Tài liệu Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng trichoderma sp. phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lịch NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP. PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Phạm Thị Lịch NGHIÊN CỨU TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THÔ TỪ CHỦNG TRICHODERMA SP. PHÒNG TRỪ VI NẤM GÂY HẠI TRÊN CÂY CÀ CHUA Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 60 42 01 07 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2013 LỜI CÁM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi thực hiện đề tài này. Xin chân thành cám ơn PGS. TS. Đồng Thị Thanh Thu, TS. Võ Thị Hạnh, TS. Nguyễn Hữu Phúc đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Xin gởi lời cám ơn đến Ths. Trần Thị Minh Định, bạn Nguyễn Thái Bình, bạn Nguyễn Thiện Phú, cùng toàn thể các thầy cô khoa Sinh, phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa, phòng thí nghiệm Di truyền – Thực vật Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gởi lời cám ơn đến các thầy cô, bạn bè, và những người thân trong gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn. 1 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của chính tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kì công trình nào khác. Tác giả luận văn Phạm Thị Lịch 2 MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN .............................................................................................................. 1 LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................................ 2 MỤC LỤC .................................................................................................................... 3 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... 6 MỞ ĐẦU....................................................................................................................... 7 1. Lí do chọn đề tài..............................................................................................................7 2. Mục tiêu ...........................................................................................................................8 3. Nhiệm vụ ..........................................................................................................................8 4. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................................8 5. Ý nghĩa của đề tài ...........................................................................................................8 6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................................9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 10 1.1. Nấm Trichoderma spp. ..............................................................................................10 1.1.1. Vị trí phân loại ......................................................................................................10 1.1.2. Đặc điểm sinh học.................................................................................................10 1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp. .............................................................................11 1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng..................12 1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp. ............................................14 1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase ..................................................................................16 1.2.1. Chitin.....................................................................................................................16 1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase .............................................................17 1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase .............................................................18 1.2.4. Nguồn thu nhận enzyme chitinase từ vi nấm........................................................19 1.2.5. Các phương pháp nuôi cấy NS thu nhận enzyme chitinase ..................................20 1.2.6. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma spp. ..........21 1.2.7. Tình hình nghiên cứu và sử dụng chế phẩm enzyme chitinase ............................23 1.3. Vi nấm gây hại trên cà chua .....................................................................................27 1.3.1. Đặc điểm sinh thái cây cà chua .............................................................................27 1.3.2. Các tác nhân vi nấm gây hại chủ yếu trên cây cà chua (giai đoạn cây con) .........28 1.3.3. Biện pháp phòng trừ vi nấm trên cây cà chua.......................................................29 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 32 2.1. Vật liệu ........................................................................................................................32 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ...........................................................................................32 3 2.1.2. Hóa chất - Nguyên liệu .........................................................................................32 2.1.3. Thiết bị và dụng cụ ...............................................................................................32 2.1.4. Các MT nghiên cứu đã sử dụng ............................................................................33 2.