Tài liệu Luận văn thạc sĩ khảo sát khả năng phân hủy 2,4 d, cypermethrin và endosulfan của vi khuẩn novosphingobium sp. kn65.2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN BỘ MÔN SINH HỌC ------ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC Đề tài: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4-D, CYPERMETHRIN VÀ ENDOSULFAN CỦA VI KHUẨN Novosphingobium sp. KN65.2 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN TH.S NGUYỄN THỊ PHI OANH NGUYỄN THIỆN TRUNG BỘ MÔN SINH HỌC MSSV:3082477 KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LỚP: SINH HỌC K34 Cần Thơ, Tháng 3/2012 LỜI CẢM ƠN Tôi trân trọng gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến: Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Cần Thơ, Ban Chủ Nhiệm Khoa Kho a Học Tự Nhiên và quý thầy cô Bộ môn Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi, hƣớn g dẫn tận tình và góp ý kiến quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài n ày. Tất cả các quý thầy cô đã tận tình giảng dạy, hƣớng dẫn và truyền đạt ki ến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập. Thạc sĩ Nguyễn Thị Phi Oanh đã nhiệt tình hƣớng dẫn, bổ sung nhiều k iến thức bổ ích, góp ý kiến và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này. Gia đình, bạn bè và tất cả những ngƣời thân yêu đã động viên, giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn để tôi có điều kiện học tập tại trƣờng. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 01 tháng 05 năm 2012 Nguyễn Thiện Tr ung LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và Cô hƣớng dẫn. Các kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ luận văn nào trƣớc đây. Cán bộ hƣớng dẫn Tác giả luận văn Ký tên Ký tên Ths. Nguyễn Thị Phi Oanh Nguyễn Thiện Trung MỤC LỤC Trang DANH SÁCH HÌNH ........................................................................................... i DANH SÁCH BẢNG......................................................................................... ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................ iii PHỤ LỤC.......................................................................................................... iv CHƢƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................. 1 CHƢƠNG II: LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU ........................................................... 2 2.1 SƠ LƢỢC VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG NÔNG DƢỢC TRÊN THẾ GIỚI ........ 2 2.2 SƠ LƢỢC VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG NÔNG DƢỢC Ở VIỆT NAM ............. 4 2.2.1 Ở Việt Nam.................................................................................................. 4 2.2.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long...................................................................... 4 2.3 ĐẠI CƢƠNG VỀ 2,4-D.................................................................................... 5 2.3.1 Đặc tính vật lý, hóa học................................................................................ 5 2.3.2 Ảnh hƣởng của 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời ..................................... 6 2.3.3 Sự phân hủy sinh học 2,4-D ......................................................................... 7 2.3.4 Lộ trình phân hủy sinh học 2,4-D ................................................................. 8 2.4 ĐẠI CƢƠNG VỀ CYPERMETHRIN.............................................................. 