BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
NGUYỄN QUỲNH NAM
PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN
HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU
CHẢY TRÊN HEO
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
PHÂN LẬP VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS TRONG PHÂN
HEO VÀ THỬ ĐỐI KHÁNG VỚI E. COLI GÂY BỆNH TIÊU
CHẢY TRÊN HEO
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Giáo viên hƣớng dẫn:
Sinh viên thực hiện:
TS.Nguyễn Ngọc Hải
Nguyễn Quỳnh Nam
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
ISOLATE BACILLUS SUBTILIS IN PIG FECES AND
TEST THE ANTAGONISM WITH E. COLI K88
Graduation thesis
Major: Biotechnology
Professor
Student
Dr. Nguyễn Ngọc Hải
Nguyễn Quỳnh Nam
Term: 2002 - 2006
Ho Chi Minh City
09/2006
LỜI CẢM TẠ
Con xin thành kính khắc ghi công lao khó nhọc của cha mẹ, Ngƣời đã sinh
thành, dƣỡng dục và hy sinh tất cả để cho anh em con ăn học nên ngƣời. Con xin cảm
ơn gia đình đã là chỗ dựa vững chắc cho con vững bƣớc qua mọi khó khăn.
Em xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. HCM, ban Chủ Nhiệm bộ môn
Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện cho em thực hiện thành công khóa luận.
TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi và
trang bị cho em những kiến thức cần thiết nhất để em hoàn tất khóa luận này.
Toàn thể Thầy, Cô đã trang bị cho em những kiến thức quí báu.
Các Thầy, Cô tại phòng thực tập vi sinh đã hết lòng giúp đỡ và cho em những
kinh nghiệm quí báu để em thực hiện thành công khóa luận này.
Các anh chị, các bạn cùng thực tập trong phòng vi sinh đã khuyến khích , ủng
hộ và giúp đỡ để em thực hiện tốt khóa luận này.
Các bạn lớp công nghệ sinh học 28 đã luôn ở bên mình, động viên và nhiệt tình
giúp đỡ mình trong suốt thời gian mình học tập cũng nhƣ trong lúc mình thực hiện
khóa luận này.
Tp Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 07 năm 2006
Nguyễn Quỳnh Nam
iii
TÓM TẮT
Enterotoxigenic E. coli là nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy phổ biến trên heo
con và heo đang cai sữa, trong khi những hạn chế của kháng sinh trong việc khống chế
E. coli gây bệnh tiêu chảy, thì các chế phẩm sinh học từ Bacillus subtilis chƣa thực sự
hiệu quả trong phòng và trị bệnh. Trong đề tài này chúng tôi phân lập các chủng
Bacillus subtilis trong phân heo có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của E. coli gây
bệnh tiêu chảy trên heo.
Chúng tôi phân lập đƣợc 22 chủng Bacillus subtilis trong phân heo, có 13
chủng tạo đƣợc vòng kháng khuẩn với E. coli, có thể sự tổng hợp của kháng sinh ức
chế sự phát triển của E. coli đƣợc kích thích bởi một nồng độ E. coli đủ lớn, kháng
sinh đƣợc Bacillus subtilis tổng hợp từ giai đoạn rất sớm của sự phát triển ( 0 giờ - 12
giờ ) khi có sự hiện diện của E. coli. Có 5 chủng cho thấy sự ức chế mạnh mẽ E. coli
và nhạy cảm với các loại kháng sinh đƣợc thử nghiệm trừ colistin
iv
MỤC LỤC
CHƢƠNG
TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ ............................................................................................................... i
Tóm tắt ................................................................................................................... ii
Mục lục .................................................................................................................. iii
Danh mục các chữ viết tắt ..................................................................................... iv
Danh sách các hình ................................................................................................ v
Danh sách các bảng ............................................................................................... vi
1. MỞ ĐẦU.......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................. 1
1.2. Mục đích và yêu cầu .................................................................................. 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................ 3
2.1. E. coli gây bệnh tiêu chảy ......................................................................... 3
2.2. Enterotoxigenic E. coli .............................................................................. 4
2.2.1. Độc tố nhạy nhiệt LT ...................................................................... 4
2.2.1.1. Cấu tạo của LT-1 .................................................................. 4
2.2.1.2. Cơ chế tác động của độc tố LT-1 ......................................... 4
2.2.2. Độc tố kháng nhiệt .......................................................................... 5
2.2.2.1. Độc tố kháng nhiệt STa ........................................................ 5
2.2.2.2. Độc tố kháng nhiệt STb........................................................ 6
2.2.3. Yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC ................................... 7
2.3. Chế phẩm sinh học .................................................................................... 9
2.3.1. Định nghĩa ....................................................................................... 9
2.3.2. Cơ chế tác động .............................................................................. 9
2.3.3. Ứng dụng của chế phẩm sinh học .................................................. 9
2.3.4. Yêu cầu của chế phẩm sinh học .................................................... 10
2.3.5. Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis 10
2.4. Bacillus subtilis ....................................................................................... 11