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................................34 2.2.1. Xác định họat tính sinh enzyme ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch ..................................................................................................................34 2.2.2. Phương pháp bảo quản mẫu bằng dầu khoáng .....................................................35 2.2.3. Phương pháp quan sát hình thái NS ......................................................................35 2.2.4. Xác định hàm lượng glucosamine theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS .........................................................................................................................................36 2.2.5. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme chitinase .................................................37 2.2.6. Phương pháp nuôi cấy NS thu nhận chitinase trên MT bán rắn ...........................38 2.2.7. Phương pháp tách chiết dịch và thu nhận chế phẩm enzyme thô từ MT nuôi cấy .........................................................................................................................................39 2.2.8. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của tác nhân tủa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE ...........................................................................................................................39 2.2.9. Phương pháp thẩm tích CPE bằng màng cellophane ............................................40 2.2.10. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ chitinase của NS ..............................................................................................................40 2.2.11. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến các đặc tính lí hóa của CPE chitinase ..........................................................................................................................41 2.2.12. Phương pháp khảo sát khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh bởi CPE chitinase và các tác nhân kháng nấm khác .............................................................42 2.2.13. Phương pháp khảo sát khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh cây trồng bởi CPE và các tác nhân kháng nấm khác ......................................................43 2.2.14. Gây nhiễm nấm bệnh vào cây cà chua bằng phương pháp nhân tạo [6] ............44 2.2.15. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đếm KL [19] .......................................45 2.2.16. Xác định mật độ BT bằng phương pháp đo mật độ quang [14] .........................45 2.2.17. Phương pháp xử lí CPE chitinase từ Trichoderma sp. phòng vi nấm gây hại trên cây cà chua ......................................................................................................................46 2.2.18. Phương pháp xử lí số liệu thống kê ....................................................................47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 48 3.1. Kết quả tuyển chọn chủng Trichoderma có hoạt độ chitinase cao ........................48 3.2. Ảnh hưởng của MT và các điều kiện nuôi cấy đến hoạt độ chitinase của chủng Trichoderma BL2 ..............................................................................................................49 3.2.1. Ảnh hưởng của MT lên men bán rắn ....................................................................49 3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn cơ chất cảm ứng ...............................................................51 4 3.2.3. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất cảm ứng ...................................................................53 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ MT nuôi cấy ..................................................................54 3.2.5 Ảnh hưởng pH ban đầu của MT nuôi cấy..............................................................55 3.2.6. Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu của MT nuôi cấy .......................................................56 3.2.7. Động thái quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Trichoderma BL2 ..........58 3.3. Chiết tách dịch enzyme và thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 .....................................................................................................................................59 3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các tác nhân tủa đến hoạt tính của CPE ...........59 3.3.2 Quy trình thu nhận CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 ......................60 3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố lí hóa đến hoạt độ enzyme chitinase của CPE ...........62 3.4.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng ........................................................................62 3.4.2. Ảnh hưởng của pH phản ứng ................................................................................63 3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ......................................................................64 3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ bảo quản đến hoạt độ chitinase của CPE ..65 3.5. Kết quả khảo sát khả năng đối kháng của CPE chitinase thô từ chủng Trichoderma BL2 phòng trừ vi nấm gây bệnh cây trồng ..............................................67 3.5.1. Khả năng kìm hãm sự tăng sinh khối vi nấm gây bệnh ........................................67 3.5.2. Khả năng làm giảm độ nảy mầm của BT vi nấm gây bệnh ..................................69 3.6. Kết quả việc sử dụng của CPE chitinase từ Trichoderma BL2 và các tác nhân kháng nấm khác trong phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua ...........................74 3.6.1. Ở các lô gây nhiễm Phytophthora sp ....................................................................74 3.6.2. Ở các lô gây nhiễm Fusarium sp ..........................................................................76 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 82 PHỤ LỤC ................................................................................................................... 88 5 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BT Bào tử CPE Chế phẩm enzyme CPSH Chế phẩm sinh học DNS 3,5-dinitrobenzoic acid HLĐK Hiệu lực đối kháng KL Khuẩn lạc MT Môi trường Nxb Nhà xuất bản NS Nấm sợi OD Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử thật và thử không TB Trung bình TLB Tỉ lệ bệnh TN Thí nghiệm UI Imeasurre Unit (Đơn vị hoạt độ enzyme) VSV Vi sinh vật 6 MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Khí hậu nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển sản xuất nông nghiệp, song cũng tạo điều kiện tốt để các sinh vật gây hại sinh trưởng, phát triển và phá hại nghiêm trọng mùa màng. Trong đó, bệnh hại cây trồng do vi nấm trong đất là một vấn đề mà người nông dân còn gặp nhiều khó khăn trong việc quản lý và phòng trừ. Vi nấm đất gây bệnh có thể tồn tại trong đất trong thời gian rất dài kể cả trong điều kiện không có cây ký chủ. Chúng bảo tồn bằng các sợi nấm, hạch nấm, hậu bào tử, bào tử trứng và những bào tử có vách dày ở trong đất và trên tàn dư cây trồng. Nấm xâm nhiễm, gây hại cây trồng làm cho rễ và các tế bào mạch dẫn của cây không còn khả năng hút nước và chất dinh dưỡng từ giá thể. Vì vậy mà các triệu chứng của các bệnh do vi nấm trong đất gây ra thường rất giống nhau, đều héo vàng, còi cọc và chết cây, làm giảm năng suất thu hoạch. Riêng đối với cà chua, theo thống kê của ngành Bảo vệ Thực vật Lâm Đồng (năm 2012), tại 2 huyện Đơn Dương và Đức Trọng: Bệnh xoăn lá nhiễm trên diện tích gần 600 ha, tỷ lệ hại 2,9 - 20%. Mốc sương: bệnh nhiễm trên 1.236,6 ha tại Đơn Dương, Đức Trọng, tỷ lệ hại 8,4 30%, tăng 271,1 ha so với kỳ trước. Đốm lá vi khuẩn: bệnh nhiễm tại Đơn Dương 1.620 ha, tỷ lệ hại 16,7 - 30%, tăng 120 ha so với kỳ trước. Để phòng trừ vi nấm gây hại trên cây trồng có rất nhiều biện pháp như cơ giới, canh tác, hóa học và biện pháp sinh học. Trong đó, biện pháp sinh học được xem là mang lại hiệu quả, thân thiện, an toàn với môi trường. Biện pháp sinh học tạo môi trường thuận lợi cho các loại sinh vật có ích (kẻ thù tự nhiên của dịch hại) phát triển nhằm góp phần tiêu diệt dịch hại, bảo vệ thiên địch tránh khỏi độc hại do dùng thuốc hoá học, tạo nơi cư trú cho thiên địch sau vụ gieo trồng bằng cách trồng xen, làm bờ rạ cho thiên địch ẩn nấp.... Sử dụng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật có tác dụng trừ dịch hại, không độc hại với các loại sinh vật có ích, an toàn với sức khỏe con người và môi trường. Trong số các nhóm vi sinh vật được sử dụng làm chế phẩm phòng trừ bệnh hại trên cây trồng thì Trichoderma là loài nấm đối kháng đang được quan tâm nhiều hiện nay trong lĩnh vực sản xuất nông nghiệp. Do Trichoderma có khả năng tiêu diệt