11 2.4.1 Đặc tính vật lý, hóa học.............................................................................. 11 2.4.2 Ảnh hƣởng của cypermethrin đến môi trƣờng và con ngƣời ....................... 12 2.4.3 Sự phân hủy sinh học cypermethrin............................................................ 13 2.4.4 Lộ trình phân hủy sinh học cypermethrin ................................................... 13 2.5 ĐẠI CƢƠNG VỀ ENDOSULFAN .................................................................. 15 2.5.2 Đặc tính vật lý, hóa học.............................................................................. 15 2.5.2 Ảnh hƣởng của endosulfan đến môi trƣờng và con ngƣời ........................... 16 2.5.3 Sự phân hủy sinh học endosulafan.............................................................. 17 2.5.4 Lộ trình phân hủy sinh học endosulfan ....................................................... 17 2.6 ẢNH HƢỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ PHÂN HỦY SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ........................................................................................................................... 20 2.7 VI KHUẨN sphingomonads ............................................................................ 21 2.7.1 Mô tả ......................................................................................................... 21 2.7.2 Phân loại .................................................................................................... 22 2.7.3 Khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ của sphingomonads ..................... 22 2.8 MỘT VÀI ĐẶC ĐIỂM THỔ NHƢỠNG Ở ĐBSCL ........................................ 23 CHƢƠNG III: PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......... 25 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................... 25 3.2 PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ..................................................................... 25 3.2.1. Hóa chất dùng cho môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................... 25 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm .................................................................. 26 3.2.3. Dòng vi khuẩn sử dụng để khảo sát khả năng phân hủy ............................. 27 3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 27 3.3.1. Khảo sát khả năng phân hủy 2,4-D, cypermethrin và endosulfan của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 trên môi trƣờng lỏng .............................. 28 3.3.2. Khảo sát khả năng phân hủy 2,4-D, cypermethrin và endosulfan của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 trên môi trƣờng agar .............................. 28 3.3.3. Khảo sát ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy carbofuran, 2,4-D, cypermethrin và endosulfan của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 ........ 28 Khả năng phân hủy các loại nông dƣợc của dòng vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 đƣợc khảo sát ở pH 4.5 và pH 5.5. ..................................................... 28 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN................................................. 29 4.1 KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4-D, CYPERMETHRIN VÀ ENDOSULFAN CỦA VI KHUẨN Novosphingobium sp. KN 65.2.............................................. 29 4.1.1 Trên môi trƣờng lỏng ................................................................................. 