2.4.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................ 11
2.4.2. Đặc điểm hình thái ........................................................................ 11
2.5. Kháng sinh đƣợc tổng hợp bởi Bacillus subtilis ...................................... 13
2.5.1. Giới thiệu ........................................................................................ 13
2.5.2. Peptide antibiotic đƣợc tổng hợp bằng ribosome ........................... 14
2.5.2.1. Subtilin ............................................................................... 14
2.5.2.2. Subtilosin ............................................................................ 15
2.5.2.3. Sublancin ............................................................................ 16
2.5.2.4. TasA ................................................................................... 16
2.5.3. Peptide antibiotic không đƣợc tổng hợp bằng ribosome ............... 18
2.5.3.1. Surfactin ............................................................................. 17
2.5.3.2. Fengycin ............................................................................. 19
2.5.3.3. Mycosubtilin ....................................................................... 29
2.5.3.4. Bacilysocin ......................................................................... 20
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 22
v
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .................................................... 22
3.1.1. Thời gian ....................................................................................... 22
3.1.2. Địa điểm ........................................................................................ 22
3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................... 22
3.2.1. Mẫu thí nghiệm ............................................................................. 22
3.2.2. Hóa chất ......................................................................................... 22
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ...................................................... 22
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ......................................................................... 22
3.3.1. Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ...................... 22
3.3.2. Các phản ứng thử sinh hóa ............................................................ 23
3.3.3. Thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ........................... 24
3.3.4. Đánh giá sự đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSB .............. 24
3.3.5. Thử kháng sinh đồ ......................................................................... 24
3.3.6. Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%........... 24
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 25
4.1. Kết quả .................................................................................................... 25
4.1.1. Kết quả phân lập Bacillus subtilis trong phân heo ........................ 25
4.1.2. Kết quả thử đối kháng với E. coli trên môi trƣờng TSA ............... 27
4.1.3. Kết quả đối kháng trên môi trƣờng TSB ....................................... 29
4.1.4. Kết quả thử kháng sinh đồ ............................................................. 30
4.1.5. Kết quả đánh giá khả năng phân giải tinh bột ............................... 32
4.2. Thảo luận .................................................................................................. 32
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 33
5.1. Kết luận ................................................................................................... 33
5.2. Đề nghị .................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 34
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 39
vi
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
ETEC : Enterotoxigenic E. coli
EAEC : Enteroaggregative E. coli
LT
: Heat-labile toxin
ST
: Heat-stable toxin
CT
: Cholera enterotoxin
EAST : Enteroaggreative stable-toxin
ENS
: Enteric nervous system
GC-C : Guanylate cyclase C
ABC
: ATP-binding cassette
vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 4.1 : Kết quả phân lập trên môi trƣờng TSA .............................................. 25
Hình 4.2 : Đối kháng giữa Bacillus subtilis với E. coli trên môi trƣờng TSA với nồng
độ pha loãng canh khuẩn E. coli là 10-2 ............................................................... 27
Hình 4.3 : Kết quả kháng sinh đồ ........................................................................ 31
Hình 4.4 : Hình phân giải tinh bột của Bacillus subtilis
Biểu đồ 4.1: Biểu đồ biểu hiện sự thay đổi E. coli qua các thời điểm................. 28
viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 : Kết quả độ lớn vòng kháng khuẩn của các chủng Bacillus subtilis phân lập
đƣợc với E. coli ở nồng độ pha loãng là 10-2 trên môi trƣờng TSA ................... 27
Bảng 4.2 : Kết quả số lƣợng CFU/ml của E. coli qua từng khoảng thời gian 0 giờ, 12
giờ, 24 giờ, 36 giờ
.......................................................................................... 29
Bảng 4.3 : Kết quả thử kháng sinh đồ đối với 5 chủng đƣợc thử đối kháng ....... 30
Bảng 4.4 : Kết quả tạo vòng phân giải tinh bột của các chủng Bacillus subtilis phân lập
đƣợc trên môi truờng thạch tinh bột 1% .................................................................
