Tài liệu Khảo sát các chỉ tiêu vi sinh vật trong một số mẫu sữa và các sản phẩm từ sữa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài KHẢO SÁT CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG MỘT SỐ MẪU SỮA VÀ CÁC SẢN PHẨM TỪ SỮA KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: ThS. Nguyễn Văn Hòa ThS. Trần Thị Ánh Nguyệt SVTH: Nguyễn Uyên Vy MSSV: 1053012976 Khóa: 2010 – 2014 Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2014 Đề tài khóa luận tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy Nguyễn Văn Hòa, Thầy Nguyễn Văn Minh, Cô Dương Nhật Linh, chị Trần Thị Ánh Nguyệt, Cô Phạm Vân An, người đã truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và hết sức giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài khóa luận tốt nghiệp của mình. Em cũng xin cảm ơn Nhà trường, Quý Thầy Cô, cùng bạn bè Khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở TP.HCM đã tạo mọi điều kiện cho em học tập, tiếp cận chuyên sâu kiến thức chuyên môn cũng như hiểu biết về mặt xã hội. Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn Quý Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 và các Anh Chị trong phòng kiểm nghiệm Vi sinh – GMO. Đặc biệt là chị Đinh Thị Thu Hồng đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực tập. Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn đến Bố Mẹ cùng gia đình, người đã luôn ủng hộ, theo sát và cổ vũ con trong suốt quãng đường vừa qua. Một lần nữa xin cảm ơn tất cả! Sinh viên thực hiện Nguyễn Uyên Vy SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 2 Đề tài khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Quy định của bộ y tế về giới hạn vi sinh vật trong sản phẩm sữa .. 10 Bảng 3.1.1 : Kết quả thực hiện kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh trên 20 mẫu sữa bột ........................................................................................ 43 Bảng 3.1.2: Kết quả thực hiện kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh trên 20 mẫu sữa tươi tiệt trùng ........................................................................ 44 Bảng 3.1.3: Kết quả thực hiện kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh trên 15 mẫu sữa chua ....................................................................................... 45 Bảng 3.1.4: Kết quả thực hiện kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh trên 30 mẫu phô mai ........................................................................................ 46 SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 3 Đề tài khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................ 6 PHẦN 1: TỔNG QUAN ........................................................................... 7 1.1. GIỚI THIỆU VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT TIÊU CHUẨN ĐO LƯỜNG CHẤT LƯỢNG 3 (QUATEST 3) ........................ 7 1.2. TỔNG QUAN VỀ SỮA VÀ VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA TRONG SỮA ......................................................................... 9 1.1.1. Tổng quan về sữa và các sản phẩm từ sữa ...................................... 9 1.1.2. Vi sinh vật cần kiểm tra trong sữa ................................................. 10 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG CHÍNH ......................................................................... 18 2.1.1. THAO TÁC THU, BẢO QUẢN, CHUẨN BỊ MẪU THỰC PHẨM ....................................................................................................... 18 2.1.2. KỸ THUẬT KIỂM TRA CHỈ TIÊU VI SINH TRONG THỰC PHẨM ....................................................................................................... 