Tài liệu Khảo sát khả năng ức chế xanthine oxidase của lá đu đủ (carica papaya l.)pdf

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRINH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ XANTHINE OXIDASE CỦA LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC Cần Thơ – 12/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LÊ THỊ HUYỀN TRINH KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ XANTHINE OXIDASE CỦA LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA DƯỢC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS. TS. NGUYỄN MINH CHƠN Cần Thơ – 12/2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ---------- NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn. 2. Đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế xanthine oxidase của lá Đu Đủ (Carica papaya L.)”. 3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Huyền Trinh – 2112106 – Hóa Dược K37. 4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. c. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. d. Kết luận, đề nghị, điểm: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. ………………………………………………………………………………….. Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ hướng dẫn Nguyễn Minh Chơn Chuyên ngành Hóa dược i Khoa Khoa học Tự Nhiên TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN HÓA HỌC Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập - Tự do - Hạnh phúc ---------- NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN 1. Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn. 2. Đề tài: “Khảo sát khả năng ức chế xanthine oxidase của lá Đu Đủ (Carica papaya L.)”. 3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Huyền Trinh – 2112106 – Hóa Dược K37. 4. Nội dung nhận xét: a. Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. b. Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. c. Nhận xét đối với sinh viện thực hiện đề tài: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. d. Kết luận, đề nghị, điểm: .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. .............................................................................................................................. Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Cán bộ phản biện Chuyên ngành Hóa dược ii Khoa Khoa học Tự Nhiên LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp “Khảo sát khả năng ức chế xanthine oxidase của lá Đu Đủ (Carica papaya L.)”, lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy hướng dẫn PGS. TS. Nguyễn Minh Chơn Thầy đã tận tình chỉ dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt khoảng thời gian thực hiện luận văn. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến quý Thầy Cô trong Bộ môn Hóa học – khoa Khoa học Tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ đã trang bị cho em nhiều kiến thức và kỹ năng quý giá trong quá trình học tập tại trường. Em xin chân thành cám ơn các Anh trong nhóm nghiên cứu của Phòng thí nghiệm Sinh hóa, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Con xin cảm ơn Cha Mẹ và những người thân yêu luôn bên cạnh động viên, khích lệ và là chỗ vựa tinh thần giúp con vượt qua mọi khó khăn trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng, tôi cảm ơn những sẻ chia, những sự giúp đỡ, quan tâm từ các bạn Hóa dược – K37 – những người đã đồng hành cùng tôi trong suốt khoảng thời gian bốn năm qua. Xin chân thành cảm ơn. Chuyên ngành Hóa dược iii Khoa Khoa học Tự Nhiên TÓM TẮT Việt Nam là một nước có rất nhiều loài thảo dược và một số trong chúng có khả năng ức chế xanthine oxidase (XO), một loại enzyme xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và oxy hoá xanthine thành uric acid, nguyên nhân gây bệnh gout. Allopurinol được dùng như một chất ức chế xanthine oxidase trong điều trị bệnh gout, tuy nhiên allopurinol cũng có nhiều tác dụng phụ. Vì thế, yêu cầu hiện nay là tìm ra hợp chất mới có hoạt tính chữa trị cao và ít ảnh hưởng nhất. Mục đích đề tài là đánh giá