Tài liệu Nghien cứu hệ nấm cộng sinh arbuscular mycorrhiza trong đất va rễ cam tại quỳ hợp nghệ an

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC -------*------- LÊ THỊ THỦY NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2012 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Sự cộng sinh giữa nấm và rễ cây trồng đƣợc phát hiện lần đầu tiên vào năm 1885 do A.B.Fank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức. Nhƣng phải đến năm 80 của thế kỷ 20 mới đƣợc tập trung nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất. Nấm rễ cộng sinh là hiện tƣợng rất phổ biến trong tự nhiên, có khoảng 60 – 80% các loài thực vật trên thế giới có mối quan hệ cộng sinh với nấm nội cộng sinh. Đây là mối quan hệ cộng sinh không thể tách rời: Nấm không có rễ thì không thể tồn tại, cây không có nấm cây sinh trƣởng yếu vàng và chết [11]. Đã có nhiều công trình khoa học chứng minh vai trò của nấm cộng sinh mang lại những lợi ích to lớn, thiết thực đối với quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây trong điều kiện bất lợi của môi trƣờng, bởi vậy chỉ trong điều kiện đất đai khô hạn, nghèo dinh dƣỡng thì nấm rễ mới phát huy tốt vai trò cộng sinh của mình. Chính vì vậy, hình thức cộng sinh này đã và đang đƣợc nghiên cứu (về phân loại, sinh học phân tử, ảnh hƣởng của chúng đối với thực vật...) và ứng dụng vào thực tiển sản xuất nông – lâm nghiệp ở nhiều nƣớc trên thế giới. Ở Việt Nam, diện tích đất trồng trên cạn là rất lớn (3 317 270 ha), chủ yếu là các loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Tuy nhiên, trong phát triển sản xuất thƣờng gặp khó khăn về vấn đề nƣớc tƣới, đất chua và dinh dƣỡng . Vì vậy, việc nghiên cứu áp dụng kỹ thuật phát triển nấm cộng sinh Mycorrhiza cho một số cây trồng chính tại các vùng sinh thái phục vụ sản xuất Nông – Lâm nghiệp bền vững ở nƣớc ta nhằm nâng cao năng suất cây trồng, duy trì và bảo vệ và nâng cao độ phì nhiêu của đất là vấn đề cấp bách cần đƣợc quan tâm hiện nay. Cho đến nay, một số nhà khoa học của Viện Lâm nghiệp, Viện Công nghệ sinh học, Viện Thổ nhƣỡng nông hóa… cũng đã công bố những nghiên cứu cơ bản về nấm rễ cộng sinh. Kết quả của những nghiên cứu này Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn mới chỉ dừng lại ở mức phân lập, lƣu giữ bào tử nấm cộng sinh và nghiên cứu xƣ̉ lý đất ô nhiễm chì có sƣ̉ dụng nấm Mycorrhiza. Tuy nhiên vẫn chƣa có nghiên cứu về khả năng cộng sinh của nấm cộng sinh trên cây cam nhằm tạo ra chế phẩm làm tăng năng suất và chất lƣợng. Trong các loại cây ăn quả, Cam Vinh là một loại cây ăn quả đặc sản truyền thống có giá trị dinh dƣỡng cao, đồng thời cũng rất có giá trị về kinh tế. Tuy nhiên, diện tích trồng cam ở đây đang dần bị thu hẹp và chất lƣợng của cam đang ngày càng bị mai một. Với mong muốn có thể góp phần nào đó vào việc cải thiện năng suất, chất lƣợng cam, nhóm nghiên cứu tiến hành nghiên cứu đề tài: “NGHIÊN CỨU HỆ NẤM