòa tan hơn. Trong các dung môi hữu không phân cực như benzen, ether, ether dầu hoả acid béo dễ tan. Tuy nhiên trong dung môi hữu cơ phân cực như aceton, acid béo khó hoà tan hay hoà tan rất ít. II.3.2 Tính chất hóa học a. Sự hydrogen hoá Acid béo chưa no có thể kết hợp với H2để tạo thành acid béo no Ni, t0 R-(CH2)n - CH = CH- (CH2) n-COOH + H2 R-(CH2)n - CH2 - CH2- (CH2) n-COOH Người ta dùng phản ứng này để chế tạo thực phẩm như margarin. Trang 9 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ b. Sự halogen hoá Acid béo không no kết hợp với các nguyên tố thuộc họ halogen (F, Cl, Br, I) để tạo thành acid béo no. R-(CH2)n - CH = CH- (CH2) n-COOH + I2 R-(CH2)n - CH - CH- (CH2) n-COOH I I Có thể dùng phản ứng này để xác định số nối đôi trong phân tử acid béo. Phản ứng dễ dàng hay khó xảy ra tuỳ thuộc vào vị trí nối đôi đối với nhóm carboxyl, nối đôi càng gần nhóm carboxyl phản ứng càng khó xảy ra. Để xác định số nối đôi người ta căn cứ vào chỉ số Iod. Chỉ số Iod: là số gam Iod cần thiết để tác dụng lên 100 gam chất béo. Do đó chỉ số Iod càng lớn thì số nối đôi càng nhiều. c. Sự thuỷ phân: Ester khi thuỷ phân sẽ tạo thành rượu glycerol và acid béo. Tác nhân thủy phân là acid, kiềm, nước hay enzyme. * Thủy phân bằng nước cần nhiệt độ và áp suất cao. * Thủy phân bằng kiềm: NaOH hay KOH Chỉ số xà phòng hoá: là số mg KOH cần để trung hoà 1 g chất béo. Chỉ số xà phòng càng lớn thì độ dài mạch càng ngắn, nên được dùng để xác định độ dài của mạch C. Ngoài ra để xác định tính chất của chất béo người ta còn căn cứ vào một số chỉ số khác như chỉ số acid. Chỉ số acid: là số mg KOH dùng để trung hoà tất cả acid béo tự do có trong 1 g chất béo. d. Sự ôi hóa: Dầu mỡ để lâu có mùi và vị khó chịu gọi là sự ôi hóa, một trong những nguyên nhân gây ra là do oxy không khí kết hợp vào nối đôi tạo thành peroxide. Nếu oxy kết hợp vào nguyên tử carbon đứng cạnh liên kết đôi thì sẽ tạo thành hydrogen peroxide. Sau đó peroxide và hydrogen peroxide sẽ bị phân giải để tạo thành aldehyde và cetone. Các aldehyde và cetone này đều là những chất có mùi và vị khó chịu. Trang 10 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ II.3.3 Sự chuyển hóa của lipid dưới xúc tác lipase II.3.3.1 Phản ứng thủy phân 1. Ý nghĩa của phản ứng thủy phân Phản ứng thủy phân là phản ứng rất phổ biến và rất quan trọng trong bảo quản và sản xuất thực phẩm. Do phản ứng thủy phân mà chất lượng các sản phẩm thực phẩm bị giảm đi, tuy nhiên phản ứng thủy phân cũng làm tăng phẩm chất cho thành phẩm. Qua phản ứng thủy phân, không những chỉ các tính chất cảm quan mà các tính chất hóa học của sản phẩm cũng có thể bị biến đổi. - Phản ứng thủy phân thường mở đầu cho một loạt các phản ứng khác tiếp diễn. Các phản ứng khác có thể xảy ra khi phản ứng thủy phân đã kết thúc. - Về mặt sinh học, phản ứng thủy phân thường đặc trưng cho giai đoạn phân giải, là giai đoạn kết cùng của một quá trình sinh học. - Trong sản xuất thực phẩm, phản ứng thủy phân có vai trò rất quan trọng. Để giảm bớt sự tổn thất phẩm chất thực phẩm, người ta phải tìm những biện pháp kỹ thuật tương ứng để ngăn ngừa và hạn chế các phản ứng thủy phân. Trái lại, qua phản ứng thủy phân mà chất lượng thành phẩm tăng lên thì người ta phải tạo điều kiện cho các phản ứng xảy ra đến tận cùng. [6] 2. Đặc điểm của các cơ chất bị enzyme thủy phân - Các cơ chất được enzyme thủy phân thường là chất đạm (protein), tinh bột (glucid), chất béo (lipid), v.v. - Theo Bernard Pullman và Alberte Pullman, đặc điểm chung của những cơ chất này là có “ liên kết bị thủy phân” do các nguyên tử tích điện dương tạo nên. Người ta gọi liên kết này là “ liên kết nhị dương”. - Sự thủy phân bởi enzyme sẽ càng dễ dàng khi sự khuyết electron trong liên kết bị thủy phân càng lớn [6] 3. Đặc điểm chung của tâm hoạt động của enzyme thủy phân. - Đa số enzyme thủy phân (hydrolase) không có nhóm ngoại. Như vậy bắt buộc tâm hoạt động của chúng phải có các gốc acid amine đặc hiệu. - Tâm hoạt động của enzyme hydrolase thường chứa nhóm imidazol của histidin và nhóm hydroxyl của một trong số các gốc serin. Trang 11 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ - Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein – enzym mà nhóm hydroxyl của serin và vòng imidazol của histidin gần gũi nhau. Khi đó giữa nhóm hydroxyl của serin và nguyên tử nitơ bậc ba của imidazol tạo thành liên kết hidro. Nhờ thế oxy của nhóm hydroxyl thu được tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất. [6]. 