29 4.1.2 Trên môi trƣờng agar ................................................................................. 31 4.2 ẢNH HƢỞNG CỦA pH ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4-D, CYPERMETHRIN VÀ ENDOSULFAN CỦA VI KHUẨN Novosphingobium sp. KN 65.2.............................................................................................................. 33 4.2.1 Môi trƣờng pH 5.5 ..................................................................................... 33 4.2.2 Môi trƣờng pH 4.5 ..................................................................................... 34 4.2.3. Ảnh hƣởng của pH đến khả năng phân hủy carbofuran của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 .............................................................................. 36 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 39 5.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 39 5.2 ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 39 DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Công thức cấu tạo của 2,4-D 5 Hình 2: Lộ trình phân hủy sinh học 2,4-D 10 Hình 3: Công thức cấu tạo của cypermethrin 12 Hình 4: Lộ trình phân hủy sinh học cypermethrin 14 Hình 5: Công thức cấu tạo của endosulfan 16 Hình 6: Lộ trình phân hủy sinh học endosulfan 19 Hình 7: Sự tạo thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng có bổ 29 sung các loại nông dƣợc khác nhau sau 3 ngày Hình 8: Sự tạo thành khuẩn lạc vi khuẩn sau 5 ngày 31 Hình 9: Mật độ quang của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 32 khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng có bổ sung carbofuran, 2,4-D, cypermethrin và endosulfan. Hình 10: Sự tạo thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng pH 5.5 33 có bổ sung các loại nông dƣợc khác nhau sau 3 ngày Hình 11: Sự tạo thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng pH 4.5 34 có bổ sung các loại nông dƣợc khác nhau sau 3 ngày Hình 12: Mật độ quang của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung carbofuran với các pH khác nhau 35 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Chi phí tiêu thụ nông dƣợc trên thế giới từ 1983-1998 (triệu đô la) Bảng 2: Sự hình thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng có bổ 3 28 sung nông dƣợc theo thời gian Bảng 3: Mật độ quang của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 29 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung các loại nông dƣợc khác nhau sau 3 ngày Bảng 4: Sự hình thành khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trƣờng agar có bổ 30 sung nông dƣợc theo thời gian Bảng 5: Sự hình thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng pH 5.5 33 có bổ sung các loại nông dƣợc khác nhau theo thời gian Bảng 6: Sự hình thành sinh khối vi khuẩn trong môi trƣờng pH 4.5 34 có bổ sung các loại nông dƣợc khác nhau theo thời gian Bảng 7: Mật độ quang của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có pH khác nhau có bổ sung carbofuran sau 3 ngày 35 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 2,4-D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BVTV Bảo vệ thực vật ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long ctv Cộng tác viên LPS lipopolysaccharide GSL glycosphingolipid MMO Mineral medium salt TSB Trypticase Soy Borth TSA Trypticase Soy Borth + Agar FAO Food and Agriculture Organization SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis LC-MS Liquid Chromatography–Mass Spectrometry OD Optical Density TÓM LƢỢC Khảo sát khả năng phân hủy 2,4-D, cypermethrin và endosulfan của vi khuẩn Novosphingobium KN 65.2 có khả năng phân hủy carbofuran đƣợc phân lập trong đất rẫy ở Sóc Trăng bằng cách cấy vi khuẩn trên môi trƣờng khoáng tối thiểu có bổ sung các nông dƣợc này nhƣ là nguồn cung cấp cacbon duy nhất. Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 ngoài khả năng phân hủy carbofuran còn có khả năng phân hủy 2,4-D, cypermethrin và endosulfan. Đây là kết quả nghiên cứu đầu tiên về khả năng phân hủy endosulfan đƣợc tìm thấy ở vi khuẩn sphingomonads nói chung và của dòng vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 nói riêng. Kết quả phân tích thống kê về mật độ quang của dòng vi khuẩn này khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng có bổ sung các loại nông dƣợc cho thấy sự phân hủy các hợp chất này khác biệt có ý nghĩa, trong đó carbofuran đƣợc phân hủy nhanh nhất, kế đến là cypermethrin, 2,4-D và endosulfan. Khi đƣợc nuôi cấy ở môi trƣờng có pH khác nhau, dòng vi khuẩn KN 65.2 thể hiện khả năng phân hủy carbofuran ở pH 7, pH 5.5 và pH 4.5 trong khi không có sự phân hủy 2,4-D, cypermethrin và endosulfan ở hai giá trị pH này. Kết quả phân tích thống kê chứng tỏ có sự khác biệt có ý nghĩa về khả năng phân hủy carbofuran của dòng vi khuẩn KN 65.2 ở các pH khác nhau. Ở pH 7, carbofuran đƣợc phân hủy nhanh nhất, kế đến ở pH 5.5 và sự phân hủy diễn ra thấp nhất ở pH 4.5. Từ khóa: Novosphingobium sp. KN 65.2, sự phân hủy sinh học, endosulfan, carbofuran, 2,4-D, cypermethrin, pH. CHƢƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ Nƣớc ta là một nƣớc nông nghiệp với nền văn minh lúa nƣớc lâu đời. Ngày nay, áp lực tăng dân số đòi hỏi phải thâm canh, tăng vụ, áp dụng những tiến bộ khoa học kỹ thuật vào sản xuất nông nghiệp. Chính vì vậy, nông dƣợc đã trở thành ngƣời bạn đồng hành với nông dân trong các vụ mùa. Nông dƣợc là những chế phẩm hóa học đƣợc dùng để diệt cỏ, côn trùng và sâu hại mùa màng. Sử dụng nông dƣợc hợp lý sẽ mang lại hiệu quả và ít gây hại cho môi trƣờng. Tuy nhiên, khi nông dƣợc đƣợc sử dụng không đúng cách chẳng hạn nhƣ phun thuốc tràn lan, phun phòng, phun sớm, thậm chí dùng cả những khi không cần thiết dẫn đến tình trạng lạm dụng nông dƣợc gây hậu quả xấu đến môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Một số loại nông dƣợc đã và đang đƣợc sử dụng phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là endosulfan, carbofuran, 2,4-D và cypermethrin …, trong đó, endosulfan đã bị cấm sử dụng ở nƣớc ta từ năm 2008 (Danh mục thuốc BVTV cấm sử dụng tại Việt Nam, 2008), carbofuran đã bị hạn chế sử dụng từ năm 2009 (Danh mục thuốc BVTV hạn chế sử dụng tại Việt Nam, 2009), 2,4-D và cypermethrin vẫn còn đang đƣợc sử dụng rộng rãi. Ở ĐBSCL, dòng vi khuẩn Novosphingobium sp. KN65.2 có khả năng phân hủy carbofuran đã đƣợc phân lập trong đất rẫy ở Sóc Trăng (Nguyễn Ngọc Ánh, 2009). Các enzim liên quan đến lộ trình phân hủy carbofuran cũng đã đƣợc khảo sát (Lê Huyền Trân, 2010). Các công trình nghiên cứu trƣớc đây cho thấy vi khuẩn thuộc nhóm sphingomonads là một trong những vi khuẩn tiềm năng dùng để nghiên cứu khả năng làm sạch môi trƣờng bằng con đƣờng sinh học vì chúng có khả năng phân hủy nhiều loại hóa chất hữu cơ ô nhiễm khác nhau (Stolz, 2009). Vì vậy, mục tiêu đề tài là khảo sát khả năng phân hủy các loại nông dƣợc khác đã và đang đƣợc sử dụng ở ĐBSCL của vi khuẩn Novosphingobium sp. KN 65.2 nhƣ 2,4-D, cypermethrin và endosulfan và ảnh hƣởng của pH đến sự phân hủy các loại nông dƣợc này. CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 SƠ LƢỢC VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG NÔNG DƢỢC TRÊN THẾ GIỚI Thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) hay nông dƣợc là những hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp và đƣợc sử dụng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của những sinh vật gây hại đến tài nguyên thực vật. Những sinh vật gây hại chính gồm sâu hại, bệnh hại, cỏ dại, chuột và các tác nhân khác (www.ctu.edu.vn). Sử dụng thuốc BVTV một cách hợp lý sẽ góp phần đáng kể trong bảo vệ mùa màng, cải thiện chất lƣợng nông sản. Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng cách, không tuân thủ các biện pháp an toàn khi sử dụng thuốc sẽ gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng và sức khỏe cộng đồng. Theo dự đoán của hiệp hội Allan Woodburn (Anh), thị trƣờng hóa chất nông nghiệp thế giới sẽ tăng trung bình 1% mỗi năm (www.farmingsolutions.org/). Năm 2001, tổng chi phí sử dụng thuốc BVTV của thế giới lên đến 31,5 tỉ đô la, trong đó Mỹ đã chi 11 tỉ đô la tƣơng đƣơng 1,2 tỷ pound trong số 5 tỉ pound cả thế giới sử dụng (Fishel, 2007). Chi phí cho việc sử dụng nông dƣợc ở các vùng địa lý khác nhau từ năm 1983-1998 đƣợc minh họa trong bảng sau: Bảng 1: Chi phí tiêu thụ nông dƣợc trên thế giới từ 1983-1998 (triệu đô la) Khu vực 1983 1993 1998 Bắc Mỹ 3,991 7,377 8,980 Mỹ Latin 1,258 2,307 3,000 Tây Âu 5,847 7,173 9,000 Đông Âu 2,898 2,571 3,190 Châu Phi 942 1,258 1,610 Châu Á 5,572 6,814 8,370 Thế giới 20,507 27,500 34,150 (Nguồn: Yudelman và ctv., 1998:10; IFPRI calculation based on Yudelman và ctv., 1998:10 và FAOSTAT, 1999). Việc lạm dụng thuốc BVTV đã để lại những hậu quả cho môi trƣờng, làm nhiều chƣơng trình phòng chống dịch hại của nhiều quốc gia và tổ chức quốc tế dựa vào thuốc hóa học bị sụp đổ; tƣ tƣởng sợ hãi, không dám dùng thuốc BVTV xuất hiện, có ngƣời còn cho rằng không nên sử dụng thuốc BVTV trong sản xuất nông nghiệp. Tuy vậy, các loại thuốc BVTV vẫn còn nhiều ƣu điểm nên lƣợng dùng thuốc BVTV sử dụng không giảm mà còn tăng lên không ngừng (Nguyễn Trần Oánh và ctv., 2007).  Trong khu vực Ở một số quốc gia trong khu vực Châu Á và Đông Nam Á, thuốc BVTV cũng đƣợc sử dụng rộng rãi (Asian Development Bank, 1987). Theo nghiên cứu của Dung và Dung., 1999, chi phí sử dụng thuốc BVTV trong một vụ ở một số quốc gia tƣơng ứng nhƣ sau: Trung Quốc 89,6 USD; Ấn Độ 59,76 USD; Philipines 52,2 USD; trong khi đó Việt Nam sử dụng nhiều nhất với chi phí là 230,59 USD. 2.2 SƠ LƢỢC VỀ TÌNH HÌNH SỬ DỤNG NÔNG DƢỢC Ở VIỆT NAM 2.2.1 Ở Việt Nam Nƣớc ta bắt đầu sử dụng thuốc BVTV từ những năm 1950 (Pincus, 1995; Dasgupta và ctv., 2007). Năm 1956, lần đầu tiên thuốc BVTV đƣợc sử dụng ở miền Bắc để trừ sâu gai, sâu cuốn lá lớn trên các ruộng lúa ở Hƣng Yên; sau đó, mỗi năm có khoảng 100 tấn thuốc BVTV đƣợc sử dụng. Tuy nhiên, đến những năm 80, con số này đã tăng lên 100 lần và ngày càng tăng với số lƣợng lớn. Đến năm 1995 lƣợng thuốc BVTV đƣợc sử dụng đã tăng lên hơn 30.000 tấn mỗi năm. Trên cả nƣớc, có gần 90% diện tích canh tác có sử dụng hóa chất BVTV. Đa phần các loại thuốc có độ lƣu tồn lâu trong môi trƣờng hay có độ độc cao (Nguyễn Trần Oánh và ctv., 2007). Để phòng trừ sâu bệnh và cỏ dại, nông dân chỉ biết dựa vào thuốc BVTV, dùng thuốc tràn lan, phun phòng, phun sớm, thậm chí dùng cả những khi không cần thiết dẫn đến tình trạng lạm dụng thuốc BVTV gây hậu quả xấu đến môi trƣờng và con ngƣời. Riêng từ năm 2000 đến nay, mỗi năm đã có khoảng hơn 40.000 tấn thuốc BVTV đƣợc sử dụng phục vụ trong nông nghiệp (FAO, 2004). Năm 2006, lƣợng thuốc BVTV nhập khẩu là 71.345 tấn. Cơ cấu thuốc BVTV sử dụng cũng có biến động: thuốc trừ sâu giảm trong khi thuốc trừ cỏ, trừ bệnh gia tăng về cả số lƣợng lẫn chủng loại (www.office33.gov.vn). 