Tài liệu Khảo sát quá trình thủy phân cellulose trong bã mía bằng enzym cellulase

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN VĂN TẾ MSSV: LT08191 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN CELLULOSE TRONG BÃ MÍA BẰNG XÚC TÁC ENZYME CELLULASE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Giáo viên hướng dẫn VŨ TRƯỜNG SƠN Cần Thơ, tháng 05/2010 i Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Lời ñầu tiên xin gửi lòng biết ơn chân thành ñến thầy Vũ Trường Sơn ñã nhiệt tình hướng dẫn và giúp ñỡ em hoàn thành bài luận văn này. Sau quá trình học tập ở Trường niên khoá 2008-2010 em ñã ñược quí thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm tận tình dạy dỗ và truyền ñạt những kiến thức chuyên môn hết sức quý báu ñể giúp em làm hành trang bước vào thực tế. Em xin gửi lời chân thành cảm ơn ñến quý Thầy Cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng Dụng, Trường ðại học Cần Thơ. Chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm cùng các bạn sinh viên lớp Công Nghệ Thực Phẩm khóa 34 ñã nhiệt tình giúp ñỡ, ñóng góp ý kiến và tạo ñiều kiện tốt cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Trân trọng kinh chào! Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm i Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ TÓM LƯỢC Bã mía chiếm tỉ lệ lớn trong các phụ phẩm nông nghiệp ở Việt Nam. Với thành phần chứa hơn 45% là cellulose, bã mía là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân bằng enzyme cellulase. Luận văn này nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố: % bã rắn, % enzyme, nhiệt ñộ, pH lên quá trình thuỷ phân. Bã mía ñược cắt nhỏ và ñược tiền xử lý bằng N a O H ñể phá vỡ cấu trúc. Sau ñó ñược tiến hành thuỷ phân bằng enzyme cellulase. Kết quả cho thấy rằng, quá trình thuỷ phân diễn ra tốt nhất trong ñiều kiện: 12% bã rắn, 6% enzyme, nhiệt ñộ 50oC và pH 4,8, tương ứng nồng ñộ glucose thu ñược là 5,69 %, thời gian thủy phân 25 giờ. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm ii Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM LƯỢC......................................................................................................................ii MỤC LỤC...................................................................................................................... iii DANH SÁCH BẢNG .....................................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH .................................................................................................... vii Chương 1: GIỚI THIỆU .............................................................................................1 1.1 ðặt vấn ñề.................................................................................................................1 1.2 Mục tiêu.............................................................................................................................. 1 Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU.......................................................................2 2.1 Nguyên liệu................................................................................................................2 2.1.1 Giới thiệu .............................................................................................................2 2.1.2 Thành phần hóa học của vài loại lignocellulose .................................................... 3 2.2 Cellulase ....................................................................................................................3 2.3 Hemicellulose ............................................................................................................4 2.4 Lignin.........................................................................................................................6 2.5 Enzyem ......................................................................................................................9 2.5.1 Khái niệm ...........................................................................................................9 2.5.2 Tính ñặc hiệu của enzyme....................................................................................9 2.5.3 Cơ chế tác dụng cellulase....................................................................................9 2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến vận tốc phản ứng enzyme ........................................11 2.6.1 Nồng ñộ cơ chất.................................................................................................11 2.6.2 Nồng ñộ enzyme.................................................................................................11 2.6.3 pH môi trường ..................................................................................................11 2.6.4 Ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ .....................................................................................12 2.6.5 Ảnh hưởng của các chất ức chế ........................................................................13 2.7 Một số ứng dụng của cellulase ..............................................................................14 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm iii Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ 2.7.1 Một số ứng dụng của cellulase trong thực phẩm .............................................14 2.7.2 Trong sản xuất thức ăn gia súc .........................................................................15 2.7.3 Trong công nghiệp dệt, giấy, xử lý môi trường ................................................. 15 Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM.............16 3.1 Phương tiện nghiên cứu .........................................................................................16 3.1.1 ðịa ñiểm, thời gian thực hiện ............................................................................16 3.1.2 Hóa chất thí nghiệm ..........................................................................................16 3.1.3 Dụng cụ thiết bị thí nghiệm ...............................................................................16 3.2 Phương pháp thí nghiệm .......................................................................................17 3.2.1 Nguyên liệu ........................................................................................................17 3.2.2 Enzyme...............................................................................................................17 3.2.3 Quy trình công nghệ ..........................................................................................18 3.3 Nội dung thí nghiệm...............................................................................................19 3.3.1 Thí nghiệm 1: Xác ñịnh thời gian thủy phân thích hợp.....................................19 3.3.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ cơ chất sử dụng ñối với phản ứng thủy phân. ...................................................................................................................19 3.3.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng nồng ñộ enzyme xúc tác...........................20 3.3.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt ñộ ảnh hưởng ñến quá trình thủy phân ñể tìm ra một nhiệt ñộ thích hơp ...............................................................................................20 3.3.5 Thí nghiệm 5: khảo sát sự ảnh hưởng pH thủy phân ........................................21 3.4 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu...................................................................... 22 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................23 4.1 Ảnh hưởng thời gian thủy phân............................................................................23 4.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ........................................................................24 4.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào.................................................................26 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ.........................................................................................28 4.5 Ảnh hưởng của pH .................................................................................................29 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm iv Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ ...................................................................32 5.1 Kết luận ...................................................................................................................32 5.2 ðề nghị .............................................................................................................................. 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................33 PHỤ LỤC.................................................................................................................... viii PHỤ LỤC 1: XÁC ðỊNH HÀM LƯỢNG ðƯỜNG GLUCOSE THEO PHƯƠNG PHÁP LANE – EYNON ............................................................................................. viii PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ THỐNG KÊ BẰNG PHẦN MỀM STATRAPHIC 3.1 ...xi Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm v Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10]................................................3 Bảng 2: Kết quả ảnh hưởng bởi thời gian lấy mẫu .........................................................23 Bảng 3: Kết quả ảnh hưởng bởi % bã mía ......................................................................25 