ix
32
1
1. PHẦN 1: MỞ ĐẦU
2.
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Enterotoxigenic E. coli là vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy phổ biến trong đƣờng
tiêu hóa của heo và ngƣời, chiếm đến 66,7% trƣờng hợp tiêu chảy trên heo còn non và
heo đang cai sữa gây thiệt hại lớn cho ngƣời chăn nuôi.
Do tính chất đề kháng rất nhanh đối với nhiều loại kháng sinh của E. coli, thì
việc sử dụng kháng sinh trở nên kém hiệu quả, đồng thời việc sử dụng kháng sinh dẫn
đến xáo trộn hệ vi sinh vật nội tại và làm xuất hiện ngày càng nhiều những chủng vi
khuẩn đề kháng với kháng sinh gây lo ngại cho ngƣời tiêu dùng, do đó sử dụng
probiotic đƣợc xem nhƣ là một giải pháp thay thế hiệu quả cho kháng sinh. Hiện nay
Bacillus subtilis đƣợc tập trung nghiên cứu nhiều do có nhiều ƣu điểm thỏa mãn đƣợc
yêu cầu của sản phẩm probiotic hơn so với các chủng vi sinh vật khác. Mặc dù vậy vẫn
chƣa có một sản phẩm probiotic từ Bacillus subtilis có thể ngăn ngừa một cách có hiệu
quả bệnh tiêu chảy. Bên cạnh đó một số sản phẩm probiotic phòng bệnh tiêu chảy trên
thị trƣờng của Việt Nam nhƣ Biosubtyl, Subtyl thì chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng
không phải vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis, đồng thời các chủng này kháng
đƣợc nhiều loại kháng sinh (Ngô Thị Hoa, 2000) nên có khả năng phổ biến các gene
kháng kháng sinh cho các vi khuẩn trong đƣờng ruột của thú. Do đó tiếp tục phân lập
các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng ức chế một cách có hiệu quả vi khuẩn
E. coli gây bệnh tiêu chảy và không mang các gene kháng kháng sinh là điều cần thiết.
Trƣớc tình hình đó đƣợc sự phân công của khoa công nghệ sinh học trƣờng Đại
học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, với sự hƣớng dẫn của Ts. Nguyễn Ngọc Hải
chúng tôi thực hiện đề tài “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo và
thử đối kháng với E. coil gây bệnh tiêu chảy trên heo ”.
2
1.2 MỤC ĐÍCH , YÊU CẦU
1.2.1 Mục đích
Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh
với chủng vi khuẩn E. coli gây bệnh tiêu chảy trên heo, nhằm phục vụ cho việc ứng
dụng vào trong chăn nuôi.
1.2.2 Yêu cầu
Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong phân heo ở các hộ nuôi heo
ở Đồng Nai và Bình Dƣơng.
Chọn lọc đƣợc dòng Bacillus subtilis kháng khuẩn đối với E. coli.
Đánh giá sự đối kháng giữa chủng Bacillus subtilis với E. coli gây bệnh trong
môi trƣờng TSB.
Đánh giá sự an toàn về mặt sinh học của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc bằng
phƣơng pháp kháng sinh đồ.
Đánh giá khả năng phân giải tinh bột trên môi trƣờng thạch tinh bột 1%.
3
3. PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
4.