20 2.2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. VẬT LIỆU – DỤNG CỤ - MÔI TRƯỜNG ................................... 20 2.2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................. 21 2.2.2.1. Định lượng Listeria monocytogenes ...................................... 21 2.2.2.2. Định lượng E.coli ................................................................... 24 2.2.2.3. Định tính Salmonella spp ........................................................ 26 2.2.2.4. Staphylococci phản ứng dương tính với coagulase ............... 29 2.2.2.5. Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí ................................. 31 2.2.2.6. Định lượng Coliform .............................................................. 33 2.2.2.7. Định lượng nấm men và nấm mốc ......................................... 35 2.2.2.8. Định lượng Bacillus cereus ................................................... 36 PHẦN 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả ........................................................................................... 37 3.2. Thảo luận ........................................................................................ 44 SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 4 Đề tài khóa luận tốt nghiệp PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN .................................................................................... 44 4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................... 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................... 46 PHỤ LỤC ................................................................................................. 48 MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA ....................................................... 58 SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 5 Đề tài khóa luận tốt nghiệp ĐẶT VẤN ĐỀ Theo báo cáo gần đây của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hơn 1/3 dân số các nước phát triển bị ảnh hưởng của các bệnh do thực phẩm gây ra mỗi năm. Đối với các nước đang phát triển, tình trạng lại càng trầm trọng hơn nhiều, hàng năm gây tử vong hơn 2,2 triệu người. Các vụ ngộ độc có xu hướng ngày càng tăng. Trong đó, có khoảng hơn 50% các vụ ngộ độc thực phẩm là do tác nhân vi sinh vật.[14] Trong cuộc sống bận rộn ngày nay, con người đòi hỏi sử dụng loại thực phẩm vừa nhanh, tiên lợi, đồng thời cũng phải đáp ứng nhu cầu về mặt dinh dưỡng. Và nhóm thực phẩm từ sữa chính là sự lựa chọn hàng đầu. Sữa và các sản phẩm từ sữa là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao và đầy đủ chất dinh dưỡng như protein, glucid, lipid, chất khoáng, vitamin,… Một sản phẩm không thể thiếu trong cuộc con người. Nhưng câu hỏi được đặt ra ở đây là các sản phẩm này có nhiễm vi sinh vật gây bệnh? Nói cách khác, chúng có đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm hay không? Các sản phẩm từ sữa được làm ra là cả một quá trình thu nhận ,chế biến, đóng gói, phân phối, lưu trữ, bảo quản. Chỉ cần một hoặc nhiều giai đoạn này chứa vi sinh vật gây bệnh, độc tố của chúng sẽ gây ra hiện tượng ngộ độc thực phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của người tiêu dùng. Chính vì thế, việc kiểm tra một số chỉ tiêu về vi sinh vật của các sản phẩm từ sữa trước khi đến tay người tiêu dùng là cực kỳ quan trọng. Với mục đích đó, tôi đã thực hiện đề tài “Khảo sát các chỉ tiêu vi sinh vật trong sữa và các sản phẩm từ sữa (từ ngày 5/11 đến ngày 17/05/2014)” SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 6 Đề tài khóa luận tốt nghiệp PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT TIÊU CHUẨN ĐO LƯỜNG CHẤT LƯỢNG 3 (QUATEST 3)[15] 1.1.1. Địa chỉ liên lạc Địa chỉ: 7 Đường số 1, Khu Công nghiệp Biên Hòa 1, tỉnh Đồng Nai. Tel: (84-61) 3 836 212 Fax: (84-61) 3 836 298 E-mail: [email protected] 1.1.2. Giới thiệu chung QUATEST 3 là tổ chức khoa học công nghệ thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng – Bộ Khoa học và Công nghệ, được thành lập từ tháng 5 năm 1976 trên cơ sở Viện Định chuẩn Quốc gia trước đây. QUATEST 3 áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 9001; lĩnh vực thí nghiệm được công nhận phù hợp với tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, lĩnh vực giám định hàng hóa được công nhận phù hợp với ISO/IEC 17020, lĩnh vực chứng nhận sản phẩm được công nhận phù hợp với ISO/IEC Guide 65 và lĩnh vực tư vấn, đào tạo được chứng nhận phù hợp với ISO 9001. Qua 30 năm hoạt động, QUATEST 3 đã được biết đến như một đơn vị hàng đầu tại Việt Nam trong lĩnh vực cung cấp dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường và chất lượng. QUATEST 3 có đội ngũ chuyên viên, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu và có nhiều kinh nghiệm, hệ thống phòng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại theo chuẩn mực quốc tế. 1.1.3. Nhiệm vụ và lĩnh vực hoạt động của công ty 1.1.3.1. - Nhiệm vụ Kiểm tra, giám định và thẩm định kỹ thuật về chất lượng, vệ sinh, an toàn của sản phẩm, hàng hóa, vật liệu, cấu kiện công trình. - Thử nghiệm vật liệu, sản phẩm, hàng hóa. - Kiểm định, hiệu chuẩn và đánh giá phương tiện đo. SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 7 Đề tài khóa luận tốt nghiệp - Chứng nhận sự phù hợp của sản phẩm với tiêu chuẩn và qui chuẩn kỹ thuật. - Kiểm định và đánh giá an toàn công nghiệp. - Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng công nghệ, chuyển giao công nghệ. - Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch. - Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất lượng. - Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các phương tiện đo. Trang bị và cung cấp dịch vụ bảo trì, báo dưỡng và sữa chữa các phương tiện đo lường, thử nghiệm, thiết bị kỹ thuật. - Tiếp nhận đăng ký mã số, mã vạch. - Cung cấp thông tin, tiêu chuẩn và các tài liệu liên quan đến tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng. 1.1.3.2. Các lĩnh vực hoạt động chính của trung tâm  Cơ khí và không phá hủy (NDT)  Hàng tiêu dùng  Đồ gỗ gia dụng  Vật liệu xây dựng  Điện & điện tử  Tương thích điện từ (EMC)  Hóa chất  Môi trường  Dầu khí  Thực phẩm  Vi sinh - sinh vật biến đổi gen (GMO) 1.1.4. Phòng vi sinh & GMO 1.1.4.1. Năng lực kỹ thuật chính  Phân tích vi sinh trong thực phẩm, nông sản, mỹ phẩm, nước, thức ăn chăn nuôi, đồ uống, phân vi sinh, chế phẩm sinh học và các sản phẩm tiêu dùng khác. SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 8 Đề tài khóa luận tốt nghiệp  Phân tích định tính và định lượng sinh vật biến đổi gen (GMO) có trong các loại sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật, các loại hạt giống, các loại thức ăn dành cho gia súc… 1.1.4.2. - Phương pháp thử nghiệm TCVN, SMEWW, USFDA, ISO, GS, AOAC,… 1.1.4.3. Thiết bị chính Các thiết bị vi sinh như tủ cấy vô trùng, nồi hấp, tủ ấm, kính hiển vi, tủ đông sâu… Các thiết bị để thử nghiệm thực phẩm biến đổi gen như PCR Real Time, máy ly tâm lạnh, máy điện di ngang, thiết bị nhân gen, tủ lắc ổn nhiệt, hệ thống giải trình tự gen, hệ thống ELISA,…. 