CỘNG SINH ARBUSCULAR MYCORRHIZA, TRONG ĐẤT VÀ RỄ CAM TẠI QUỲ HỢP - NGHỆ AN‟‟. Với mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau: Mục tiêu nghiên cứu : Nghiên cứu hệ nấm nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) trên đất trồng cam ở Xã Minh Tân - Phủ Qùy – Nghệ An. Trên cơ sở đó, góp phần đề xuất các giải pháp về phân bón, canh tác nhằm làm tăng năng suất, chất lƣợng chè, ổn định độ phì nhiêu, cải thiện môi trƣờng đất vùng trồng cam. Nội dung nghiên cứu:  Xác định thành phần loài AMF tại vùng nghiên cứu.  Xác định đặc điểm phân bố AMF trong đất trồng cam tại Phủ Qùy – Nghệ An.  Xác định loài AMF trong đất trồng cam bằng kỹ thuật sinh học phân tử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LỊCH SỬ HÌNH THÀNH TÊN GỌI ARBUSCULAR MYCORRHIZA FUNGI (AMF) Thuật ngữ “Mycorrhiza” lần đầu tiên đƣợc Frank – nhà bệnh cây lâm nghiệp ngƣời Đức – đƣa ra vào năm 1885 để chỉ mối quan hệ đặc biệt giữa rễ cây và nấm ngoại cộng sinh [53]. Sƣ̣ cộng sinh của Mycorrhiza với rễ đƣợc mô tả nhƣ (hình 1.1). Thuật ngữ này bắt nguồn từ chữ Hy Lạp: Mykes (nấm) và Rhiza (rễ). Năm 1887, Frank đã chỉ ra sự khác biệt giữa nấm ngoại cộng sinh và nấm nội cộng sinh, thực chất là sự khác biệt giữa Ericaceous và Orchid, từng đƣợc gọi là “Phycomycetous Endomycorrihiza” để phân biệt với dạng cộng sinh của nấm bậc cao với các loài trong họ Ericaceae và Orchidaceae. Tuy nhiên, tên gọi này tồn tại không lâu vì không có ý nghĩa [33]. Những nghiên cứu tiếp theo về cấu trúc đã dẫn đến sự thay đổi tên gọi của hình thức cộng sinh này. Năm 1897, tác giả Janse đã gọi cấu trúc dạng bọng bên trong tế bào rễ của thực vật bị nhiễm nấm Mycorrhiza là “Vesicules” (gọi là thể V). Năm 1905, Gallaud gọi những cấu trúc dạng bụi (chùm) trong tế bào thƣờng đƣợc quan sát thấy là “Arbuscular” (gọi là thể A). Do vậy, tên gọi “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” (viết tắt là VAM) đƣợc hình thành và tồn tại cho đến thời gian gần đây [19]. Bên cạnh đó, một số bài báo và công trình khoa học khác còn sử dụng tên gọi “Vesicular –A rbuscular Mycorrhiza Fungi” để chỉ loại hình cộng sinh này [23]. Những nghiên cƣ́u sau này cho thấy, thể A là đặc điểm chung nhất của các chi nhƣng không phải tất cả nấm nội cộng sinh đều hình thành thể V. Do vậy, loại hình Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 http://www.lrc-tnu.edu.vn cộng sinh này có thể đƣợc đổi tên là “Arbuscular Mycorrhiza”. Nói chung, tên gọi của nó vẫn chƣa hoàn toàn thống nhất. Năm 2005, Hội nghị Quốc tế về Mycorrhiza lần thứ 17 đƣợc tổ chức tại Lisboa – Bồ Đào Nha đã quyết định lấy tên “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (AMF) để chỉ loại hình cộng sinh này. Do vậy, trong các tài liệu mới đƣợc công bố, thuật ngữ “Arbuscular Mycorrhiza Fungi” (viết tắt là AMF) đã đƣợc thống nhất sử dụng thay cho thuật ngữ “Vesicular – Arbuscular Mycorrhiza” vào năm 2008 [28]. Hình 1.1. Sƣ̣ cộng sinh của AMF trong rễ cây trồng. 