hoạt động ức chế xanthine oxidase in vitro từ cao methanol lá Đu Đủ (Carica papaya L.) trong điều trị bệnh gout. Hoạt động ức chế XO được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 295 nm, do sự hình thành uric acid. Kết quả đã chỉ ra rằng cao methanol lá Đu Đủ có hoạt động ức chế XO đầy hứa hẹn lên đến 73,04% ở nồng độ 400 µg/mL, giá trị IC50 đạt 122 µg/mL thấp hơn so với IC50 của allopurinol là 8,8 µg/mL. Từ khóa: allopurinol, xanthine oxidase, gout, lá Đu Đủ, xanthine. Chuyên ngành Hóa dược iv Khoa Khoa học Tự Nhiên ASBTRACT Viet Nam has very many medicinal plants and some of them inhibit xanthine oxidase (XO) which is an enzyme catalyses the metabolism hypoxanthine to xanthine and xanthine into uric acid leads to gout. Allopurinol is used as a XO inhibitor in the treatment of gout, but it has many side effects. Therefore, new alternatives with increased therapeutic activity and least side are desired. Aim of the topic is to evalduate XO inhibitory activity from the methanolic extract of Carica papaya L. leaves in the treatment of gout. XO inhibitory activity was determined by measuring absorbance at 295 nm with uric acid formation. The result have shown that the methanolic extract of Carica papaya L. leaves has promising activity to inhibit XO up to 73,04% with 400 µg/mL. The methanolic extract of Carica papaya L. leaves showed IC50 value of 122 µg/mL that is lower as compared to allopurinol with IC50 value of 8,8 µg/mL. Keywords: allopurinol, Carica papaya L. leaves, xanthine oxidase, gout, xanthine. Chuyên ngành Hóa dược v Khoa Khoa học Tự Nhiên DANH SÁCH BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 4.1 Bảng kết quả trích cao lá Đu Đủ 33 4.2 Kết quả khảo sát khả năng khử gốc tự do của cao chiết bằng phương pháp DPPH 34 4.3 Kết quả khảo sát khả năng khử gốc tự do của vitamin C bằng phương pháp DPPH 35 4.4 So sánh hoạt tính khử gốc tự do của cao chiết lá Đu Đủ và vitamin C bằng phương pháp DPPH 36 4.5 Khảo sát khả năng ức chế XO của cao chiết 37 4.6 Khảo sát khả năng ức chế XO của allopurinol 39 4.7 So sánh hoạt tính ức chế XO của cao chiết lá Đu Đủ và allopurinol 4.8 Kết quả định tính flavonoid trong cao chiết lá Đu Đủ Chuyên ngành Hóa dược vi 40 42 Khoa Khoa học Tự Nhiên DANH SÁCH HÌNH Hình Tên hình Trang 2.1 Quá trình oxy hóa hypoxanthine và xanthine với xúc tác XO 3 2.2 Cấu trúc hóa học của allopurinol 4 2.3 Cấu trúc hóa học của kaempferol 10 2.4 Cấu trúc hóa học của quercetine 10 2.5 Cây Đu Đủ 11 2.6 Cách đánh số hợp chất flavonoid 19 2.7 Đường thẳng biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thu vào nồng độ 21 2.8 Cấu trúc đảm bảo hoạt tính chống oxy hóa của polyphenol 23 2.9 Cơ chế chống oxy hóa của vitamin C 23 2.10 Công thức hóa học của vitamin E 25 3.1 Sơ đồ bố trí trích cao lá Đu Đủ 27 3.2 Cơ chế phản ứng DPPH 28 3.3 Quy trình thử hoạt tính khử gốc tự do 29 3.4 Quy trình đánh giá khả năng ức chế XO của cao chiết 31 4.1 Các giai đoạn trích cao lá Đu Đủ 32 4.2 Sự thay đổi màu sắc trong phản ứng DPPH. 33 4.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm khử gốc tự do vào nồng độ cao chiết 34 4.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm khử gốc tự do vào nồng độ vitamin C 36 4.5 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế XO vào nồng độ cao chiết. 38 4.6 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế XO vào nồng độ AP 39 4.7 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm ức chế vào nồng độ AP ở hai nồng độ ức chế trên và dưới 50% 40 Chuyên ngành Hóa dược vii Khoa Khoa học Tự Nhiên DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT 5-HMF 5-(hydroxymethyl)furfural AP Allopurinol DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH Di(phenyl)-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium EA Ellagic acid FAD Flavin adenine dinucleotide FAO Food and Agriculture Organization GC – MS Gas chromatography–mass spectrometry HPTLC Righ performance thin layer chromatography