1.2. TỔNG QUAN VỀ SỮA VÀ VI SINH VẬT CẦN KIỂM TRA TRONG SỮA 1.2.1. Tổng quan về sữa và các sản phẩm từ sữa [3] - Là nhóm sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, không chỉ thể hiện qua tính đặc hiệu của các chất dinh dưỡng và tỷ lệ giữa chúng mà còn được thể hiện qua tính đặc hiệu của các thành phần dinh dưỡng đó. Các sản phẩm từ sữa đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của cơ thể về acid amin không thay thế, acid béo không no, khoáng (đặc biệt là Ca và P) và các vitamin. Các thành phần chủ yếu của sữa và các sản phẩm từ sữa: 1.2.1.1. - Nước Là một thành phần đóng vai trò quan trọng, là dung môi hòa tan các chất hữu cơ và vô cơ, là môi trường cho các phản ứng sinh hóa 1.2.1.2. - Lipid Chất béo là một trong những thành phần quan trọng nhất trong các sản phẩm từ sữa. Hàm lượng chất béo của chúng thay đổi trong một phạm vi khá rộng. Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid khác nhau, trong đó 2/3 là acid béo no và còn lại là acid chưa no. Nhiều acid béo trong sữa dễ hòa tan trong nước. Chất béo trong sữa cũng dễ xảy ra những quá trình phân hủy SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 9 Đề tài khóa luận tốt nghiệp làm thay đổi thành phần và tính chất sữa dẫn đến giảm chất lượng và hư hỏng sữa. 1.2.1.3. - Protein Trong sữa có 3 loại protein chủ yếu: casein chiếm khoảng 80%, lactalbumin chiếm 12% và lactoglobulin chiếm 6%. Còn một số lại protein khác tuy nhiên hàm lượng không đáng kể. 1.2.1.4. - Carbohydrate Carbohydrate có trong nhóm thực phẩm từ sữa chủ yếu là lactose. Lactose khó bị thủy phân hơn các loại đường khác. Lactose bị thủy phân sẽ cho một phân tử glucose và một phân tử galactose. Dưới tác dụng của vi khuẩn lactic, lactose bị lên men thành acid lactic gọi là quá trình lên men lactic. 1.2.1.5. - Chất khoáng Chất khoáng trong sữa có nhiều loại như: kali, canxi, natri, sắt, nhôm, mangan,…..Trong đó canxi và kali là nhiều nhất. Các muối khoáng trong sữa có nhiều loại, phổ biến là muối photphat, clorua, citrate,… 1.2.1.6. - Vitamin Vitamin A, D1, B2, PP, C,….. 1.2.2. Vi sinh vật cần kiểm tra trong sữa [1,4] Bảng 1.1: Quy định của bộ y tế về giới hạn vi sinh vật trong sản phẩm sữa Giới hạn vi sinh TT Sản phẩm Loại vi khuẩn vật (Trong 1g hoặc 1 ml sản phẩm) (*) Các sản phẩm được thanh 1 trùng bằng phương pháp Pasteur SVTH: Nguyễn Uyên Vy TSVSVHK (a) 5×105 Coliform Không có E.coli Không có (Hoặc <3 MPN) S.aureus Không có Listeria monocytogenes Không có Salmonella.spp Không có Page 10 Đề tài khóa luận tốt nghiệp Các sản phẩm được tiệt trùng bằng phương pháp 2 UHT hoặc các phương TSVSVHK (a) 102 Coliform Không có E.coli S.aureus Không có độ cao khác Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Coliform 10 Sữa lên men bao gồm sữa lỏng và đặc 5 Sữa dạng bột Sữa đặc 6 6.1 Không có (Hoặc <3 MPN) S.aureus Không có Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Nấm men 102 Nấm mốc 102 TSVSVHK 5×105 Coliform 10 E.coli 4 (Hoặc <3 MPN) pháp tiệt trùng bằng nhiệt E.coli 3 Không có Không có (Hoặc <3 MPN) B.cereus 102 S.aureus 10 Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Kem sữa (cream) Kem sữa được tiệt trùng SVTH: Nguyễn Uyên Vy Coliform 10 Page 11 Đề tài khóa luận tốt nghiệp bằng phương pháp Pasteur 6.2 E.coli (Hoặc <3 MPN) S.aureus Không có Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có TSVSVHK (b) 102 Coliform Không có Kem sữa được tiệt trùng E.coli bằng phương pháp UHT 7 Không có Không có (Hoặc <3 MPN) S.aureus Không có Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Coliform 104 E.coli 102 S.aureus 102 Listeria monocytogenes Không có Salmonella spp. Không có Phomat (a) TSVSVHK ở 21oC (b) TSVSVHK ở 30oC (*) Tính trên 25 g hoặc 25 ml đối với Salmonella spp. và Listeria monocytogenes 1.2.2.1. - Vi sinh vật hiếu khí Là nhóm vsv chỉ tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có O2. Số lượng vsv