2.1 E. coli gây bệnh tiêu chảy
Escherichia coli là vi khuẩn đƣờng ruột gram -, là loài chiếm ƣu thế trong
đƣờng tiêu hóa của ngƣời và động vật, hầu hết E. coli là những chủng có lợi giúp cân
bằng hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột tuy nhiên có một số chủng có khả năng gây bệnh
cho ngƣời và động vật, trẻ sơ sinh và động vật còn non dễ bị xâm nhiễm bởi những
chủng gây bệnh khi hệ thống vi sinh vật đƣờng ruột bị rối loạn, cơ thể thú bị suy giảm
miễn dịch, hoặc cơ thể thú nhạy cảm với một số chủng vi khuẩn nhất định. Để có thể
gây bệnh các chủng E. coli này cần phải gắn đƣợc vào tế bào thành ruột, tránh sự bảo
vệ của cơ thể vật chủ, gia tăng số lƣợng sau đó làm tổn thƣơng các tế bào thành ruột,
các loại E. coli gây bệnh khác nhau có cơ chế gây bệnh khác nhau, do đó dựa vào sự
tƣơng tác của E. coli với tế bào thành ruột có thể chia các chủng E. coli gây bệnh thành
ít nhất 6 loại: enterotoxigenic E. coli (ETEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC),
enteroaggregative E. coli (EAEC), enteropathogenic E. coli (EPEC), enteroinvasive E.
coli (EIEC), diffusely adherent E. coli (DAEC) (12).
Các chủng E. coli gây bệnh còn đƣợc phân biệt với nhau bằng các phản ứng
ngƣng kết kháng nguyên.
Sự xâm nhiễm của các chủng E. coli gây bệnh dẫn đến các rối loạn trong hệ
thống tiêu hóa, nhiễm trùng đƣờng tiết niệu, rối loạn hệ thần kinh trung ƣơng, sau khi
cố định trên tế bào thành ruột các chủng E. coli này tiết ra độc tố làm tổn thƣơng các tế
bào thành ruột, tất cả những gene qui định độc tính của vi khuẩn đƣợc mã hóa trên
cùng plasmid hoặc đƣợc tập trung trong một vùng nhiễm sắc thể của bộ gene vi khuẩn,
có một vài tính trạng riêng biệt đƣợc mã hóa trên transposome hay phage.
Trong 6 loại trên thì enterotoxigenic E. coli là loại phổ biến nhất gây bệnh trên
heo.
2.2 Enterotoxigenic E. coli (ETEC)
Enterotoxigenic E. coli là những chủng vi khuẩn có khả năng tiết ra ít nhất là
một thành viên trong trong 2 loại độc tố enterotoxin là: LT (heat-labile toxin), ST
(heat-stable toxin). ETEC có khả năng gây ra hiện tƣợng tiêu chảy trên heo, trên ngƣời
và các loài thú khác. Mỗi chủng ETEC có thể mang gene mã hóa cho 1 loại độc tố
4
hoặc có thể cả 2 loại độc tố khác nhau, những gene này có khả năng cùng đƣợc biểu
hiện và gây bệnh cho tế bào vật chủ, trong đó thì LT có ảnh hƣởng rất lớn đối với độc
tính của vi khuẩn (11).
2.2.1 Độc tố nhạy nhiệt LT
LT là độc tố nhạy cảm với nhiệt có cấu trúc và cơ chế gây độc gần giống với
cholera enterotoxin (CT) đƣợc sản xuất từ Vibrio cholerae, gene mã hóa cho cấu trúc
của độc tố LT nằm trên plasmid có nguồn gốc từ vi khuẩn Vibrio cholerae. LT có hai
nhóm chính là LT-1 và LT-2, hai độc tố này không cho đáp ứng miễn dịch chéo với
nhau. LT-1 đƣợc biểu hiện trong các chủng E. coli gây bệnh trên ngƣời và động vật
còn LT-2 chỉ đƣợc tìm thấy trên những chủng E. coli phân lập đƣợc trên động vật và
một số rất ít chủng phân lập đƣợc trên ngƣời tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy
LT-2 có khả năng gây bệnh do đó cơ chế tác động của độc tố LT tập chung chủ yếu
vào LT-1.