2.2.2 Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Để đáp ứng nhu cầu lƣơng thực ngày càng tăng cần phải thâm canh tăng vụ, tăng diện tích, thay đổi cơ cấu cây trồng để tăng sản lƣợng. Thâm canh tăng vụ dẫn đến mất cân bằng sinh thái làm cho tình hình sâu bệnh diễn biến phức tạp hơn. Để giảm thiệt hại, nông dân phải dùng thuốc BVTV ngày càng nhiều hơn, vì vậy số lƣợng và chủng loại thuốc BVTV sử dụng theo đó cũng tăng lên. Trƣớc năm 1985, lƣợng thuốc BVTV sử dụng hàng năm khoảng 6.500-9.000 tấn. Từ năm 1991 đến nay, lƣợng thuốc BVTV sử dụng mỗi năm biến động rất lớn, khoảng 25.000-38.000 tấn (www.ppd.gov.vn). Theo nhiều nhà khoa học Trƣờng Đại học Cần Thơ và Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), đa số nông dân trong khu vực sử dụng thuốc BVTV tùy tiện. Gần 90% nông dân đổ thuốc thừa xuống ao, mƣơng, sông rạch và bón phân hóa học cho cây trồng cao hơn nhu cầu. Hậu quả là các loài thiên địch có ích bị chết, sâu rầy kháng thuốc, nƣớc mặt bị ô nhiễm (www.monre.gov.vn/). Ở ĐBSCL, các loại nông dƣợc đã và đang đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến nhƣ carbofuran, 2,4-D, cypermethrin, endosulfan,… Trong đó, endosulfan đã bị cấm sử dụng ở Việt Nam từ năm 2008 (Danh mục thuốc BVTV cấm sử dụng tại Việt Nam, 2008), carbofuran đã đƣợc đƣa vào Danh mục thuốc bảo vệ thực vật hạn chế sử dụng ở Việt Nam từ năm 2009 (Danh mục thuốc BVTV hạn chế sử dụng tại Việt Nam, 2009), 2,4-D và cypermethrin vì ƣu điểm giá thành rẻ và hiệu quả cao nên hiện nay vẫn đƣợc nông dân sử dụng rộng rãi. Trung bình nông dân sử dụng lƣợng thuốc BVTV khoảng 1017 gram hoạt chất/ha/mùa (Dung và Dung., 1999). 2.3 ĐẠI CƢƠNG VỀ 2,4-D 2.3.1 Đặc tính vật lý, hóa học 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) là thuốc trừ cỏ lá rộng nội hấp, có chọn lọc, có tác dụng kích thích sự phát triển không kiểm soát của tế bào làm cho cỏ chết (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002). Danh pháp: Tên thông dụng: 2,4-D Tên thƣơng mại: OK; Vi 2,4-D; Anco; Zico;… Tên hóa học: 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Công thức hóa học: Hình 1: Công thức cấu tạo của 2,4-D Công thức phân tử: C8H6Cl2O3. Phân tử lƣợng: 221,04 g/M. 2,4-D là thuốc dạng bột có màu trắng đến màu vàng nâu, tan ít trong nƣớc, tan nhiều trong dung môi hữu cơ nhƣng không tan trong benzen và dầu hỏa. Nhiệt độ nóng chảy 135-1420C, nhiệt độ sôi 1600C, có thể bị biến tính với nhiệt độ và ánh sáng. Thời gian bán hủy: trong nƣớc là 39 ngày, trong không khí là 66 ngày, trong đất là 393 ngày (Lê Trƣờng, 1985; Nguyễn Bá Hữu, 2002). 2,4-D còn là thành phần của dioxin, chất độc màu da cam đƣợc quân đội Mỹ sử dụng tại miền nam Việt Nam từ năm 1962 đến 1971. Dioxin nóng chảy ở 2950C và rất độc cho con ngƣời và động vật khi tiếp xúc. Liều lƣợng gây chết ở chuột là 0,0022 mg/kg, ở ngƣời là 0,002 mg/kg (Phạm Luận, 1999). 