hiếu khí có mặt trong mẫu thực phẩm biểu thị mức độ vệ sinh thực phẩm. - Tổng số VSV hiếu khí được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên thạch đĩa. Từ một lượng mẫu xác định, trên cơ sở xem một khuẩn lạc là sinh khối phát SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 12 Đề tài khóa luận tốt nghiệp triển từ một tế bào hiện diện trong mẫu. đơn vị biểu diễn Colony forming unit CFU: đơn vị hình thành khuẩn lạc. - Một số tên gọi khác :  Tổng số đếm trên đĩa: Total Plate Count (TPC)  Số vi sinh vật hiếu khí: Aerobic Plate Count (APC)  Tổng số vi sinh vật sống: Total Vable Count (TVC)  Số đếm được trên đĩa chuẩn: Standard Plate Count (SPC) 1.2.2.2. - Coliform Là nhóm những trực khuẩn đường ruột gram âm, không sinh bào tử, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi, có khả năng sinh acid, sinh hơi do lên men lactose ở 37oC trong 24 h. Đây là nhóm vsv chỉ thị : số lượng hiện diện của chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vsv gây bệnh khác. - Nhóm Coliforms gồm 4 giống là: Escherichia với 1 loài duy nhất là E. coli, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter. Tính chất sinh hoá đặc trưng của nhóm này được thể hiện qua các thử nghiệm Indol (I), Methyl Red (MR), Voges-Proskauer (VP) và Citrate (iC) thường được gọi tóm tắt chung là IMViC. 1.2.2.3. Salmonella - Salmonella là trực khuẩn Gram âm, di động, sống hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi, không tạo bào tử, không tạo giáp mô, di động nhờ tiêm mao. - Salmonella mọc trên XLD cho khuẩn lạc có hoặc không có tâm đen, có quầng trong sáng, hơi đỏ. Trên HE : khuẩn lạc màu xanh dương đến xanh lá, có hoặc không có tâm. Trên BS khuẩn lạc có tâm đen, viền sáng bao quanh bởi vùng tủa có ánh kim. Tính chất sinh hóa: SVTH: Nguyễn Uyên Vy Hình 1.1: Salmonella qua kính hiển vi điện tử Page 13 Đề tài khóa luận tốt nghiệp Indol (-), Ure (-), H2S (+), LDC (+), TSI đỏ/vàng, VP (-), chuyển hóa O.N.P.G(-). Salmonella có khả năng lên men glucose, manitol nhưng không lên men saccharose và lactose. Kháng nguyên: Salmonella có trên 60 kháng nguyên O, kháng nguyên H có 1 hay 2 dạng và kháng nguyên Vi. Độc tố:có 2 loại độc tố: độc tố ruột và thần kinh - Độc tố ruột gồm nội độc tố và ngoại độc tố. Nội độc tố gồm LT không chịu nhiệt và ST chịu nhiệt. - Ngoại độc tố thần kinh: tác động lên thần kinh. Liều nhiễm trùng: liều có thể gây độc đối với người khỏe mạnh thường 106 vi khuẩn/1g thực phẩm. Nhưng đối với trẻ em và người già thì liều gây ngộ độc sẽ giảm hơn. 1.2.2.4. Staphylococcus aureus S.aureus là cầu khuẩn, gram dương, xếp thành hình chùm nho, không di động, không tạo bào tử, hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi. Tính chất sinh hóa: Thử nghiệm coagulase (+), catalase (+), MR (+), VP (+), khử nitrat thành nitrit, có khả năng lên men và sinh acid từ manitol, Hình 1.2: Staphylococcus aureus qua kính hiển vi điện tử saccharose, mẫn cảm với novobiocine, làm tan thạch máu, chịu được nồng độ muối 15%. Kháng nguyên: S.aureus có kháng nguyên O gồm peptidoglucan, protit A, acid teichoic, hemolynase và một số enzym gây độc. Độc tố: gồm nội độc tố và ngoại độc tố Nội độc tố như leukocidin diệt bạch cầu, exfoliative tạo nốt mụn nước trên da... Ngoại độc tố như α-toxin và β-toxin làm tan hồng cầu.Ngoại độc tố ruột enterotoxin gây trúng độc thực phẩm. Tính gây bệnh: SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 14 Đề tài khóa luận tốt nghiệp Gây bệnh viêm mủ nhiễm trùng như u nhọt, apxe, viêm khớp, viêm phổi. Vi khuẩn còn gây nhiễm trùng máu có thể dẫn đến viêm não, viêm tim dẫn đến tử vong. Gây trúng độc thực phẩm, liều tối thiểu để sản xuất ra độc tố là 108 