2.2.1.1
Cấu tạo của LT-1
LT1-1 trọng lƣợng phân tử là 86 kDa đƣợc cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A có trọng
lƣợng phân tử 28 kDa và 5 tiểu đơn vị B có trọng lƣợng phân tử 11,5 kDa, 5 tiểu đơn
vị B sẽ gắn vào các thụ thể trên tế bào ruột còn tiểu đơn vị A có hoạt tính enzyme và tự
phân cắt thành 2 tiểu đơn vị là A1 và A2 nối với nhau bằng cầu nối disulfic, LT-1 có
hai loại là LTh-1 có độc tính trên ngƣời và LTp-1 có độc tính trên heo.
2.2.1.2
Cơ chế tác động của độc tố LT-1
Sau khi gắn vào màng tế bào chủ LT-1 đƣợc chuyển vào trong tế bào, mục tiêu
của LT-1 là adenylate cyclase, enzyme này nằm trên lớp màng phân cực của tế bào
biểu mô ruột. Tiểu đơn vị A1 có hoạt tính ADP-ribosyltransferase hoạt động chuyển
ADP từ NAD gắn vào tiểu đơn vị alpha của protein liên kết với GTP làm hoạt hóa hoạt
tính adenylate cyclase của tiểu đơn vị này, quá trình gắn ADP vào tiểu đơn vị làm
adenylate cyclase hoạt động liên tục từ đó gia tăng hàm lƣợng cAMP nội bào, khi hàm
lƣợng cAMP nội bào tăng, cAMP sẽ gắn vào và hoạt hóa enzyme protein kinase A,
enzyme này hoạt động làm phosphoryl hóa kênh clorua nằm ở phía trên màng tế bào
biểu mô ruột, sự phosphoryl hóa dẫn đến sự gia tăng hoạt động của kênh do đó ion
clorua sẽ bị tiết ra ngoài qua các khe tiết đồng thời ức chế sự hấp thụ NaCl từ bên
ngoài vào bởi các tế bào lông ruột, do đó tăng nồng độ ion trong ruột làm nƣớc bên
5
trong tế bào bị kéo ngƣợc ra ngoài và dẫn đến hiện tƣợng tiêu chảy bên cạnh đó còn có
các cơ chế khác liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS) và sự đáp ứng miễn dịch
của tế bào thành ruột với độc tố cho nên có ít nhất một cơ chế tác động đồng thời với
cơ chế tăng hàm lƣợng cAMP.
LT bị sử lý để mất hoạt tính ADP-ribosyltransferase còn có tác động nhƣ một tá
dƣợc.
LT-2 có 55 – 57 % tƣơng đồng với LT-1 ở tiểu đơn vị A, nhƣng không cho thấy
sự tƣơng đồng ở tiểu đơn vị B, LT-2 có hai kiểu kháng nguyên khác nhau là LT-2a và
LT-2b hai kiểu kháng nguyên này có sự tƣơng đồng với nhau là 71% ở tiểu đơn vị A
và 66% ở tiểu đơn vị B. LT-2 có cơ chế tác động tƣơng tự LT-1 là gia tăng hàm lƣợng
cAMP nội bào, khác biệt là receptor của LT-2 là GD1 còn của LT-1 là GM1, tuy nhiên
nhƣ đề cập ở trên thì không có bằng chứng cho thấy LT-2 gây độc cho tế bào của
ngƣời và động vật.
2.2.2 Độc tố kháng nhiệt (heat-stable toxin ST)
ST là protein nhỏ chỉ đƣợc cấu tạo từ một đơn vị, nhƣng trong cấu trúc chứa
nhiều amino acid cystein, do đó trong cấu trúc protein chứa nhiều cầu nối disulfic tính
chất này dẫn đến khả năng kháng nhiệt của độc tố. Độc tố này có hai loại, có cấu trúc
và cơ chế hoạt động khác biệt nhau là STa và STb, gene mã hóa cho hai loại độc tố
này đƣợc đƣợc qui định trên plasmid, một số gene đƣợc phát hiện nằm trên transposon.