1.2. PHÂN LOẠI MYCORRHIZA Đặc điểm nhận dạng của một số loài bào tử AMF (dựa theo phân loại của Gerdemann, 1963) [32] bảng 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 1.1. Đặc điểm nhận dạng của một số loại bào tử AMF Tên chi Tên loài Hình dạng Ambisporum Marcaropus Appendicul a Delicate Dilatata Gigaspora Thành bào tử mỏng, có 2 lớp. 100-150 100-125 Thành bào tử mỏng. Thành bào tử mỏng, có quả bào tử. Hình cầu Có mầu vàng nhạt 150-175 Thành bào tử dày, 1-6 µm. Có mầu nâu, nâu đậm Có mầu nâu, đen 100-175 125-200 Thành bào tử dày. Thành bào tử dày,có nhiều lớp. Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử dày, có vách ngăn. Có mầu nâu nhạt hoặc vàng nhạt 150-200 Thành bào tử dày, có 3-4 lớp. Có mầu nâu hoặc nâu nhạt 120-175 Thành bào tử mỏng,1-2 lớp colombiana Hình cầu hoặc hình trứng schenckii. Hình cầu ,hình tròn Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng Coccogena Bào tử có dạng hình cầu, gần hình cầu, elip Có mầu nâu nhạt 100-150 Coremioides Bào tử có hình cầu, Có mầu nâu, nâu đậm 120-180 Rhyniensis Hình cầu hoặc hình elip Có mầu nâu đậm 150-200 Candida, Bào tử thƣờng có hình cầu và gần hình cầu, một số có hình elip Có mầu nâu, nâu đậm, mầu nâu đỏ 120–160 Albida Bào tử có dạng hình cầu, hoặc elip Có mầu vàng nhạt 120-150 Sclerocystis Glomites 120-175 Hình cầu hoặc hình trứng Hình cầu hoặc hình trứng có quả bào tử, hình cầu Hình cầu, có quả bào tử Acaulospora Có quả bào tử, hình cầu hoặc gần Myriocarpa, hình cầu. Bireticulata Hình cầu, dạng quả lê Lacunose. Hình cầu Entrophora Đặc điểm Có mầu nâu, mầu nâu đỏ, một số có mầu vàng nhạt Mầu nâu, nâu đậm Nâu hoặc mầu vàng nhạt Aggregatum Hình cầu, hình trứng, có cuống nhỏ Glomus Mầu sắc Kích thước (µm) Có mầu nâu nhạt hoặc mầu vàng nhạt 120-200 5 Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 nhóm 150-200 Thành dày chia bào tử thành 3 lớp. Thành bào tử mỏng có 2 lớp. Thành bào tử có 3 lớp,chia làm 2 nhóm. Thành bào tử có cấu trúc kiểu liên tiếp, gồm nhiều lớp. Thành bào tử có 3 lớp chia làm 2 nhóm Thành bào tử có cấu trúc nối tiếp, gồm 3 – 5 lớp. Căn cứ về mặt hình thái có thể chia nấm rễ thành 3 loại chủ yếu: Nấm rễ ngoại cộng sinh, nấm rễ nội cộng sinh và nấm rễ nội ngoại cộng sinh. * Nấm rễ ngoại cộng sinh (Ectomycorrhiza): Đây là một loại nấm hình thành mạng lƣới Hartig trong gian bào tầng vỏ rễ và mô sợi nấm dày đặc trên bề mặt rễ của cây, không có mũ rễ, không có lông hút. Nấm r ễ ngoại cộng sinh thƣờng có màu sắc và hình dạng nhất định (có thể nhận thấy bằng mắt thƣờng). * Nấm rễ nội cộng sinh (Endomycorrhiza): Đặc trƣng là không có sự biến đổi màu sắc và hình thái của rễ, có lông hút, không có thể sợi nấm và không có mạng lƣới Hartig. Nấm rễ nội cộng sinh gồm 2 loại là: nấm rễ nội cộng sinh không có màng ngăn (AEM) và sợi nấm nội cộng sinh có màng ngăn (SEM). Với loại SEM, khi giải phẫu sẽ thấy bên trong tế