2.3.2 Ảnh hƣởng của 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời Một trong những loại thuốc diệt cỏ đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay ở Việt Nam nói chung và ĐBSCL nói riêng là 2,4-D. Chất diệt cỏ sau khi đƣợc phun xuống có thể tích tụ không những trong đất mà còn trong lớp nƣớc mặt, nƣớc ngầm, không khí, tích tụ trong thực vật, gây ảnh hƣởng xấu đến môi trƣờng và từ đó tác động dây chuyền đến con ngƣời, động thực vật và các vi sinh vật. Hậu quả là làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên. Các chất này gây chết các động vật, thực vật vi sinh vật và nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng không thể phục hồi, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã và chủng loại động thực vật (Dinh, 1984; Hà Thị Hiến, 2003). Kết quả điều tra 155 ngƣời bị ngộ độc 2,4-D cho thấy tỉ lệ ngƣời có triệu chứng chóng mặt chiếm tỉ lệ 85,5%, mệt mỏi 78,7% và nhức đầu 66,4% (Đỗ Lê Thăng và Đinh Đoàn Long, 2007). Ngoài ra, 2,4-D còn ảnh hƣởng đến hệ thần kinh và hệ tiêu hóa. Khi tiếp xúc với 2,4-D trong thời gian dài dẫn tới yếu cơ, mất phản xạ, hạ huyết áp tức thời, hƣ gan, thận và thậm chí gây ung thƣ (Nguyễn Văn Sức, 1993). 2.3.3 Sự phân hủy sinh học 2,4-D Nhiều vi sinh vật có khả năng phân hủy 2,4-D đã đƣợc phân lập từ nhiều loại đất ô nhiễm khác nhau nhƣ đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải,… Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D đƣợc phân làm 3 nhóm dựa vào enzim phân hủy và các đặc tính lý hóa của chúng. Nhóm thứ nhất thuộc lớp β và γ–Proteobacteria nhƣ Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas. Những vi khuẩn này có chứa gen tfd thƣờng nằm trên plasmid. Các plasmid này có thể chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác nhờ sự tiếp hợp. Nhóm thứ hai thuộc lớp α–Proteobacteria nhƣ Sphingomonas, chúng đƣợc phân lập từ môi trƣờng có chứa Clo. Nhóm thứ ba gồm những vi khuẩn lớp α–Proteobacteria nhƣng thuộc giống Bradyhizobium, các vi khuẩn này đƣợc phân lập từ đất nguyên thủy ở Canada, Hawaii, Chile và một số khu vực khác (Top và ctv., 1995; Itoh và ctv., 2004). Năm 1989, Roy và Rouge đã phân lập đƣợc hai dòng vi khuẩn Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18086 và Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18087 có khả năng phát triển trong môi trƣờng có 2,4-D và sử dụng hợp chất này nhƣ năng lƣợng và nguồn cacbon duy nhất. Năm 1996, Maltseva và cộng sự đã công bố dòng Halomonadaceae I-18 đƣợc phân lập từ nguồn nƣớc bị ô nhiễm chất thải do sản xuất 2,4-D ở hồ Alkali vùng tây nam Oregon, Canada có khả năng phân hủy 3000mg 2,4-D/l trong 3 ngày trên môi trƣờng có bổ sung 50 mg dịch trích nấm men. Nhóm tác giả này cũng đã công bố 5 giống vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D bao gồm Acinetobacter, Serratiamarcescens, Stenothrophomonas, Flavobacterium và Penicilium đƣợc phân lập từ đất ô nhiễm 2,4-D ở Brazin. Một vi khuẩn khác có khả năng khoáng hóa hoàn toàn 2,4-D là Nocardioidessimplex 3E, vi khuẩn này có thể phân hủy 2,4-D thành trihyđroxylat benzene (Travkin và ctv., 1997). Mai và cộng sự (2001) đã tìm ra đƣợc dòng Stenotrophomonas maltlphilia PM cũng có khả năng phân hủy 2,4-D. Ngoài ra, một số dòng vi khuẩn khác có khả năng phân hủy 2,4-D cũng đƣợc công bố nhƣ: Pseudomonas N.C.B.I 9340 đƣợc phân lập từ các mẫu đất biến dƣỡng 2,4-D ở Anh (Evans và ctv., 1971); Pseudomonas cepacia CSV 90 đƣợc phân lập từ các mẫu đất công nghiệp bị nhiễm 2,4-D ở Ấn Độ (Bhat và ctv., 1994); Alcaligenes eutrophus JMP228 đƣợc phân từ các mẫu đất nhiễm 2,4-D ở Michigan, Mỹ (Top và ctv., 1996); Alcaligenes eutrophus JMP134 đƣợc phân lập ở Mexico (Dunbar và ctv., 1997); Burkholderia phenoliruptrix AC1100 đƣợc phân lập ở Bỉ (Coenyel và ctv., 2004). Ở Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và Đặng Thị Cẩm Hà (2007) đã phân lập đƣợc 3 dòng vi khuẩn