2.2.2.1
Độc tố kháng nhiệt STa
STa có trọng lƣợng phân tử là 2kDa, có hai dạng khác nhau là STap trong cấu
trúc chứa 18 amino acid có khả năng gây độc cho heo và ngƣời, dạng còn lại là STah
cấu tạo từ 19 amino acid chỉ gây độc cho ngƣời. Ban đầu STa đƣợc tổng hợp dƣới
dạng pre-protoxin chứa 72 amino acid, sau đó đƣợc phân cắt thành peptide có 52 acid
amine, dạng peptide này đƣợc chuyển vào vùng periplasm sau đó hình thành cầu nối
disulfic nhờ enzyme DsbA đƣợc mã hóa trên genome của vi khuẩn, sau đó dạng
protoxin sẽ đƣợc cắt thành dạng toxin hoàn chỉnh và đƣợc khuếch tán qua vách tế bào.
Ngoài ETEC ra thì STa còn đƣợc tổng hợp bởi một vài chủng vi khuẩn gram (–) khác
nhƣ Yersinia enterocolitica và V. cholerae non-O1, bên cạnh đó STa có 50% protein
tƣơng đồng với độc tố EAST1 ST của EAEC.
6
Receptor của STa là enzyme xuyên màng đƣợc gọi là guanylate cyclase C
(GC-C), GC-C nằm trên phần đầu màng của tế bào biểu mô ruột, protein này là
receptor của hormone guanylin của thú, hocmone này có 15 amino acid trong đó có 4
cystein đóng vai trò giúp cân bằng trạng thái bình thƣờng của ruột, cơ chế tác động của
receptor này với guanylin dựa vào cơ chế ligand-receptor, đó là cơ chế receptor gắn
với ligand tiếp nhận các thông tin ngoại bào từ đó thúc đẩy sự hoạt động của các
enzyme nội bào. Tƣơng tự nhƣ vậy sau khi liên kết với receeptor STa thúc đẩy họat
tính guanylate cyclase của enzyme này làm gia tăng hàm lƣợng cGMP nội bào, cGMP
hoạt hóa protein kinase G hoạt động của enzyme này làm tăng hoạt động của kênh
clorua, làm đẩy mạnh việc tiết ion clorua và ức chế sự hấp thu NaCl dẫn đến dịch ruột
bị tiết ra ngoài gây nên hiện tƣợng tiêu chảy. Độc tố STa tác động nhanh hơn LT do
không cần phải chuyển vào bên trong tế bào mà truyền tín hiệu trực tiếp vào bên trong.
Ngoài GC-C ra thì STa có thể còn có các receptor khác tuy nhiên GC-C là receptor
chiếm ƣu thế nhất.
2.2.2.2
Độc tố kháng nhiệt STb
STb ban đầu cũng đƣợc tổng hợp dƣới dạng pretoxin có 72 acid amine sau đó
đƣợc chế biến thành dạng protein hoàn chỉnh có 48 acid amine, protein này có trọng
lƣợng phân tử là 5,1kDa, cấu trúc của STb không tƣơng đồng với STa mặc dù trong
cấu tạo của nó cũng có 4 amino acid cystein, STb làm tổn thƣơng các tế bào ruột do
tác động lên các lông ruột dẫn đến các lông tơ trên tế bào biểu mô bị mất hoặc bị thu
ngắn lại, receptor của STb vẫn chƣa đƣợc xác định có thể độc tố này gắn vào những
vùng không chuyên biệt trên màng tế bào trƣớc khi đƣợc đƣa vào trong, tác động của
STb trong tế bào không giống nhƣ STa thay vì phân tiết clorua, độc tố này dẫn đến
việc phân tiết bicarbonat, STb không làm gia tăng hàm lƣợng cAMP hay cGMP nội
bào mà tác động của nó làm tăng hàm lƣợng calcium nội bào bằng cách hấp thu từ bên
ngoài, ngoài ra tác động của nó còn làm tăng sự phân tiết PGE2 và serotonin cho thấy
tác động của STb có liên quan đến hệ thống thần kinh ruột (ENS).