LC – MS Liquid chromatography–mass spectrometry LSA Lithospermic acid Mo Molybdenum MTCA 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β- carbol-ine-3-carboxylic acid NMR Nuclear magnetic resonance ROS Reactive oxygen species RPFCC Reversed-phase flash column chromatography SOD Superoxide dismutase VAD Valoneicacid dilactone XDH Xanthine dehydrogenase XO Xanthine Oxidase XOI Xanthine Oxidase inhibitory Chuyên ngành Hóa dược viii Khoa Khoa học Tự Nhiên BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨC CHẾ XANTHINE OXIDASE CỦA LÁ ĐU ĐỦ (Carica papaya L.) LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác. Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 Ký tên Lê Thị Huyền Trinh Chuyên ngành Hóa dược ix Khoa Khoa học Tự Nhiên MỤC LỤC NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ....................... i NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN ......................... ii LỜI CẢM ƠN.................................................................................................. iii TÓM TẮT ........................................................................................................ iv ASBTRACT ...................................................................................................... v DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... vii DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ...................................................................... viii LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ ix MỤC LỤC ........................................................................................................ x CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU ............................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề ................................................................................................ 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 1 1.3 Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ....................................................... 2 2.1 Sơ lược xanthine oxidase (XO) .............................................................. 2 2.1.1 Cấu tạo .............................................................................................. 2 2.1.2 Cơ chế hoạt động .............................................................................. 2 2.1.3 Phân loại............................................................................................ 2 2.1.4 Vai trò của XO trong bệnh gout và các bệnh liên quan khác ...... 3 2.1.5 Hoạt động ức chế XO ....................................................................... 3 2.2 Sơ lược về cây Đu Đủ ........................................................................... 10 2.2.1 Phân loại khoa học ......................................................................... 10 2.2.2 Nguồn gốc và phân bố.................................................................... 10 2.2.3 Đặc điểm cây Đu Đủ ...................................................................... 11 2.2.4 Các giống Đu Đủ hiện nay ............................................................. 13 2.2.5 Giới tính cây Đu Đủ ....................................................................... 14 2.2.6 Yêu cầu ngoại cảnh ........................................................................ 15 2.2.7 Tình hình sản xuất và trồng trọt .................................................. 16 2.2.8 Công dụng của từng bộ phận [49] ................................................ 16 2.3 Sơ lược về flavonoid ............................................................................. 18 Chuyên ngành Hóa dược x Khoa Khoa học Tự Nhiên 2.4 Phương pháp ngâm dầm ...................................................................... 19 2.5 Sơ lược về phương pháp trắc quang [51] ........................................... 19 2.5.1 Đặc trưng năng lượng của miền phổ ............................................ 