bào biểu bì rễ có các túi bọt (Vesicular) và chùm (Arbuscular). * Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh (Ectendomycorrhiza): Mang đặc trƣng của 2 loại nội cộng sinh và ngoại cộng sinh về hình thái cũng nhƣ sinh lý. Hiện nay, ngƣời ta nhận thấy có 7 hình thức cộng sinh: * Arbuscular Mycorrhiza Fungi (AMF): Cộng sinh kiểu tạo bụi (chùm). * Ectomycorrhizas (ECM): Nấm rễ ngoại cộng sinh. * Orchid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây họ Lan (Orchidaceae). * Ericoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh với các cây thuộc bộ Đỗ Quyên (Ericales). * Ectendo Mycorrhizas: Nấm rễ nội – ngoại cộng sinh. * Arbutoid Mycorrhizas: Nấm rễ có cả nội cộng sinh và ngoại cộng sinh nhƣng chỉ xuất hiện giới hạn trong các chi Arbutus, Arctostaphylos và Arctous của họ Đỗ Quyên (Ericaceae). * Monotropoid Mycorrhizas: Nấm rễ cộng sinh xuất hiện trong họ Monotropaceae của bộ Đỗ Quyên (Ericales). Theo thống kê của Harley (1959), khoảng 3% số cây có hoa ở các loài cây gỗ và cây bụi có ECM, 90% các loài cây thân cỏ có AMF, ngoài ra một số loài cây gỗ có cả ECM và AMF [32]. 6 Hình 1.2. Biểu đồ cây phát sinh chủng loại AMF (http://www.ffp.csiro.au/research/mycorrhiza [62]) 7 1.3. PHÂN LOẠI BÀO TỬ AMF Thông thƣờng, việc phân loại nấm nội cộng sinh chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái và cấu trúc (Bảng 1.1). Một trong những cơ sở quan trọng để phân loại theo hình thái là bảng màu của Morton. Phƣơng pháp ADN và giải phẫu sẽ đƣợc dùng để đánh giá quan hệ ở mức cao hơn do Smith và Tinker đề xuất 1997 [51]. Nhìn chung, hệ thống phân loại AMF đang áp dụng dựa trên cơ sở hệ thống phân loại của Morton và Benny đƣa ra vào năm 1990 và đƣợc hoàn chỉnh dần nhờ hàng loạt các nhà nghiên cứu tiếp đó [39]. Lịch sử hình thành hệ thống phân loại này trƣớc hết phải kể đến việc hình thành chi Endogone năm 1808. Tiếp đó là chi Glomus do anh em Tulasne mô tả năm 1844. Đến năm 1849, tác giả Fries xây dựng nên họ Endogonaceae, sau đó họ này bị thay đổi do loài mới phát hiện có rất ít đặc điểm chung. Đây là thời điểm để hoàn thiện sự phân loại và phƣơng pháp nhận biết tất cả các loại bào tử của AMF. Năm 1959, Moss (nhà Giải phẫu thực vật) và Bowen (nhà Sinh thái học) đã đƣa ra hệ thống mô tả dựa trên cấu trúc vách tế bào, màu sắc và đặc điểm tế bào chất [40]. Tuy nhiên, khi áp dụng phƣơng pháp này thì Gerdermann đã phát hiện ra rằng Endogone có số lƣợng loài rất lớn, cần phải xem xét lại và tác giả đã chia Endogone thành 7 chi với 3 chi không cộng sinh: Endogone, Modicella, Glaziella và 4 chi cộng sinh: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora (trong đó Gigaspora và Acaulospora là 2 chi mới) [31]. Với hệ thống phân loại của Gerdermann, Viện Nghiên cứu sinh học – Viện Hàn lâm khoa học Ấn Độ đã phân lập từ đất vƣờn ƣơm 4 chi AMF: Glomus, Sclerocystics, Gigaspora, Acaulospora và 1 chi không cộng sinh (Endogone). 