Cơ chế tác động của độc tố LT và ST đƣợc trình bày ở hình bên dƣới
7
2.2.3 Các yếu tố gắn vào thành tế bào ruột của ETEC
Để có thể gây bệnh các chủng ETEC phải gắn đƣợc vào thành tế bào biểu mô
ruột, khả năng gắn đƣợc vào thành tế bào ruột non càng lớn thì mức độ gây bệnh càng
lớn, việc gắn vào thành tế bào ruột đƣợc thực hiện bởi một thành phần trên lớp capsule
của vi khuẩn gọi là fimbriae, fimbriae có cấu tạo nhỏ và chiếm một số lƣợng lớn hơn
tiêm mao (flagella) của vi khuẩn, fimbriae có nhiều hình dạng và cấu trúc khác nhau,
mỗi fimbriae có một receptor chuyên biệt trên thành biểu mô ruột các receptor này có
cấu tạo là IMTGP (intestinal mucin-type glycoprotein). Fimbriae xuất hiện trên cả vi
khuẩn E. coli gây bệnh cũng nhƣ không gây bệnh nó giúp cho vi khuẩn chống việc bị
loại thải bởi nhu động ruột, một vi khuẩn có thể có nhiều loại fimbriae khác nhau,
fimbriae nằm trên capsule cho nên kháng nguyên bề mặt là kháng nguyên K tuy nhiên
nó đƣợc cấu tạo là protein nên còn đƣợc gọi là kháng nguyên F, các fimbriae khác
nhau đƣợc phân biệt bằng hình thái và khả năng ngƣng kết hồng cầu.
Mỗi loại ETEC gây bệnh cho những loài khác nhau thƣờng biểu hiện một loại
fimbriae riêng biệt.
8
Bảng bên dƣới thể hiện một vài kháng nguyên và đối tƣợng gây bệnh của nó
(13).
Kháng nguyên Đối tƣợng gây bệnh
Serogroup O
08, 045, 0138, 0141,
K88
Heo con
987P
Heo con
09, 020, 0141
K99
Cừu, bê
08, 09, 020, 0101
K99
Heo con
064, 0101
K41
Bê
09, 0101
CFA\1
Ngƣời
015, 025, 063, 078
CFA\2
Ngƣời
06,08
0147, 0149, 0157
Khả năng tổng hợp enterotoxin và hiện diện của fimbriae có sự liên hệ với nhau (13).
Fimbriae
Enterotoxin
ST
LT
LT+ST
K880
+
+
+
987P
+
-
-
K99
+
-
-
K41
+
-
-
CFA\1
+
+
+
CFA\2
-
-
+
2.3 Chế phẩm sinh học (probiotic)
2.3.1 Định nghĩa
Probiotic đã đƣợc sử dụng hàng ngàn năm trƣớc khi mà các sản phẩm sữa chua
(yaourt) đƣợc sử dụng. Có nhiều định nghĩa khác nhau về probiotic, hiện nay thuật ngữ
probiotic đƣợc sử dụng để chỉ những sản phẩm chứa vi sinh vật sống để cải thiện hệ vi
sinh vật nội tại (Trần Thị Dân, 2005). Có nhiều chế phẩm sinh học khác nhau đã đƣợc
thƣơng mại hóa, có loại chỉ chứa một loài vi sinh vật, có loại chứa hai hay nhiều loại vi
9
sinh vật khác nhau. Các loại vi sinh vật có lợi đƣợc sử dụng phổ biến nhất là các loài
của lactobacilli, streptococcus, bifidobacterium ssp, bacillus ssp.v.v..(2), (9).
2.3.2 Cơ chế tác động
Tuy đã đƣợc sử dụng từ rất lâu nhƣng cơ chế tác động của probiotic vẫn chƣa
đƣợc nghiên cứu một cách rõ ràng do hiệu quả tác động của nó chịu ảnh hƣởng bởi
nhiều yếu tố khác nhau. Fuller (1992) đã đề nghị cơ chế tác động của probiotic có thể
là (2)
Cạnh tranh thụ thể kết dính trên biểu mô tế bào tiêu hóa.
Cạnh tranh chất dinh dƣỡng giới hạn với vi sinh vật gây bệnh, tuy nhiên cơ
chế này chƣa đƣợc chứng minh một cách rõ ràng trong điều kiện in vivo.
Sản xuất chất kháng khuẩn nhƣ các acid hữu cơ, bacteriocin.v.v.
Kích thích hệ miễn dịch.
Probiotic có giá trị khoa học, tuy nhiên lợi ích của nó chỉ thể hiện khi thú có sức
khỏe kém, stress hoặc xáo trộn hệ vi sinh vật đƣờng ruột (2).