phân hủy 2,4-D đều thuộc giống Athrobacter lần lƣợt là Athrobacter sp. DNB19, Athrobacter sp. DNB20, Athrobacter sp. DNB21 trên các mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng. Năm 2008, Hƣơng và cộng tác viên đã phân lập đƣợc các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D nhƣ: Sphingomonas chungbukensis, Burkholderia cepacia, Burkholderia sacchri trên các mẫu đất ở Quảng Trị, Huế và Biên Hòa. Ở ĐBSCL, mƣời dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4-D đã đƣợc phân lập trong đất lúa ở Tiền Giang và Sóc Trăng bao gồm các dòng vi khuẩn thuộc các giống Cupriavidus, Burkholderia và Ralstonia (Hứa Văn Ủ, 2010). Các gen than gia vào sự phân hủy 2,4-D ở vi sinh vật cũng đƣợc phát hiện nhƣ; tfdA, tfdB (Dunbar và ctv.., 1997; Hƣơng và ctv.., 2007; Muller, 2004); cadA (Hƣơng và ctv.., 2007); sdpA, rdpA (Muller, 2004). 2.3.4 Lộ trình phân hủy sinh học 2,4-D Trong tự nhiên, một số vi khuẩn Alcaligenes eutrophus, Azotobacter chroococcum, Ralstonia eutropha, Flavobacterium sp., Arthrobacter sp.,… có khả năng phân hủy 2,4-D thành các hợp chất biến dƣỡng trung gian nhƣ cisAcetylacrylate, 3-Oxoadipate, Pyruvate, Chloroacetaldehyde. Nhờ enzim quan trọng là 2,4-D dehalogenase mà 2,4-D bị khử một gốc Clo thành 4Chlorophenoxyacetate. Enzim 4-chlorophenoxyacetate monooxygenase tiếp tục khử oxi thành 4-Chlorophenol. Kế đến, enzim 2,4-dichlorophenolhydroxylase gắn them 1 nhóm OH thành hợp chất biến dƣỡng trung gian quan trọng là 4Chlorocatechol. Có hai con đƣờng phân hủy 4-Chlorocatechol:  Enzim 4-chlorocatechol-1,2-dioxygenase mở vòng ở vị trí 1, 2 tạo thành 3Chloro-cis,cis-muconate. Qua nhiều hợp chất trung gian cuối cùng tạo thành cis- Acetylacrylate nhờ enzim dienelactonehydrolase hoặc 3-Oxoadipate nhờ enzim maleylacetatereductase.  Enzim 4-chlorocatechol-2,3-dioxygenase mở vòng ở vị trí 2, 3 tạo thành 5Chloro-2-hydroxymuconicsemialdehyde. Qua nhiều hợp chất trung gian cuối cùng nhờ enzim 5-chloro-4-hydroxy-2-oxopentanatealdolase tạo ra hai hợp chất là cyruvate và chloroacetaldehyde (Hình 2). Hình 2: Lộ trình phân hủy sinh học 2,4-D (http://umbbd.ethz.ch/2,4-d/2,4-d_map.html) 2.4 ĐẠI CƢƠNG VỀ CYPERMETHRIN 2.4.1 Đặc tính vật lý, hóa học Cypermethrin là thuốc trừ sâu tổng hợp, dạng pyrethroid nhân tạo đƣợc sử dụng để tiêu diệt côn trùng trên bông, rau diếp, diệt gián, bọ chét và mối trong nhà (World Health Organization, 1989), ít độc đối với gia cầm và động vật có vú, rất bền trong không khí và ánh sáng (Tomlin, 1994), lần đầu tiên đƣợc tổng hợp vào năm 1974 (Gammon, 1981), đƣợc thƣơng mại hóa lần đầu tiên năm 1977. Tất cả các loại thuốc trừ sâu thuộc nhóm này đều đƣợc tổng hợp dựa trên hợp chất pyrethrins-đƣợc các cây họ Cúc tổng hợp để chống lại côn trùng (Lawrence, 1982). Đối với động vật có xƣơng sống và động vật không xƣơng sống, cypermethrin tác động chủ yếu vào hệ thống thần kinh (Klaassen, 1996). Danh pháp: Tên thông dụng: cypermethrin. Tên thƣơng mại: Sherpa, Ambush C, Cymbush, Peran, Cyperan, Barricade, Ripcord, Ammo, Cypermethrine, Asymmethrin, Cymperator, Cypercopal, Hilcyperin, Neramethrin (United States Environmental Protection Agency, 1989). Tên hóa học: (RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl(1RS,3RS;1RS,3SR)-3-(2,2-dichlorovinyl)2,2-dimethylcyclopropanecarboxylate. Hoặc (RS)-α-cyano-3-phenoxybenzyl(1RS)-cis-trans-3-(2,2-dichlorovinyl)-2,2dimethylcyclopropanecarboxylate. Có các đồng phân: alpha-cypermethrin, cypermethrin và zeta-cypermethrin. Công thức hóa học: beta-cypermethrin, theta-