20 2.5.2 Phân loại các phương pháp trắc quang ....................................... 20 2.5.3 Cơ sở lý thuyết của phương pháp ................................................. 20 2.5.4 Định luật Bouguer – Lambert – Beer........................................... 20 2.6 Gốc tự do ............................................................................................... 21 2.6.1 Giới thiệu về gốc tự do [52] ........................................................... 21 2.6.2 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể [52] ........................................ 21 2.6.3 Chất chống oxy hóa [53] ................................................................ 22 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.. 26 3.1 Phương tiện nghiên cứu ....................................................................... 26 3.1.1 Thời gian và địa điểm .................................................................... 26 3.1.2 Nguyên vật liệu ............................................................................... 26 3.1.3 Hóa chất .......................................................................................... 26 3.1.4 Dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 26 3.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................... 27 3.2.1 Trích cao lá Đu Đủ ......................................................................... 27 3.2.3 Khảo sát khả năng ức chế XO của cao chiết ............................... 29 3.3 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................... 31 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................. 32 4.1 Trích cao lá Đu Đủ ............................................................................... 32 4.2 Khảo sát khả năng khử gốc tự do của cao chiết bằng phương pháp DPPH ........................................................................................................... 33 4.2.1 Hoạt tính khử gốc tự do của chiết lá Đu Đủ ................................ 33 4.2.3 So sánh hoạt tính khử gốc tự do của cao chiết lá Đu Đủ và vitamin C .................................................................................................. 36 4.3 Khảo sát khả năng ức chế XO của cao chiết lá Đu Đủ ..................... 36 4.3.1 Khả năng ức chế XO của cao chiết lá Đu Đủ .............................. 36 4.3.2 Khả năng ức chế XO của AP ........................................................ 38 4.2.3 So sánh hoạt tính ức chế XO của cao chiết lá Đu Đủ và allopurinol ................................................................................................ 40 4.4 Định tính flavonoid trong cao chiết của lá Đu Đủ ............................. 40 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................... 43 Chuyên ngành Hóa dược xi Khoa Khoa học Tự Nhiên 5.1 Kết luận ................................................................................................. 43 5.2 Đề nghị ................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 44 PHỤ LỤC 1..................................................................................................... 49 PHỤ LỤC 2..................................................................................................... 51 Chuyên ngành Hóa dược xii Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, gout là một trong những căn bệnh phổ biến rộng rãi trên toàn cầu. Tăng uric acid máu và gout chiếm 5 – 30% tổng dân số thế giới [1]. Nguyên nhân là do trong bữa ăn hằng ngày chúng ta thường dung nạp một lượng lớn các nucleic acid như thịt, ngũ cốc, các loại hải sản,… Trong giai đoạn cuối của quá trình chuyển hóa các purine, XO xúc tác quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành uric acid, khi nồng độ của uric acid trong máu cao dẫn đến sự hình thành bệnh gout [2, 3, 4]. Các chất ức chế XO ngăn chặn sự sinh tổng hợp của uric acid trong giai đoạn cuối cùng, làm giảm