vi nấm gây hại cây trồng bằng nhiều cơ chế như kí sinh, sinh kháng sinh, tiết các enzyme ngoại bào,… Hệ 7 enzyme ngoại bào của Trichoderma đóng vai trò rất quan trọng trong đấu tranh sinh học, đặc biệt là enzyme chitinase. Chitinase của Trichoderma sẽ phân hủy vách tế bào chủ của các loài nấm gây hại, vì chitin là một trong những thành phần cấu tạo chính của vách tế bào vi nấm gây bệnh trên cây trồng. Từ những lí do trên, chúng tôi quyết định chọn đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp. để phòng trừ vi nấm gây hại trên cây cà chua” 2. Mục tiêu Tạo chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng nấm mốc Trichoderma sp. có khả năng phòng trừ vi nấm gây hại trên cà chua. 3. Nhiệm vụ Tuyển chọn chủng Trichoderma sp. có khả năng sinh enzyme chitinase cao trong các chủng Trichoderma khảo sát. Nghiên cứu điều kiện môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho việc sinh tổng hợp chitinase của chủng tuyển chọn. Thu nhận enzyme chitinase và tạo chế phẩm enzyme. Nghiên cứu các đặc điểm lí hóa của chế phẩm enzyme chitinase. Thử nghiệm khả năng phòng – diệt nấm bệnh trên cây cà chua của chế phẩm trong điều kiện in vivo. 4. Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm Trichoderma nhận từ Viện Sinh học Nhiệt đới và phòng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hóa Trường ĐHSP Tp. HCM. Chủng Fusarium sp. nhận từ Bộ môn Bảo vệ thực vật – Khoa Nông học Đại học Nông Lâm. Chủng Phytophthora sp. nhận từ Viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp miền Nam. 5. Ý nghĩa của đề tài  Ý nghĩa khoa học Góp phần tìm hiểu về khả năng phòng trừ nấm bệnh gây hại cà chua của chế phẩm enzyme chitinase từ Trichoderma sp. 8  Ý nghĩa thực tiễn Dựa vào kết quả thu được và chế phẩm tạo ra trong đề tài có thể ứng dụng làm chế phẩm sinh học để phòng trừ vi nấm gây bệnh trên cây cà chua. 6. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian: 12/2012 – 8/2013 Địa điểm: phòng Vi sinh – Sinh hóa Trường Đại học Sư phạm TP. HCM 9 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm Trichoderma spp. 1.1.1. Vị trí phân loại Trichoderma được xem là nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn trong phân loại vì các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại chưa được phân tích đầy đủ. Trước đây, người ta cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [64]. Hiện nay, dựa vào việc phân tích trình tự một số gen đặc trưng như ITS, tef, rpb, ech24, Druzhinina và cộng sự (2006) đã phân loại Trichoderma như sau [30]: Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Euascomycetes Bộ Hypocreales Họ Hypocreaceae Chi Trichoderma 1.1.2. Đặc điểm sinh học Trichoderma spp. được tìm thấy nhiều trong MT tự nhiên, đặc biệt trong MT đất. Chúng phát triển trên nhiều loại cơ chất khác nhau (sáp, gỗ, các loài nấm khác). Trichoderma spp. là nhóm vi nấm phổ biến ở đất (pH = 3 – 8) như đất nông nghiệp, đồng cỏ, rừng, đầm muối và đất sa mạc…[33], [63]. Phần lớn Trichoderma spp. ưa độ ẩm, riêng T. hamatum và T. pseudokoningii có thể chịu độ ẩm cao hơn so với những loài khác. Tuy nhiên, các loài Trichoderma spp. thường không chịu được độ ẩm thấp vì thế số lượng Trichoderma giảm đáng kể trong nơi có độ ẩm thấp [60]. Đa số các chủng Trichoderma phát triển trong đất có độ pH từ 2.9 đến 9.5; pH tối thích là từ 4.6 đến 6.5. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 30oC. Một vài dòng phát triển tốt ở 35oC, một số ít phát triển ở 40oC [64]. KL nấm có màu trắng hoặc từ trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Các chủng Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh, KL có thể đạt đường kính từ 4 – 9 cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25oC. 10 Hình thái KL và BT của Trichoderma khác nhau khi ở những điều kiện nhiệt độ khác nhau. Ở 35oC chúng tạo ra những KL rắn, dị thường với sự hình thành BT nhỏ và mép KL bất thường, ở 37oC không tạo ra BT sau 7 ngày nuôi cấy. Hầu hết các loài Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính, chúng sinh sản vô tính bằng BT đính từ khuẩn ty. Khuẩn ty của Trichoderma không màu, cuống sinh BT phân nhánh nhiều. Ở cuối nhánh phát triển thành một khối tròn mang các BT trần không có vách ngăn, thường không màu. BT có dạng hình cầu, hình trứng hoặc hình trụ ngắn. Sợi nấm có đường kính từ 0,5 – 10 µm, được bao bọc bởi thành tế bào. Thành tế bào không chứa cellulose như thực vật mà chứa chitin và một số thành phần khác như polysaccharide, lipit, protein, hexozamin, chất màu. Màng tế bào chất dày khoảng 7 µm chứa lipit (40%) và protein (38%) [62]. Trichoderma spp. có thể sinh tổng hợp được nhiều loại enzyme ngoại bào như chitinase, glucanase, xylanase, pectinase, cellulase…để phân hủy các nguồn xác bã hữu cơ thực vật và vách tế bào nấm bệnh [13]. 