2.3.3 Ứng dụng của chế phẩm sinh học
Probiotic đƣợc sử dụng để phòng và chữa trị một phổ lớn các bệnh đƣờng ruột
nhƣ là bệnh tiêu chảy do sự xâm nhiễm của vi sinh vật gây bệnh, virus, sử dụng kháng
sinh và dinh dƣỡng, bệnh viêm ruột, hội chứng dễ bị kích thích của ruột, ngoài ra còn
đƣợc sử dụng để bổ sung các enzyme tiêu hóa mà cơ thể tiết ra không đủ nhƣ sucrase,
maltase (9). Các vi sinh vật có lợi trong probiotic sẽ ức chế vi sinh vật gây bệnh để hệ
thống vi sinh vật trong đƣờng ruột có thể phục hồi.
Probiotic giúp cho thú tăng trọng nhanh hơn trên một đơn vị thức ăn do vi sinh
vật trong probiotic tiết ra các enzyme tiêu hóa nhƣ amylase, protease làm tăng hệ số
chuyển hóa thức ăn của thú.
2.3.4 Yêu cầu của chế phẩm sinh học
An toàn là điều tiên quyết đối với một chế phẩm sinh học, các chủng vi sinh vật
đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải không mang gene gây độc cho ngƣời và
động vật.
Chủng vi sinh vật đƣợc chọn để làm chế phẩm phải chống chịu đƣợc điều kiện
pH thấp của dạ dày, muối mật, enzyme tiêu hóa đồng thời phải có khả năng bám và tạo
khuẩn lạc trên thành ruột (9).
10
Chế phẩm sinh học phải cho đƣợc hiệu quả cao trong phòng, trị bệnh hoặc trong
cải thiện dinh dƣỡng của thú. Vi sinh vật đƣợc sử dụng làm chế phẩm sinh học phải có
tính đối kháng mạnh với nhiều chủng vi sinh vật khác nhau hoặc làm tăng hiệu quả sử
dụng thức ăn một cách có ý nghĩa.
Giá thành có ý nghĩa rất lớn đối với sự phổ biến của sản phẩm, vi sinh vật đƣợc
tuyển chọn làm chế phẩm sinh học phải phát triển mạnh, qui trình nuôi cấy và sản xuất
phải đơn giản không tốn kém.
Dễ sử dụng và bảo quản, cách sử dụng phải đơn giản, vi sinh vật phải tồn tại
đƣợc trong thời gian dài ở điều kiện bảo quản bình thƣờng.
2.3.5 Đặc điểm của chế phẩm sinh học ở dạng bào tử Bacillus subtilis
Điều khác biệt đối với các sản phẩm probiotic khác là các sản phẩm probiotic
có nguồn gốc từ bacillus sp đƣợc sản xuất ở dạng bào tử do đó những sản phẩm này có
nhiều ƣu điểm hơn so với các sản phẩm khác là dễ sản xuất, giá thành sản xuất rẽ, bào
tử chịu đựng đƣợc các điều kiện trong quá trình sản xuất, dễ bảo quản, thời gian bảo
quản dài, bào tử có khả năng đề kháng tốt với acid dạ dày, muối mật, enzyme tiêu
hóa….Trong các loài vi khuẩn khác nhau thuộc giống bacillus thì Bacillus subtilis
đƣợc tập trung nhiều nhất vì các dòng vi khuẩn của Bacillus subtilis không mang
những gene gây độc cho ngƣời và thú, quá trình hình thành bào tử của Bacillus subtilis
đƣợc nghiên cứu một cách chi tiết, đồng thời những nghiên cứu gần đây cho thấy bào
tử của Bacillus subtilis có khả năng nảy mầm đƣợc trên phần đầu của ruột non (3).
Điều này làm cho việc nghiên cứu Bacillus subtilis để sản xuất probiotic đƣợc đẩy
mạnh.
2.4 Bacillus subtilis
2.4.1 Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1994). Bacillus subtilis thuộc.
Bộ: Eubacteriales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
2.4.2 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn, gram (+), sinh nội bào tử, kích thƣớc 0,5- 0,8μm
x 1,8-3μm là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi, tế bào ít khi tạo thành chuỗi thƣờng ở
- Xem thêm -