nồng độ uric acid trong máu và do đó được sử dụng trong điều trị bệnh gout [5]. Allopurinol là một trong những chất ức chế xanthine oxidase được sử dụng rộng rãi trong việc kiểm soát và điều trị bệnh gout lâm sàng [6, 7]. Tuy nhiên, allopurinol lại cho một số tác dụng phụ như viêm gan, suy thận, dị ứng [5, 8]. Các phản ứng nghiêm trọng khác cũng từng xảy ra bao gồm một biến chứng gây tử vong được gọi là hội chứng quá mẫn allopurinol và hoại tử tế bào da [5, 9]. Do đó, việc sử dụng thích hợp các loài thực vật để thay thế cho allopurinol là một thách thức được đặt ra cho các nhà khoa học. Với ưu điểm ít tác dụng phụ đi kèm, các bài thuốc từ thảo mộc vẫn chiếm ưu thế đáng kể trong thời đại Tây y phát triển mạnh như hiện nay. Vì vậy, đề tài “Khảo sát khả năng ức chế xanthine oxidase của lá Đu Đủ (Carica papaya L.)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá khả năng ức chế hoạt động của xanthine oxidase từ cao chiết lá Đu Đủ. 1.3 Nội dung nghiên cứu - Trích cao methanol lá Đu Đủ. - Đánh giá khả năng kháng oxy hóa và ức chế xanthine oxidase từ cao chiết lá Đu Đủ. - Định tính flavonoid trong cao chiết lá Đu Đủ. Chuyên ngành Hóa dược 1 Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược xanthine oxidase (XO) 2.1.1 Cấu tạo XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lượng là 290 kDa. Mỗi monomer của protein gồm 3 phần chính. Trong đó, một phần chứa 2 tâm Fe2S2, một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin adenine dinucleotide (FAD). Phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme. Tâm Fe2S2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa được xúc tác bởi enzyme [10]. 2.1.2 Cơ chế hoạt động XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum. XO xúc tác cho sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát: RH + H2O → ROH + 2H+ + 2e-. Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành được chuyển tới các tâm nhận electron trong enzyme [11]. 2.1.3 Phân loại Ở động vật có vú có hai dạng xanthine oxidoreductase là xanthine dehydrogenase (XDH) và xanthine oxidase (XO). Hai loại enzyme này chuyển hypoxanthine thành xanthine và cuối cùng thành uric acid. Xanthine dehydrogenase chuyển hai điện tử từ hypoxanthine/xanthine đến NAD+ thành NADH trong khi XO lấy điện tử của oxy biến oxy thành gốc tự do và dưới tác dụng của SOD (Superoxide dismutase) tạo thành peroxide. Xanthine dehydrogenase trong tế bào chất chuyển thành XO bởi protease hoặc do oxy hóa acid amin cysteine [12]. Hệ thống XO có rất nhiều ở màng trong tế bào gan và ruột do những phân tử ROS phát sinh nhiều trong suốt quá trình tổn thương của gan. Bên cạnh đó, XDH bị chuyển thành XO do enzyme protease được hoạt hoá trong suốt giai đoạn giảm oxy trong máu. Tế bào tích lũy hypoxanthine sẽ tạo ra một số lượng lớn điện tử cho XO để tạo thành superoxide từ oxy [13, 14]. Chuyên ngành Hóa dược 2 Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT 2.1.4 Vai trò của XO trong bệnh gout và các bệnh liên quan khác Gout là một căn bệnh phổ biến trên thế giới, gây ra do các tinh thể natri urate đóng trong các khớp xương và những mô khác khi bão hòa urate trong máu. Chế độ dinh dưỡng giàu nucleic acid trong các thức ăn như thịt, đậu, đồ biển và các thức ăn lên men gây nên chứng cao uric acid trong máu và nếu không kịp bài tiết uric acid sẽ dẫn đến bệnh gout. Trong giai đoạn cuối của quá trình trao đổi chất, XO xúc tác cho quá trình oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành uric acid (Hình 2.1). Trong hầu hết các loài động vật có vú đều chứa enzyme uricase, enzyme này xúc tác cho quá trình chuyển hóa uric acid thành allantoin, là hợp chất có tính phân cực cao, tan trong nước, do đó được đào thải ra ngoài một cách dễ dàng. Ở người vì thiếu uricase nên quá trình trao đổi chất chỉ tạo thành uric acid. Mà uric acid này lại ít tan trong huyết tương máu và khi nồng độ trên 7 mg/dL sẽ dẫn đến bệnh gout [15]. Ngoài ra các tác nhân oxy hóa trung gian, gốc tự