1.1.3. Cấu trúc của Trichoderma spp. Bề mặt tế bào của hầu hết các loại nấm bao gồm 3 lớp: màng nhày, vách tế bào, màng tế bào. Cấu trúc vách tế bào của Trichoderma thuộc dạng chitin-β-glucan. Tuy nhiên, chitin hiện diện ở hệ sợi nấm lại không có ở BT của T. viride. Vách tế bào của một vài chủng Trichoderma đã được phát hiện chứa galactose và N-acetyl-β -D-galactosimin lectin [43], [66]. Trichoderma spp. có nhân điển hình, được bao quanh bởi một màng đôi. BT đính thường chứa nhiều hơn 1 nhân. Trichoderma spp. có số lượng nhân khác nhau, một số đơn nhân, một số đa nhân. T. reesei hình thành nhân nhỏ sau khi xử lý colchicin do sự phân chia nhân bất bình thường. Hàm lượng DNA trung bình của những nhân nhỏ này bằng khoảng 30% của nhân bình thường, gọi là đa bội lệch. Những nhân này có thể hữu ích cho việc vận chuyển những lượng DNA nhỏ vào trong thể nguyên sinh [43], [66]. Nghiên cứu gần đây cho thấy trong tế bào của chúng có tất cả các bào quan của một eukaryote. Cấu trúc của 1 số bào quan (như thể golgi) thì khác biệt so với eukaryote nhưng vẫn chưa biết rõ những đặc tính về sinh hóa có khác nhau hay không. Một vài loài Trichoderma spp. chứa một lượng lưới nội chất khá lớn và nhiều nhất là ở chủng T. reesei [43], [66]. 11 1.1.4. Các cơ chế đối kháng của Trichoderma với nấm gây bệnh cây trồng Nấm đối kháng là những nhóm VSV phổ biến của hệ vi sinh trong đất. Chúng thường tiết ra các men, kháng sinh gây độc cho nấm gây bệnh hoặc cạnh tranh điều kiện sống với nấm gây bệnh. Nấm đối kháng có thể kìm hãm sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh trên cây và giúp cây hồi phục, sinh trưởng phát triển. Trichoderma cũng là một trong những giống nấm có khả năng ức chế một số nấm gây bệnh như: Sclerotium rolfsii, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia… gây bệnh trên nhiều loài cây trồng. Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế  Cơ chế kí sinh Vào năm 1932, Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh và đặt tên cho hiện tượng đó là “Giao thoa sợi nấm” [68]. Hiện tượng giao thoa gồm ba giai đoạn như sau: Giai đoạn 1: Sợi nấm Trichoderma hướng về sợi nấm gây bệnh (nấm kí chủ). Hiện tượng này là đặc tính hướng hóa của Trichoderma spp., chúng sẽ hướng về nơi có chất hóa học do nấm chủ tiết ra. Khi tơ nấm Trichoderma đến gần tơ nấm kí chủ, chúng có xu hướng tiếp xúc và cuộn xung quanh sợi nấm chủ, sau đó hình thành cấu trúc móc hoặc ép sát sợi nấm kí chủ và phát triển song song với nấm kí chủ [68]. Giai đoạn 2: Sau khi vây quanh, sợi nấm Trichoderma sẽ thủy phân vách nấm kí chủ bằng cách tiết ra các enzyme ngoại bào như: chitinase, glucanase, cellulase [68]. Giai đoạn 3: Cuối cùng sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng màng sinh chất của tế bào nấm kí chủ, làm cho chất nguyên sinh trong nấm kí chủ bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh bị chết [68].  Cơ chế cạnh tranh Một cơ chế khá phổ biến đã được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây là sự cạnh tranh của nấm đối kháng với nấm bệnh tại vùng rễ. Trichoderma spp. có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nguồn gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú. Nấm Trichoderma thường định cư trước so với các nguồn gây bệnh cây. Do đó, chúng chiếm chỗ định cư cũng như dinh dưỡng của nguồn gây bệnh [27].  Cơ chế tiết kháng sinh 12 Một số chất như trichozianine, trichothecene, trichotoxin A, viridin, ergokonin A… là kháng sinh có hoạt tính kháng nấm được phát hiện nhiều ở loài T. harzianum, T. polysporum, T. viride, T. longibrachiatum [27].  Cơ chế tiết enzyme Cơ chế quan trọng giúp Trichoderma đối kháng hiệu quả với nấm gây bệnh cây trồng là nhờ vào khả năng tiết ra nhiều loại enzyme. Các loại enzyme do Trichoderma tiết ra gồm có: Endochitinase, glucanase 1,3-βglucosidase, chitobiosidase, trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, N-acetyl- β glucusaminidase (NAGase)...[46]. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme chitinase Trichoderma phổ biến hiện nay là dựa vào vị trí thủy phân, gồm 3 nhóm: Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer tạo thành sản phẩm là một hỗn hợp các polymer có trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính của endochitinase không thể phân cắt thêm được nữa [46]. Chitin 1,4-β-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer [(GlcNAc)n, n>3] từ đầu không khử và chỉ phóng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2 [46]. β-N-acetyl hexosaminidase (exochitinase) phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu không khử và chỉ phóng thích các đơn phân N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) [46]. Ngoài ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong, trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enzyme chitinase có khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì không. Có hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngoài tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tóm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên [50], [54]. Endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase có thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thô thu từ vỏ tôm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và β-N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng β-N13 acetyl hexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của β-N-acetyl hexosaminidase nhưng không là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế, có thể sử dụng (GlcNAc)2 để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và β-N-acetyl hexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine [54]. Như vậy, nhờ sự kết hợp của cơ chế tiết các enzyme ngoại bào và các cơ chế đối kháng khác mà Trichoderma spp. đã thể hiện khả năng đối kháng với vi nấm gây bệnh một cách tối ưu, hiệu quả. 1.1.5. Vai trò - tiềm năng ứng dụng của Trichoderma spp.  Kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật Trong trường hợp này, Trichoderma spp. đóng vai trò là những nhân tố mẫn cảm với rễ, kích thích hệ thống miễn dịch chủ động và bị động ở thực vật. Khả năng đề kháng của thực vật tăng khi tăng: nồng độ của chất chuyển hoá; các enzyme liên quan đến cơ chế tự bảo vệ (phenylalanine ammonio-lyase, chalcone synthase); các enzyme liên quan tới sự tổng hợp phytoalexin, chitinase và glucanase. Sự có mặt các chất trao đổi của Trichoderma kích thích sự tổng hợp phytoalexin ở thực vật. Đây là những protein liên quan đến sự kháng bệnh của cây. Nhờ đó, hệ thống gen thực vật có thể chủ động phản ứng lại các tác nhân gây bệnh và các nhân tố kích thích khác.Cơ chế tự bảo vệ thực vật có thể hoạt động mà không nhất thiết đòi hỏi sự kích thích của các sinh vật sống [41]. Ví dụ, lúa mạch có sức đề kháng với sự nhiễm Fusarium tăng lên khi có mặt của endochitinase từ T. atroviride. Thuốc lá và khoai tây mang gen mã hóa chitinase từ T. harzianum có sức chịu đựng cao hơn với điều kiện bất lợi của MT và hoàn toàn kháng lại nấm bệnh Alternaria alternate, Alternaria solani, Botrytis cinerea trên lá và với nấm bệnh từ đất như Rhizoctonia solani. Những kết quả tương tự đã đạt được với enzyme chitinase trong dâu tây; chitinase và β-1,6-glucanase trong dưa và cây cà chua. Sự kích hoạt các phản ứng tự bảo vệ thực vật sử dụng các nhân tố kích thích có thể là một chiến lược có giá trị như một thay thế cho việc sử dụng các thực vật biến đổi gen, để bảo vệ thực vật chống lại tác nhân gây bệnh [8].  Kích thích sự tăng trưởng của thực vật Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh khi cây được xử lí và rễ bị xâm nhiễm bởi những loài Trichoderma một cách thường xuyên sẽ làm tăng cường sự phát triển hệ rễ và năng suất cây trồng, tăng sức đề kháng với những điều kiện vô sinh, tăng khả năng hấp thu 14 và sử dụng dinh dưỡng. Năng suất cây trồng trong các cánh đồng có thể tăng lên đến 30% sau khi bổ sung T. hamatum hay T. koningii. Các thử nghiệm tiến hành trong điều kiện nhà kính, đã cho thấy có sự tăng sản lượng đáng kể khi hạt giống cây được xử lí với các BT Trichoderma trước khi gieo trồng [41]. Yedidi chỉ ra rằng sự thúc đẩy sinh trưởng hiệu quả khi có sự hiện diện của Trichoderma spp. ở vùng rễ giúp rễ hấp thu được nhiều chất dinh dưỡng có sẵn trong đất, ngay cả trong điều kiện MT đất hạn chế dinh dưỡng [69]. Ngoài khả năng kích thích cơ chế tự bảo vệ của thực vật và kích thích sự tăng trưởng của thực vật, Trichodema spp. còn có khả năng tái tạo lại quần thể, làm tăng BT trong đất để kháng các vi nấm gây hại... Chính vì vậy mà hiện nay trên thị trường có nhiều dạng chế phẩm nấm Trichoderma: Chế phẩm dạng sợi nấm: là loại chế phẩm được sản xuất từ sinh khối của sợi nấm, trong đó nấm chuyên tính được nhân sinh khối theo phương pháp lên men chìm hoặc lên men xốp (lên men trong giá thể có bổ sung dinh dưỡng, lên men trên MT bán rắn). Sau khi sinh khối hệ sợi nấm đạt cao nhất, thu hoạch hệ sợi rửa sạch và loại bớt nước bằng cách ly tâm và phơi trong không khí để đạt độ ẩm 40%. Sản phẩm dạng này phải được bảo quản trong điều kiện lạnh cho đến khi sử dụng. Ưu điểm của sản phẩm này là dễ làm, ít tốn kém song không bảo quản được lâu, có nguy cơ bị tạp nhiễm cao và hiệu lực không ổn định [8]. Chế phẩm dạng BT: người ta nhân sinh khối nấm trong MT xốp đến khi BT nấm hình thành và chín, thu hồi sinh khối nấm cùng giá thể sau đó phơi khô và nghiền mịn. Ưu điểm của chế phẩm dạng này là có thể bảo quản được lâu, ít tạp nhiễm, có hiệu lực cao, ổn định. Để tránh tạp nhiễm từ bên ngoài các thao tác nuôi, trồng, thu hoạch và chế biến phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng, người sản xuất phải có kinh nghiệm và trang thiết bị đắt tiền [8]. Chế phẩm dạng lỏng: bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Nông Lâm TP.HCM đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Trichoderma dạng lỏng dùng cho rau sạch và ứng dụng thử nghiệm thành công ở Hóc Môn, Củ Chi,... Chế phẩm Trichoderma sau khi nhân đạt mật độ BT cao nhất có thể sử dụng ngay để trừ bệnh trên đồng ruộng, tuy nhiên sẽ tốn công vận chuyển, khó bảo quản và nhanh bị thối [8]. 