vi khuẩn/1 g thực phẩm. 1.2.2.5. Escherichia coli E.coli là một loài vi khuẩn trong ruột của con người và động vật máu nóng. Số lượng E. Coli ở phân người khi đi đại tiện từ 100 tỉ đến 10000 tỉ vi khuẩn E. Coli. Số lượng E. Coli trong con người quá nhiều, sẽ gây bệnh cho con người chẳng hạn như tiêu chảy. Tính chất nuôi cấy và sinh hóa: KIA vàng/vàng; IMViC ++--; ONPG (+); LDC (+); lên men sinh hơi đường glucose, lactose, galactose; không lên men dextrin và có 2 loại enzyme β-DGlucuronidase (GLUC) và β-D Galactosidase (GAL). Kháng nguyên: E.coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K và 50 yếu tố H. Độc tố: Hình 1.3: Escherichia coli qua kính hiển vi điện tử Dựa vào tính chất gây bệnh E.coli được chia làm 5 nhóm độc tố:  Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy mất nước ở trẻ dưới 2 tuổi.  Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): tiết độc tố ruột enterotoxin gây tiêu chảy cho trẻ em và người lớn gồm 2 loại LT (Thermolabiles) và ST (Thermostable). SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 15 Đề tài khóa luận tốt nghiệp  Nhóm EIEC ( Enteroinvasine E.coli): đây là nhóm E.coli xâm lấn. Chúng gây loét niêm mạc đại tràng, tiêu chảy lẫn đàm, máu. Các chủng này có phản ứng LDC (-)  Nhóm EHEC (Enterohemorhagic E.coli): gây xuất huyết ruột và hội chứng tan máu-urê huyết, ngoài ra chúng còn là nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết.  Nhóm EAEC (Enteroaggretive E.coli): vi khuẩn nhóm này có yếu tố bám dính phủ kín bề mặt ngoài của niêm mạc ruột góp phần tạo nên sự xâm lấn dai dẳng và gây tiêu chảy kéo dài dẫn đến sự kém hấp thu các chất dinh dưỡng. Liều nhiễm trùng: liều gây nhiễm qua đường tiêu hóa là 106-108 vi khuẩn /ml (g). 1.2.2.6. - Nấm men, nấm mốc Đây là nhóm vi sinh vật nhân thật, có vách tế bào là lớp vỏ chitin, có nhân và các bào quan khác. Tất cả các loài men và mốc đều thuộc nhóm vi sinh vật dị dưỡng, chúng cần nguồn carbon hữu cơ để cung cấp năng lượng từ môi trường bên ngoài. - Nấm mốc là vi nấm dạng sợi, sinh sản bằng bào tử hay khuẩn ty. - Hình 1.4: Nấm mốc trên môi trường PDA Nấm men là những tế bào đơn tính phát triển theo kiểu nảy chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn ty giả trong đó các tế bào kết nhau thành chuỗi. - Đơn vị hình thành khuẩn lạc của nấm mốc và nấm men là mầm để tạo nên 1 khuẩn lạc khi nuôi cấy trong môi trường. Mầm có thể là 1 bào tử , 1 tế bào hay 1 đoạn của khuẩn ty. Đặc điểm nuôi cấy: SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 16 Đề tài khóa luận tốt nghiệp Hầu hết nấm mốc, nấm men đều thuộc nhóm vi sinh vật ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của chúng trong khoảng (20 – 28)oC, một số ít trong số này ưa lạnh hay ưa nóng. Độc tố của vi nấm - Nhiễm độc cấp tính: khi ăn phải lượng độc tố lớn sẽ gây ngộ độc cấp tính và gây tử vong. Thông thường mổ ra thấy gan to, màu sắc nhợt nhạt, có hoại tử nhu mô gan và chảy máu… - Nhiễm độc mạn tính: gây ung thư gan. Trường hợp bị nhiễm số lượng ít có triệu chứng kém ăn, chậm lớn, có khi tụt cân, gan có vùng tụ máu, hoại tử tế bào nhu mô gan. Ăn một lượng nhỏ lâu ngày có thể gây quái thai và đột biến gen ở người và động vật. 1.2.2.7. Listeria monocytogenes L.monocytogenes là vi khuẩn có hình gậy ngắn, mảnh, gram dương sau khi nuôi cấy 20 giờ, là tác nhân gây bệnh nguy hiểm (nhiễm trùng máu, sẩy thai ở phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi) loài này thường được phát hiện trong thức ăn gia súc, nước, nước thải, là loài đặc biệt nguy hiểm trong các loại thực phẩm đã qua gia nhiệt. Đặc điểm sinh hóa Catalase (+), oxidase (-), chuyển động xoay tròn từng đợt trong tiêu bản giọt