do anion superoxide hay hydrogen peroxide, được sinh ra bởi XO liên quan đến những tình trạng bệnh lý khác như viêm gan, viêm nhiễm, ung thư, tiều đường và lão hóa. Hình 2.1: Quá trình oxy hóa hypoxanthine và xanthine với sự xúc tác XO 2.1.5 Hoạt động ức chế XO Nồng độ XO trong huyết tương tăng đáng kể dẫn dến các bệnh lý khác nhau như viêm gan, viêm, thiếu máu cục bộ, ung thư, lão hóa. Vì vậy ức chế lộ trình enzyme sẽ rất cần thiết [16]. Ở người, sự ức chế XO làm giảm sự hình thành uric acid, một số loại thuốc ức chế XO được chỉ định cho điều trị tăng uric acid máu và các bệnh có liên quan khác bao gồm gout. Các chất ức chế Chuyên ngành Hóa dược 3 Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT XO có hai loại: tương tự purine và những loại khác. Các chất tương tự purin bao gồm allopurinol, oxypurinol và andtisopurine [17], những loại khác bao gồm febuxostat và các inositol [18]. Các chất ức chế XO hiện đang được xem xét như phương pháp điều trị tiềm năng cho các rối loạn như bệnh gout, tăng uric acid máu, loét, ung thư và oxy hoá. Chất ức chế XO không purine có ít tác dụng phụ hơn so với các chất tương tự purine, làm cho chúng phù hợp với các nghiên cứu sâu hơn, mà đáng chú ý là các bài báo và các bằng sáng chế đã được công bố. Việc tìm kiếm các chất ức chế XO mới với tác dụng phụ ít hơn và hoạt động mạnh là rất cần thiết không chỉ cho việc điều trị bệnh gout mà còn cho các bệnh khác có liên quan đến các hoạt động của XO. Chất ức chế XO allopurinol (1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidin-4(5H)-one) đã được sử dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh gout và các bệnh liên quan đến tăng uric acid máu trong nhiều thập kỷ. Hơn nửa thế kỷ sau khi phát triển, allopurinol (Hình 2.2), vẫn là một loại thuốc hàng đầu trong dòng sản phẩm được dùng trong điều trị chứng cao uric acid máu và bệnh gout [19, 20]. Tuy nhiên, allopurinol lại có nhiều tác dụng phụ như khó chịu dạ dày, nhức đầu, tiêu chảy và ngứa,… vì thế đã không ngừng thôi thúc các nhà khoa học nghiên cứu để cô lập và tổng hợp ra những loại thuốc ức chế XO hiệu quả hơn. Hình 2.2: Cấu trúc hóa học của allopurinol Các chất ức chế XO trong thiên nhiên Tetrahydroxymentoflavone (THA) Hạt Semecarpusanacardium L. đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền ở Ấn Độ cho việc điều trị các rối loạn viêm và bệnh gout. Hoạt tính sinh học các phân đoạn của S. Anacardium được đánh giá là có khả năng ức chế XO và các hoạt động chống oxy hóa. Phân đoạn ethyl acetate với hoạt động XO cao nhất với một hợp chất biflavonoid là tetrahydroxymentoflavone (THA). Giá trị IC50 của THA và allopurinol để ức chế một nửa XO lần lượt là 92 và 100 nM và giá trị KI tương ứng là 0,982 và 0,612 M. THA đã được tìm thấy là một chất ức chế XO mạnh, có thể được coi là một ứng cử viên tiềm năng cho ngăn ngừa ung thư. Kết quả nghiên cứu ủng hộ việc sử dụng y học truyền thống đối với hiệu quả chống viêm và điều trị bệnh gout của hạt S. Anacardium [21]. Chuyên ngành Hóa dược 4 Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT Valoneicacid dilactone (VAD ) and ellagic acid (EA) Các chất ức chế XO đã báo cáo được phân lập từ lá của cây Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., được sử dụng như một loại thuốc dân gian ở Philippine. Hai hợp chất có hoạt tính sinh học đã được phân lập từ dịch trích nước là valoneic acid dilactone (VAD) and ellagic acid (EA). Kết quả đã chứng minh rằng hiệu quả ức chế XO của VAD mạnh hơn hẳn allopurinol – một loại thuốc lâm sàng được sử dụng cho việc ức chế XO. Kết quả này đã giải thích và ủng hộ việc sử dụng chế độ ăn uống các dịch trích nước từ các loài Lagerstroemia speciosa (L.) Pers. để ngăn ngừa và điều trị chứng tăng uric acid máu [22]. Caffeic acid Trong y học dân gian, cây dương xỉ Cyatheaspinulosa đã được sử dụng trong điều trị bệnh gout, thành phần có hoạt tính nhất của nó là caffeic acid, nhưng nó chỉ là một chất ức chế XO yếu [23]. 