15 1.2. Chitin và hệ enzyme chitinase 1.2.1. Chitin  Khái niệm Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polymer sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g/ 1 năm/1 m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae. Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật không xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn… Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khô. Vì vậy vỏ tôm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng [30], [53]. Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau. Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ cua và tôm. Trong công nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ… nên việc tách chiết còn khó khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời không làm biến đổi tính chất của chitin [30], [53].  Cấu trúc phân tử Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc, người ta thấy rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 1- 4 glucoside [53]. Chitin có cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ; sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuôi, ngược xen kẽ nhau; nhưng có một cặp xếp cùng chiều. Ở chuỗi β–chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định. Chuỗi γ–chitin có các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc [53].  Tính chất của chitin Chitin ở thể rắn, có cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin không tan trong nước, trong dung dịch acid loãng, dung dịch kiềm loãng, trong cồn và trong các dung môi thông thường. Nó chỉ tan được trong một số acid vô cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…) [31]. 16 1.2.2. Định nghĩa - Phân loại enzyme chitinase 1.2.2.1. Định nghĩa Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl glucosamine liên tiếp nhau trong chitin [50]. 1.2.2.2. Phân loại  Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4- β-chitobiosidase, Nacetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase) Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide [30], [54]. Chitin-1,4- β-chitobiosidase: là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose [30], [54]. N-acetyl- β-D-glucosaminidase (exochitinase): là enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine [30], [54].  Dựa vào cấu trúc phân tử Enzyme chitinase được xếp vào 3 họ Glycohydrolase - Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, được tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc eukaryote, prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngoài ra còn có các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase này hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-monomer. Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serrati marcescens…[50]. - Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhóm I, II,IV [50]. - Enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 20 17 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-glucosamine acetyl hexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người [50].  Dựa vào trình tự amino acid Dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [61]: Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycine hoặc proline ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng không cần cho hoạt động xúc tác. Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn. Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II. Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao. 1.2.3. Đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase  Trọng lượng phân tử Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển có trọng lượng phân tử khoảng 30 kDa (kilodalton). Ở các loài thân mềm, chân đốt, động vật có xương (cá, lưỡng cư, thú), một số chitinase có trọng lượng phân tử khoảng 40 - 90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120 kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn có khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa [38], [58].  Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis Enzyme chitinase có giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3 – 10 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7 – 9,3 ở côn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở VSV [49]. Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) [49].  Ảnh hưởng của nhiệt độ 18