4. Cơ chế tác dụng của enzyme hydrolase - Tâm ái nhân của enzyme sẽ tương tác trực tiếp với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết bị thủy phân. - Enzyme làm tăng sự khuyết electron vốn đã tồn tại trước đó, bằng cách tạo thành liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí ít nhiều gần với liên kết bị thủy phân. - Do cấu trúc bậc ba của phân tử protein-enzyme mà nhóm hydroxyl của serin và vòng imidazol của histidin gần nhau. Khi đó giữa nhóm hydroxyl của serin và nguyên tử nitơ bậc ba của nhân imidazol tạo thành liên kết hydro và oxy của nhóm hydroxyl thu được tính chất ái nhân và có thể tương tác được với liên kết nhị dương của các cơ chất.[6] 5. Một số đặc điểm của phản ứng do enzyme xúc tác a. Thứ bậc của phản ứng Sơ đồ chung của phản ứng thủy phân bởi enzyme có thể biểu diễn như sau hydrolase A-B + AH H 2O + BOH lipase Cô chaá t + nöôù c saû n phaå m Sơ đồ phản ứng cho thấy phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng lưỡng phân. Nhưng vì nồng độ của nước rất lớn coi như không thay đổi trong suốt thời gian phản ứng, do đó vận tốc của phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất. Như vậy, phản ứng thủy phân bởi enzyme là phản ứng đơn phân và bậc nhất. b. Yếu tố điều chỉnh - Đối với phản ứng thủy phân bởi enzyme thì nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn là tác nhân tham gia vào phản ứng. - Nước không những ảnh hưởng đến vận tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Do đó nước được dùng để tăng cường hay kiềm hãm các phản ứng thủy phân có xúc tác enzyme. Trang 12 LV TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ - Nhiệt độ và pH cũng có thể điều chỉnh các phản ứng thủy phân bởi enzyme. Mỗi enzyme thủy phân có một nhiệt độ và pH tối ưu riêng do đó chiều của phản ứng thủy phân có thể kiểm soát được bởi nhiệt độ và pH [6]. II.3.3.2 Phản ứng biến đổi dầu và mỡ động, thực vật 1. Ester hóa - Enzyme xúc tác phản ứng ester hóa đã được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp như cải biến chất lượng dầu mỡ động, thực vật đáp ứng nhu cầu sản phẩm tinh sạch, ít hóa chất phục vụ cho con người. Tương tự những chất xúc tác khác, enzym cũng ảnh hưởng đến chiều phản ứng, và được xác định bằng nhiệt động học của phản ứng . Ví dụ cân bằng của phản ứng dưới xúc tác nhóm hydrolase khi thay đổi nồng độ tác nhân và lượng nước thì cân bằng cũng thay đổi theo. - Vài ester quan trọng là glycerides có mặt trong dầu mỡ động, thực vật được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và những ngành công nghiệp khác. Enzymes, đặc biệt là lipase, có nhiều mục đích sử dụng trong việc xử lí và chế biến dầu mỡ động, thực vật. Những thuận lợi gần đây trong nghiên cứu thực phẩm, quan trọng nhất là các acid béo không bão hòa và nguy cơ bị isomer hóa dạng cis thành trans trong quá trình hydro hóa dầu thực vật thúc đẩy các quá trình sinh học phát triển cắt đứt mạch dầu thực vật. Sự thay đổi một số acid béo của triglycerides từ những loại dầu khác nhau, nhằm biến tính chất lýhóa và dinh dưỡng, vị ngon của nguyên liệu. Ví dụ việc chọn những lipase cho vị trí 1 và 3 trên mạch glycerol thì rất thuận lợi, vì hầu hết những triglycerides quan trọng có trong bơ cocoa chứa các acid palmitic hoặc strearic ở vị trí 1 và 3, và acid oleic ở vị trí 2, và phản ứng ester hóa giữa các phân tử bằng xúc tác hóa học không thể thực hiện được. Nó chỉ thực hiện xúc tác tồn tại dưới dạng mono- và diglycerides, có thể sử dụng những enzyme đặc biệt này để di chuyển nhóm acyl và có thể sản xuất triglycerides từ glycerol và các acid béo tự do sử dụng lipase đặc hiệu cho vị trí 1, 3. - Phản ứng ester hóa bằng xúc tác lipase được ứng dụng để tổng hợp một số ester từ dầu và acid béo tương ứng, như tổng hợp ester sáp được sử dụng trong sản xuất mỹ phẩm [13]. Trang 13