Bảng 4: Kết quả Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào............................................2626 Bảng 5: Kết quả Ảnh hưởng của nhiệt ñộ .......................................................................28 Bảng 6: Kết quả Ảnh hưởng của pH ...............................................................................29 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm vi Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose .................................................................................3 Hình 2: Cấu trúc bó mạch các vi sợi cellulose ..............................................................4 Hình 3: Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan ..................................................................5 Hình 4: Glucomannan.....................................................................................................5 Hình 5: Galactoglucomanna...........................................................................................6 Hình 6: Arabinoglucuronoxylan....................................................................................6 Hình 7: Các ñơn vị cơ bản của lignin ............................................................................7 Hình 8: Cấu trúc lignin trong gỗ mềm ..........................................................................7 Hình 9: Mối quan hệ cellulose – hemicellulose - lignin trong cấu trúc lignocellulose8 Hình 10: Biểu diễn vị trí cắt cellulose của hệ enzyme cellulase ................................10 Hình 11: Sơ ñồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose ..............10 Hình 12: Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất .................................................................11 Hình 13: Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme..................................................................11 Hình 14 Ảnh hưởng của pH ñến hoạt ñộng của enzyme ...........................................12 Hình 15: Tốc ñộ phản ứng enzyme theo nhiệt ñộ.......................................................13 Hình16: Chất kìm hãm cạnh tranh .............................................................................14 Hình 17: Sơ ñồ quy trình công nghệ............................................................................18 Hình 18: Nồng ñộ glucose tạo thành theo thời gian ...................................................23 Hình 19: Nồng ñộ glucose tạo thành theo thời gian ứng với % bã rắn....................25 Hình 20: Nồng ñộ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các nồng ñộ enzyme..27 Hình 21: Nồng ñộ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt ñộ ....28 Hình 22: Nồng ñộ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH.............30 Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm vii Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 ðặt vấn ñề Nước ta là một nước nông nghiệp do ñó hàng năm có một lượng lớn phụ phẩm nông nghiệp. Trong ñó bã mía hàng năm khoảng 3,5 ÷ 4 triệu tấn. Bã mía là phụ phẩm còn lại sau khi ép lấy ñường, bã mía sau khi ép thì hàm lượng chất khô khoảng 54,48 %, protein thô 1,22 %, xơ thô khoảng 23,08 %, béo thô khoảng 1,13 %, và tro khoảng 2,77%. ( Lê Song Dự, Nguyễn Thị Mùi, 1997). Sử dụng phế phẩm phụ trong nông nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, làm thức ăn cho gia súc, và ñặc biệt là thủy phân tạo ra ñường glucose cung cấp cho quá trình sản xuất cồn ethylic. Nhằm làm giảm giá thành sản xuất ñem lại hiệu quả kinh tế cao. ðồng thời giải quyết một lượng lớn các phụ phẩm nông nghiệp không làm ô nhiễm môi trường. Chính vì thế tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “khảo sát quá trình thủy phân cellulose trong bã mía bằng xúc tác enzyme cellulase” 1.2 Mục tiêu Mục ñích chính của ñề tài “Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose trong bã mía bằng xúc tác enzyme cellulase” ñã qua tiền xử lý bằng NaOH, ñể tạo ra dịch ñường glucose. Các nội dung chính cần phải thực hiện: - Khảo sát thời gian thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng lượng cơ chất ñến quá trình thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme ñi với quá trình thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt ñộ ñến quá trình thủy phân. - Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch ñến quá trình thủy phân. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 1 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Giới thiệu Mía (Saccharum oficinarum) là nguồn cung cấp ñường cho các nước nhiệt ñới và cận nhiệt ñới trên thế giới. Mía gồm có 6 loài, cây ña niên thuộc giống saccharum L, dòng Ropogoneae, họ hòa thảo. Nước mía thì rất ngọt và tinh thể ñường ñã nổi tiếng ở Trung Quốc và Ấn ðộ cách ñây 2500 năm. Cây mía ñã tiến tới vùng ñịa trung hải vào khoảng thế kỷ thứ VIII sau công nguyên. Mía (Saccharum oficinarum) là một loại cây trồng có khả năng chuyển hóa năng lượng từ ánh sáng mặt trời thành năng lượng hóa học cao hơn bất kỳ loại cây trồng khác nào, có thể sản xuất 10 tấn ñường/ha/năm. Mía sau khi thu hoạch, ñưa vào nhà máy ñược rửa và cắt ra thành từng ñoạn nhỏ và sau ñó ñược ép qua máy ép. Máy ép bao gồm có hai bộ phận, phần trục có rãnh nằm bên trên và bên dưới. Mía ñược ép vài lần, phần trên trục ép sẽ phun nước với áp lực khoảng 20% trộn lẫn phần nước mía ở cối ép ñể trích ly nước mía triệt ñể hơn. Phần còn lại gọi là bã mía (bagasse) có thể làm nhiên liệu hay thức ăn gia xúc và ñặc biệt là ñem ñi thủy phân tạo ñường glucose cung cấp cho quá trình lên men tạo thành cồn ethylic. Theo tài liệu thực vât học năng suất mía trung bình hàng năm từ 25 ÷ 94 tấn/ha. Một tấn mía cung cấp 250 kg bã mía khi ñốt cháy cung cấp 6000 kg hơi nước. Khoảng 4000 kg hơi nước có thể sản xuất 60 lít cồn/tấn mía hay 6000 lít cồn/ha. Phân tích 62 loại sinh khối sản sinh nhiệt, năm 1985 hai nhà khoa học Jenkins và Ebeling báo cáo rằng nhiệt do bã mía sinh ra 17,33 ÷ 16,62 MJ/kg so sánh với rơm 13,76 ÷ 23,28 MJ/Kg. Bã mía chiếm khoảng 25 ÷ 30 % trọng lượng mía ñem ñi ép. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 2 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ 2.1.2 Thành phần hóa học của vài loại lignocellulose Bảng 1: Thành phần của vài loại lignocellulose Nguồn gốc Cellulose Gỗ vân sam 41,9 Xylane 6,1 Hemicellulose Lignin Mannan Galactan Arabianan 14,3 1,2 27,1 Chất trích ly 9,6 Gỗ Thông 37,7 4,6 7,0 27,5 10,8 Gỗ cây bulo 38,2 18,5 1,2 22,8 4,8 Gỗ dương 49,9 17,4 4,7 1,2 1,8 18,1 Rơm lúa mì 38,2 21,2 0,3 2,5 23,4 13,0 Bã mía(*) 45 - 55 25 13,52 (*) Nguồn: Huỳnh Thanh Nông, “Nghiên cứu các biện pháp bảo quản ñể nâng cao chất lượng bã mía làm thức ăn tăng trưởng”,2005. (-) không xác ñịnh 2.2 Cellulase Cellulose là polyme sinh học phong phú, nó là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật. Cellulose có cấu tạo là homopolyme mạch thẳng chứa trên 1.000 ñơn vị β-D glucosepyranose gắn với nhau bằng liên kết β-1,4 glucozide. Cellulose lại rất bền vững và khó bị phá vỡ vì cellulose có ñộ kết tinh cao, không tan trong nước, có khả năng chống lại các quá trình depolymer hóa. Cellulose thì ñây là cơ chất gây khó khăn cho sự thuỷ phân bởi enzyme. Cấu trúc của cellulose gồm những ñơn vị cellubiose lặp lại, mỗi cellubiose gồm 2 ñơn vị β-glucose. Hình 1: Cấu tạo phân tử cellulose http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose Từng ñơn vị glucose liên kết qua C1 và C4 tạo thành chuỗi dài. Từng chuỗi ñơn glucose xếp chồng lên nhau tạo thành vi sợi, từng sợi cellulose ñược giữ bằng liên kết hydro. Những vi sợi cellulose thường không ñồng nhất và chứa hai vùng: Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 3 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ -Vùng vô ñịnh hình, cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bị tác ñộng bởi yếu tố bên ngoài. Khi gặp nước chúng dễ bị trương phồng lên, enzyme cellulase rất dễ tấn công và làm thay ñổi cấu trúc của chúng. - Vùng kết tinh, cellulose có cấu trúc trật tự rất cao và rất bền vững với tác ñộng của ñiều kiện bên ngoài. Enzyme cellulase chỉ có tác dụng bề mặt hệ sợi ở vùng này. Hình 2: Cấu trúc bó mạch các vi sợi cellulose http://vi.wikipedia.org/wiki/Cellulose ðộng vật không có chứa enzyme phân cắt vùng tinh thể cellulose nhưng có một vài vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có khả năng thủy phân cellulose thành những oligosaccharide và có thể thành ñường glucose như là nguồn cacbon cho vi sinh vật sử dụng. Những vi sinh vật này tồn tại trong dạ dày của ñộng vật. Cellulose cũng bị thủy phân bởi những vi sinh vật hiện diện trong dạ cỏ của ñộng vật nhai lại. 2.3 Hemicellulose Hemicellulose là một loại polyme phức tạp và phân nhánh, ñộ trùng hợp khoảng 70 ñến 200 DP. Hemicellulose chứa cả ñường 6 gồm glucose, mannose và galactose và ñường 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β - D-xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -1,4. Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và ña dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên có một vài ñiểm chung gồm: - Xylose là thành phần quan trọng nhất. - Mạch chính của hemicellulose ñược cấu tạo từ liên kết β - 1,4. - Nhóm thế phổ biến nhất là nhóm acetyl. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 4 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ - Mạch nhánh cấu tạo từ các nhóm ñơn giản, thông thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Vì hemicellulose có mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vô ñịnh hình vì thế dễ bị thủy phân. ðặc ñiểm hemicellulose của gỗ cứng và gỗ mềm: + Gỗ cứng chủ yếu có hai loại hemicellulose Loại thứ nhất là Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan là một loại polyme có mạch chính gồm β - D - xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β - D -1,4. Trong ñó 70% các nhóm OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hóa, 10% các nhóm ở vị trí C2 liên kết với acid 4-O-methyl β - D-glucuronic. Gỗ cứng còn chứa glucomannan, polyme này chứa một tỉ lệ bằng nhau β - D-glucopyranose và β - D-gannopyranose Hình 3: Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan Hình 4: Glucomannan Loại thứ hai là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại hemicellulose này tạo liên kết tại nhóm OH ở vị trí C6 với ∝-L-arabinose, β-D-galactose hoặc acid β-D-glucoronic. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 5 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, ñây là polyme cấu thành từ các phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-1,4, tỉ lệ hai monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay ñổi tùy theo loại gỗ. Hình 5: Galactoglucomanna Loại thứ 2 là arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng ∝- Larabinofuranose. Hình 6: Arabinoglucuronoxylan 2.4 Lignin Lignin là một polyphenol có cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu ñóng vai trò chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khó ñể có thể tách lignin ra hoàn toàn. Lignin là polyme, ñược cấu thành từ các ñơn vị phenylpropene, vài ñơn vị cấu trúc ñiển hình ñược ñề nghị là guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl, syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl, p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-courmary. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 6 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Hình 7: Các ñơn vị cơ bản của lignin Cấu trúc của lignin ña dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của lignin trong gỗ. Ngoài việc lignin ñược phân loại theo gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin có thể ñược phân thành hai loại chính: guaiacyl lignin và guaiacyl-syringly lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringly. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu ñó sẽ khó bị tấn công bởi enzyme hơn syringly lignin. Hình 8: Cấu trúc lignin trong gỗ mềm Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 7 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ Những nghiên cứu gần ñây chỉ ra rằng lignin hoàn toàn không ñồng nhất trong cấu trúc. Nó bao gồm vùng vô ñịnh hình và các vùng có cấu trúc hình chữ nhật hoặc hình cầu. Bên cạnh ñó lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn không có vùng vô ñịnh hình. Các vòng phenyl trong lignin của gỗ mềm ñược sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào. Ngoài ra, cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của lignin ñều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Nhóm chức ảnh hưởng ñến hoạt tính của lignin là nhóm phenolic hydroxyl tự do, methoxy, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhóm cacbon. Guaicyl lignin chứa nhiều nhóm phenolic hydroxyl hơn syringyl. Lignin có liên kết hóa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose ( không nhiều) ñộ bền hóa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hóa học của lignin và những ñơn vị ñường tham gia liên kết. Carbon alpha (C ∝) trong cấu trúc phenyl propane là nơi có khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các ñường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-Omethylglucuronic là các nhóm thường liên kết với lignin. Các liên kết có thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhóm khử của hemicellulose và nhóm OH phenolic của lignin). Mối quan hệ giữa cellulose, hemicellulose và lignin. Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này ñược gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này ñược bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn công của enzyme cũng như các hóa chất trong quá trình thủy phân. lignin Cellulose microfibril Primary Vách tế bào Cell wall sơ cấp hemicellulose Màng nhầy chất nguyên sinh Protein hòa tan Hình 9: Mối quan hệ cellulose – hemicellulose - lignin trong cấu trúc lignocellulose http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 8 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ 2.5 Enzyem 2.5.1 Khái niệm Cellulase là một loại enzyme, có thể ñược sản xuất từ vi khuẩn hoặc sinh vật ñơn bào, nấm mốc, có khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4 2.5.2 Tính ñặc hiệu của enzyme Tính ñặc hiệu là khả năng xúc tác của enzyme ñối với cơ chất nhất ñịnh. Mỗi enzyme ñều có tác dụng chọn lọc ñối với một cơ chất hoặc một loại cơ chất nhất ñịnh và ñối với một phản ứng hóa học nhất ñịnh. Tính chất xúc tác ñặc hiệu ñó gọi là tính ñặc hiệu của enzyme. Tính ñặc