5-(hydroxymethyl)furfural và 1-methyl-1,2,3,4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid (MTCA) Giấm đã được sử dụng như một biến pháp thay thế trong điều trị bệnh gout, trên cơ sở khoa học điều này có thể giải thích. Giấm Red-koji thể hiện hoạt tính ức chế XO tiềm năng và do đó được sử dụng để phân lập các hợp chất có hoạt tính. 5-(hydroxymethyl)furfural (5-HMF) và 1-methyl-1,2,3,4tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid (MTCA) đã được phân lập và được xác định bởi các đặc trưng trong LC – MS and NMR. Chúng được báo cáo rằng có hoạt tính ức chế XO tiềm năng. Nồng độ ức chế tối thiểu một nửa XO IC50 của 5-HMF and MTCA tương ứng là 168 và 860 μg/mL [24]. Phytic acid Phytic acid là phân tử phosphoryl hóa cao, hiện diện phong phú trong các loài thực vật, chiếm 1 – 5 % khối lượng các loại đậu, ngũ cốc và các hạt có dầu đã tìm thấy hoạt tính ức chế XO [25]. Lithospermic acid Lithospermic acid (LSA) được phân lập từ rễ của Salvia mitiorrhiza, đã tìm thấy khả năng làm giảm sự hình thành uric acid, khử gốc tự do superoxide và thể hiện sự ức chế cạnh tranh XO. LSA có hoạt tính kháng viêm trong một dạng viêm khớp gout [26]. Các dẫn xuất Apigenin Palhinhaeacernua từ lâu đã được sử dụng như một thuốc truyền thống ở Trung Quốc trong việc điều trị các bệnh thấp khớp. Cô lập các hợp chất từ Chuyên ngành Hóa dược 5 Khoa Khoa học Tự Nhiên Luận văn tốt nghiệp đại học Trường ĐHCT phân đoạn ethanol của dịch trích cho các dẫn xuất Apigenin mới đã thể hiện hoạt tính ức chế XO tốt. Sự phân đoạn dịch trích ethanol của Palhinhaeacernua còn dẫn đến sự cô lập ra được một hợp chất mới (1apigenin-4'-O-(2''-O-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside ngoài dillenetin, rhamnazin, α-onocerin, β-sitosterol, và (E)-2-hydroxy-5-methoxycinnamic acid. Hợp chất glycoside mới này đã cho thấy hoạt động ức chế XO với IC 50 khoảng 23,95  0,43 µM [27]. Cinnamaldehyde Đã có báo báo chứng minh rằng tinh dầu từ lá Cinnamomumosmophloeum có hoạt tính ức chế XO mạnh, Cinnamomumosmophloeum như là một thành phần chính trong tinh dầu. Hoạt tính ức chế XO và hiệu quả làm giảm uric acid máu của dịch trích từ Cinnamomumosmophloeum đã được đánh giá trên chuột trong một nghiên cứu. Kết quả chứng minh rằng tinh dầu của lá C. osmophloeum thể hiện hoạt tính ức chế XO rất mạnh (IC50 = 16,3 µg/mL), nhưng hoạt tính ức chế XO không đáng kể đối với dịch trích ethanol và nước nóng. Hợp chất chính của tinh dầu – cinnamaldehyde thể hiện hoạt tính ức chế XO tiềm năng với IC50 = 8,4 µg/mL. Dựa trên các kết quả trong nghiên cứu này, cinnamaldehyde có thể là hợp chất dẫn đầu tiềm năng cho việc phát triển các thuốc hạ uric acid máu [8]. Kaempferol, Quercetine, 5,7-dimethoxycoumarin Lá trưởng thành khô của Carica papaya L. được trích với nước cất và được tối ưu hóa dể đạt được hoạt tính ức chế XO cao hơn. Kế đến dịch trích phải được tinh sạch bằng sắc ký cột nhanh pha đảo (RPFCC) và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC). Đánh giá sơ bộ bằng sàng lọc hóa học cho thấy sự hiện diện của một vài chất chuyển hóa thứ cấp chính như flavonoid, alkaloid, saponin, xanthine alkaloid, terpenoid và anthranol glycoside là các chất có thể đóng vao trò cho tính chất dược lý cho thực vật này và sự quan trọng của nó trong bữa ăn hằng ngày của các bệnh nhân gout. Trong y học cổ truyền, Carica papaya L. được sử dụng vì nó chứa các hợp chất tự nhiên như kaempferol, quercetine, 5,7-dimethoxycoumarin, carpain, pseudocarpain [29]. Polyphenol Các hợp chất polyphenol hiện diện trong các cây họ đậu có lợi cho sức khỏe con người. Các thức ăn chứa các hợp chất polyphenol chủ yếu như flavonoid, có khả năng kháng oxi hóa và là chất ức chế tiềm năng hoạt động của XO. Một vài phân đoạn của polyphenol và các hợp chất tinh khiết được phân lập từ hai dịch trích của thực vật họ đậu đã được thử nghiệm hiệu quả của chúng trên hoạt tính ức chế XO. Các phân đoạn phân lập từ dịch trích của Chuyên ngành Hóa dược 6 Khoa Khoa học Tự Nhiên