treo, có khả năng thủy giải esculin và làm tan huyết trên môi trường thạch máu, sinh acid từ rhamnose nhưng không xylose, phản ứng CAMP (+) với Staphylococcus aureus và (-) đối với Rhodococcus equi. 1.2.2.8. Bacillus cereus Là những trực khuẩn gram dương, hiếu khí và kị khí tùy ý. Loài này tăng trưởng trong nhiệt độ từ 5 – 50oC, tối ưu ở 35 – 40oC; pH dao động từ 4,5 – 9,3, dễ tạo bào tử và bào tử nảy mầm rất dễ dàng.Trên môi trường chọn lọc loài này tạo khuẩn lạc SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 17 Đề tài khóa luận tốt nghiệp rất to, mọc lan, rìa nhăn. Vi khuẩn này diện hiện trong đất, bụi, các loại thực phẩm (sữa, thịt, rau quả, hỗn hợp gia vị, sản phẩm khô,…). Đặc điểm sinh hóa Di động, tạo nội bào tử, lên men glucose sinh hơi, phản ứng VP (+), có khả năng sử dụng nitrate. Độc tố Vi khuẩn có thẻ tiết ra 2 loại độc tố chính là diarrhoeal toxin gây tiêu chảy và emetic toxin gây nôn mửa. SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 18 Đề tài khóa luận tốt nghiệp PHẦN 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NỘI DUNG CHÍNH 2.1.1. Tao tác thu, bảo quản, chuẩn bị mẫu thực phẩm - Tùy theo yêu cầu về mức chất lượng mà ta tiến hành định tính hay định lượng mật độ vi sinh vật trong mẫu kiểm. 2.1.1.1. - Dụng cụ thu, chứa mẫu: thay đổi tùy theo loại thực phẩm. Dao, thìa, kẹp, kéo…đã được sát trùng để cho mẫu vào dụng cụ chứa. Khối lượng tổng của mỗi mẫu cần thu ít nhất là khoảng (100-250)g và phải đảm bảo tính đại diện. - Dụng cụ chứa mẫu thường là các bình nhựa có nắp bằng nhôm hay bằng chất dẻo, bao nylon chứa mẫu. 2.1.1.2. - Bảo quản mẫu Bảo quản mẫu thử nghiệm trong điều kiện sao cho hạn chế đến mức thấp nhất đến sự thay đổi số lượng vi sinh vật trong mẫu. - Đối với các mẫu ổn định, có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng là từ 18 – 27oC. Đối với mẫu đông lạnh, phải bảo quản < -15oC và phải được phân tích ngay khi có thể. Đối với mẫu mà không ổn định ở nhiệt độ thường, bảo quản ở 1 – 8o và phải phân tích ngay khi có thể. 2.1.1.3. - Chuẩn bị mẫu thử [12] Các sản phẩm đông: nên được rã đông bằng cách để ngoài nhiệt độ phòng (18-27)oC/3 h hoặc (3± 2)oC/24 h, mẫu phải được kiểm tra càng nhanh càng tốt. - Các sản phẩm khô cứng: nghiền mẫu nhưng không quá 1 phút hoặc đồng nhất bằng máy stomacher không quá 2,5 phút. - Các sản phẩm lỏng hoặc bán lỏng: trước khi phân tích lắc bằng tay hoặc máy. - Các sản phẩm hỗn hợp: lấy ước số của mỗi thành phần đại diện cho mẫu thử của sản phẩm ban đầu SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 19 Đề tài khóa luận tốt nghiệp 2.1.1.4. Cách tiến hành 2.1.1.4.1. Sữa và các sản phẩm từ sữa - Trộn mẫu thử nghiệm và lắc nhanh bình chứa mẫu, không quá 3 phút, tránh tạo bọt hoặc cho bọt văng ra. - Đồng nhất huyền phù để được dung dịch pha loãng 10-1. Chuẩn bị dãy pha loãng cao hơn nếu cần thiết. Hình 2.1: Dãy pha loãng mũ 10 2.1.1.4.2. Sữa bột, whey dạng bột, sữa chua, bơ sữa và lactose dạng bột - Lắc và trộn mẫu trong bình chứa chưa mở. Nếu mẫu thử nghiệm đựng trong bình chứa chưa mở và quá đầy thì cần chuyển mẫu vào một bình chứa lớn hơn sau đó trộn và đồng nhất mẫu. - Cân 10 g mẫu thử nghiệm vào bình chứa thích hợp, thêm 90 ml dung dịch pha loãng. 2.1.1.4.3. Phô mai và các sản phẩm từ phô mai - Cân 10 g mẫu vào bình chứa - Bổ sung 90 ml dung dịch pha loãng - Đồng nhất mẫu - Chuẩn bị dãy pha loãng cao hơn nếu cần thiết 2.1.1.4.4. Sữa lên men và kem sữa chua - Cân 10g vào túi vô trùng - Bổ sung 90 ml dung dịch pha loãng ở nhiệt độ phòng và lắc mẫu cho tan - Chuẩn bị dãy pha loãng cao hơn nếu cần thiết 2.1.1.4.5. Thực phẩm dinh dưỡng cho trẻ em có chứa sữa SVTH: Nguyễn Uyên Vy Page 20