hiệu là một trong những tính chất cơ bản nhất của enzyme. Do cấu trúc hóa lý ñặc biệt của enzyme và ñặc biệt là trung tâm hoạt ñộng mà enzyme có tính ñặc hiệu rất cao so với phản ứng thông thường khác. ðặc hiệu kiểu phản ứng mỗi enzyme chỉ có thể xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển hóa nhất ñịnh trong các kiểu phản ứng như oxy hóa khử, phản ứng thủy phân. 2.5.3 Cơ chế tác dụng cellulase Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose ñược thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp ñồng của 3 enzyme khác nhau tạo thành ligosacharide, cellobiose và cuối cùng glucose. Cellulase ñược chia làm 3 loại: + Endoglucanase (EG) = 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (EC 3.2.1.4) enzyme này sẽ tấn công ngẫu nhiên vào các liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose, lichenin và 1,3-1,4-β glucan cả tan và không tan. Sản phẩm của quá trình phân giải là 1,4-β-dextrin, hỗn hợp 1,3-1,4-β-dextrin. + Exoglucanase (CBH) = 1,4-β-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91), phân cắt ñầu không khử của chuỗi cellulose ñể tạo thành cellobiose. Enzyme này còn có tên khác như: cellobiohydrolase, exocellulase, cellobiosidase + β-glucosidase = Cellobiase (EC 3.2.1.21) Enzyme này tham gia phân hủy cellobiose và các cellodextrin phân tử thấp tạo thành glucose. Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 9 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 Vùng kết tinh ðại học Cần Thơ Vùng vô ñịnh hình Endoglucanase Hình 10: Biểu diễn vị trí cắt cellulose của hệ enzyme cellulase Beldman & Vincken, 2002 Hình 11: Sơ ñồ cơ chế tác dụng của phức hệ cellulase lên mạch cellulose http://www.enzymeindia.com/enzymes/cellulase.asp Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 10 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ 2.6 Các yếu tố ảnh hưởng ñến vận tốc phản ứng enzyme 2.6.1 Nồng ñộ cơ chất Khi nồng ñộ cơ chất tăng, tốc ñộ phản ứng enzyme tăng, vì có nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng ñộ cơ chất ñủ lớn, các enzyme bị bão hòa cơ chất. Vì vậy, tăng nồng ñộ cơ chất thì tốc ñộ phản ứng sẽ không thay ñổi ñáng kể. Hình 12: Ảnh hưởng của nồng ñộ cơ chất 2.6.2 Nồng ñộ enzyme Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng ñộ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc ñộ phản ứng. Tuy nhiên, khi nồng ñộ enzyme ñạt ñến một lượng nào ñó, nồng ñộ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc ñộ phản ứng. Khi ñó, tốc ñộ phản ứng sẽ không tăng nữa mà là một ñường nằm ngang như trong hình vẽ. Hình 13: Ảnh hưởng của nồng ñộ enzyme 2.6.3 pH môi trường Enzyme rất nhạy cảm với sự thay ñổi của pH môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt ñộng mạnh nhất ở một vùng pH xác ñịnh gọi là pH tối thích. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh ñến phản ứng của enzyme. pH tối thích của ña số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hay trung tính. Tuy nhiên cũng có một số ít có pH tối thích trong vùng acid mạnh hay kiềm mạnh. pH môi trường thường ảnh hưởng ñến mức ñộ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng ñến ñộ bền của protein enzyme. Do ñó tốc ñộ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần ñến giá trị Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 11 Luận văn tốt nghiệp CNTP34LT-2010 ðại học Cần Thơ cực ñại và sau ñó sẽ giảm dần. ðối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4.6 ÷ 5.0, trong ñó tốt nhất là 4.8. 60 30 3 5 7 Hình 14 Ảnh hưởng của pH ñến hoạt ñộng của enzyme 2.6.4 Ảnh hưởng bởi nhiệt ñộ Do bản chất hoá học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hoá học. Tốc ñộ phản ứng thủy phân tăng khi nhiệt ñộ tăng. Tốc ñộ phản ứng của enzyme không phải lúc nào cũng tỉ lệ thuận với phản ứng. Tốc ñộ chỉ tăng ñến một nhiệt ñộ nhất ñịnh. Vược quá giới hạn ñó, tốc ñộ phản ứng sẽ giảm dần và ñến mức triệt tiêu. Nhiệt ñộ tương ứng với tốc ñộ phản ứng enzyme cao nhất ñược gọi là nhiệt ñộ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt ñộng mạnh nhất ở nhiệt ñộ từ 40oC ÷ 50o C. Riêng ñối với enzyme cellulase, nhiệt ñộ tối ưu là 50 o C. Những enzyme khác nhau ñều có nhiệt ñộ tối ưu khác nhau. Nếu ñưa nhiệt ñộ cao hơn nhiệt ñộ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi ñó enzyme không có khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt ñộ 0o C, enzyme bị hạn chế hoạt ñộng rất mạnh, nhưng khi ñưa nhiệt ñộ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần ñều ñến mức tối ưu. Vận tốc phản ứng tăng từ 1,4 ÷ 2 lần khi nhiệt ñộ tăng 10o C Chuyên ngành Công nghệ Thực phẩm-Khoa Nông Nghiệp và Sinh học Ứng dụng This document is created by GIRDAC PDF Converter Trial version GIRDAC PDF Converter Full version does not add this green footer Full version can be ordered from http://www.girdac.com/Products/Buy.htm 12