8 Năm 1982, Trappe và Schenck đã đề xuất đƣa 5 loài AMF ra khỏi chi Sclerocystics để hình thành chi mới Scutellospora [58], đến năm 1987 Walker cũng đề xuất nhƣ trên [60]. Năm 1990, tác giả Morton và Benny đặt 5 chi của Walker vào 3 họ: Glomaceae, Gigasporaneae, Acaulosporaceae và 2 bộ phụ: Glomineae, Gigasporineae, trong đó 2 bộ phụ này đƣợc đặt trong bộ mới Glomales [39]. Năm 1998,Trung tâm Nghiên cứu AMF của Đài Loan (Arbuscular mycorrhizal fungal Collection center in Taiwan – ACT) đề nghị công nhận 2 chi mới là Glomites và Jimtrappea. Hiện nay, hệ thống phân loại của ACT thƣờng đƣợc sử dụng ở các nƣớc châu Á. Năm 2008, Shipra Singh và đtg tiếp tục công bố thêm 2 họ AMF là: Archacosporaceae và Paraglomaceae với 2 chi mới là: Archacospora và Paraglomus [49]. 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MYCORRHIZA Phương pháp tách bào tử Muốn tiến hành phân loại thì công việc đầu tiên là tách bào tử từ đất. Thông thƣờng, bào tử đƣợc tách bằng sàng ƣớt và lọc. Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để lọc tuyến trùng từ đất do Gerdermann đã cải biên cho phù hợp với nấm nội cộng sinh [32]. Trên cơ sở đó nhóm tác giả Daniel và Skipper (1982) và tiếp sau đó tác giả Tommerup (1992) đã cải tiến thành phƣơng pháp sàng ƣớt (wet sieving) qua rây kết hợp với ly tâm trong thang nồng độ của sucrose (dịch 50%) [25, 56]. Quan sát, đếm số lượng bào tử Tùy vào kích cỡ, quá trình quan sát bào tử có thể đƣợc thực hiện trên kính lúp hoặc kính hiển vi có độ phóng đại nhỏ. Số lƣợng bào tử đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm trực tiếp trên màng lọc có chia ô của hãng Satorrius [24]. 9 Xác định dạng xâm nhiễm Để xác định các dạng xâm nhiễm, ngƣời ta tiến hành nhuộm Tryphan blue (0,005%) làm biến màu thể cần xác định trong rễ của cây chủ, do Philip và Hayman đề xuất cụ thể nhƣ sau: Đầu tiên, nấm rễ cộng sinh đƣợc rửa nhiều lần bằng nƣớc cất nhằm loại bỏ đất và các tạp chất hữu cơ bám trên bề mặt của rễ sau đó đun nóng bằng dung dịch KOH 10% ở nhiệt độ 90 oC trong vòng 2h, sau đó rửa bằng axít và biến màu bởi Tryphan blue, kết quả là sợi nấm sẽ bắt màu xanh [43]. Đối với thực vật có nhiều sắc tố trong rễ, Kormanik và cộng sự đề xuất phƣơng pháp sử dụng fuschin làm mất màu những mẫu rễ cây cần quan sát [35]. Năm 1996 tác giả Brundrett đã đƣa ra một phƣơng pháp mới với thuốc nhuộm là Chlorazol black E, nhờ đó có thể quan sát một cách rõ ràng những giai đoạn của AMF trong rễ cây chủ [24]. Tuy nhiên, tất cả các phƣơng pháp trên đều có chung một nhƣợc điểm là tốn thời gian và gây phá hủy mẫu. Mặt khác, quá trình và mức độ biến đổi màu là khác nhau với từng mẫu rễ. Đa số các loài thuộc chi Gigaspora và Scutellospora biến đổi màu rất mạnh với Tryphan blue mà không phụ thuộc vào loài cây chủ theo Morton (1988) [38]. Nhƣng có loài chỉ biến màu trung gian với Tryphan blue nhƣ Acaulospora trapei [18]. Thậm chí, một số loài của chi Glomus (G.leptoticum, G.maculosum…) hoặc loài Acaulospora myriocarpa lại không biến màu với Tryphan blue [38]. Mức độ chặt chẽ của mối quan hệ giữa thực vật và AMF đƣợc thể hiện thông qua số lƣợng bào tử có trong đất. Tuy nhiên, việc xác định số lƣợng bào tử đôi khi gặp nhiều khó khăn. Để giải quyết vấn đề đó, ngƣời ta thƣờng dùng một chỉ số trung gian là “hệ số xâm nhiễm”. Phƣơng pháp đơn giản là cắt hệ thống rễ thành những mẩu nhỏ và xác định tỷ lệ Mycorrhiza. Tuy nhiên, phƣơng pháp này không hiệu quả khi tỷ lệ Mycorrhiza lớn. Năm 1975, dựa trên cơ sở phƣơng pháp đƣờng chéo của nhóm tác giả Newman, Sparling và Tinker lần đầu tiên áp dụng với AMF, sau đó đƣợc dùng để so sánh với các phƣơng pháp xác định khác. Hiện nay, phƣơng pháp này rất thông dụng [52]. 10 1.5. SỰ PHÁT TÁN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA AMF ĐỐI VỚI THỰC VẬT CHỦ Năm 1991, tác giả Friese và Koske cho rằng tất cả bào tử của AMF đều phán tán một cách thụ động với những nhân tố tích cực là gió và động vật [29]. Nhƣng theo MacMahon và Warner thì những vùng khô hạn, gió là nhân tố quan trọng nhất tạo ra sự lây nhiễm tự nhiên của AMF [36]. Ngƣợc lại, với những nơi ẩm ƣớt, động vật lại là nhân tố đóng vai trò chủ yếu [29]. Năm 1983, Hayman cho rằng số lƣợng bào tử AMF trong đất là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá mức độ ƣu thế của loài. Trong đất canh tác, số lƣợng loài và số lƣợng bào tử nhiều hơn trong đất tự nhiên [34]. Mặt khác theo tác giả Friese thì AMF không dễ phát tán nên tầng đất canh tác là vị trí tốt nhất để xác định số lƣợng bào tử [29]. Đồng thời với những nghiên cứu về phân loại, tách bào tử, cấu trúc AMF thì ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh trƣởng của cây cũng đƣợc quan tâm từ rất sớm. Năm 1963, tác giả Gerdemann đã sử dụng đất không khử trùng nhƣ một cách lây nhiễm AMF và đã chứng minh đƣợc rằng cây trồng sẽ phát triển nhanh khi có mặt AMF [32]. Năm 1959, trong một báo cáo khoa học khác đã chỉ ra rằng, việc nhiễm AMF làm tăng sinh trƣởng của cây táo con từ chồi [40]. Cho đến năm 1968, Gerdemann tiến hành thí nghiệm trên cây ngô và yến mạch cũng cho kết quả tƣơng tự [30]. Nhƣ vậy, trong nhiều năm qua, những nghiên cứu về AMF chỉ tập trung vào vấn đề ảnh hƣởng của chúng đối với sinh trƣởng cây trồng mà không biết rằng giá trị AMF mang lại cho thực vật chủ còn lớn hơn nhiều. Năm 1968, bào tử nấm nội cộng sinh có thể sống cùng với thực vật trong chậu và đƣa ra phƣơng pháp nhân nuôi thì những nghiên cứu về AMF và ảnh hƣởng của chúng đối với thực vật mới đƣợc tiến hành sâu rộng trên nhiều lĩnh 11 vực nông lâm nghiệp [30, 41]. Các nhà khoa học đã chứng minh rằng: AMF không chỉ làm tăng khả năng sinh trƣởng, phát triển của cây trồng mà còn có thể làm tăng khả năng hấp thu khoáng (nhƣ phốtpho, đồng, kẽm…) trong đất; làm giảm mức độ “sốc” của cây khi đất bị nhiễm mặn, đất quá ẩm, nhiệt độ đất cao và nhiều nguyên nhân khác. Về khả năng bảo vệ cây chủ chống lại các tác nhân gây bệnh của AMF, Schonbeck và Dehne (1989) đã nghiên cứu trên 11 loại cây trồng phổ biến là đậu, lúa mạch, lúa mì, cà rốt, ngô, hành, thuốc lá, cà chua, dƣa chuột, rau diếp, hồ tiêu đã nhận thấy, chúng làm giảm 40% các bệnh ở rễ thƣờng gặp trên các loại cây chủ này [48]. Năm 2000, tác giả Ted cũng chỉ ra kết quả tƣơng tự khi nghiên cứu khả năng chống bệnh ở các cây nhiệt đới có AMF (giảm 30 – 45% các tác nhân gây bệnh) [54]. Năm 2002, bằng thực nghiệm, Bali và đtg, đã chứng minh hiệu quả của AMF đối với bệnh héo cây bông do nấm Fusarium gây ra. Đối với bệnh ở rễ gây ra bởi tuyến trùng, AMF có thể cải thiện sức sống của cây chủ, từ đó hạn chế những thiệt hại về sản lƣợng, đặc biệt với những vùng đất có hàm lƣợng P2O5 thấp và cây đƣợc nhiễm AMF trƣớc khi bị nhiễm tuyến trùng. Nhƣ vậy, AMF có thể làm giảm nguồn bệnh hoặc giảm ảnh hƣởng của bệnh ở rễ có nguyên nhân do nấm và tuyến trùng gây ra. Tuy nhiên, tác dụng của AMF không thể hiện rõ đối với bệnh ở lá và bệnh do virus [20]. Khi nghiên cứu số lƣợng AMF trong đất, Schuybert và đtg đã nhận thấy rằng: Ở các loại đất khác nhau, số lƣợng bào tử AMF là khác nhau [50]. Năm 1989 tác giả Schonbeck đã phân lập đƣợc 15 loài thuộc 3 chi khác nhau là: Glomus, Sclerocystis, Acaulospora trong đất vùng rễ của cây nho và 7 loài thuộc chi Glomus trong đất vùng rễ của cây táo [48]. Trong đất trồng trọt thƣờng xuyên (đất trồng lúa nƣớc, đậu, lúa mỳ và nhiều loại cây trồng khác) luôn có số lƣợng bào tử AMF cao hơn nhƣng thành phần loài của AMF lại thấp hơn so với trong đất tự nhiên. Năm 1989 Schonbeck và Dehne nghiên cứu về 12 mối quan hệ giữa AMF với các vi sinh vật vùng rễ, cho thấy sự có mặt AMF đã làm tăng đáng kể lƣợng vi khuẩn tổng số (đặc biệt là nhóm Pseudomonas) [48]. Khi nhiễm 3 loài Gigaspora margarita, Glomus macrocarpum và Glomus caledonium cho cây dâu tây, đã làm tăng đáng kể sinh khối và hàm lƣợng phốtpho trong cây, trong đó, Gigaspora margarita có hiệu quả kích thích mạnh hơn 2 loài còn lại. Năm 1982, Dehne cũng phát hiện tác dụng kích thích sinh trƣởng của AMF trên cây hành và cây ngô [26]. Đến năm 1989, nghiên cứu khác còn phát hiện thêm bên cạnh khả năng tăng sinh khối, tăng tỷ lệ thân/rễ thì việc nhiễm AMF còn làm tăng hoạt động của enzyme nitrogenase và tăng mức độ đồng hoá phốtpho của các cây họ đậu [59]. Ngoài ra, Sung và đtg còn chứng minh đƣợc rằng: Thông qua hoạt động trao đổi chất của mình, AMF có ảnh hƣởng đến Pyrophotphat (PPi) trong cây chủ, điều này cho thấy tác dụng rất lớn của AMF đối với toàn bộ quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây chủ [48]. Năm 2004, Trần Văn Mão đã nghiên cứu hiệu quả của nấm VA – Mycorrhiza chủ yếu là nấm Glomus, về khả năng hấp thu dinh dƣỡng P. Hàm lƣợng P trong tế bào rễ cây bắp có sự cộng sinh của nấm VA-Mycorrhiza tăng 35% đối với các loài nấm Glomus mosseae và 98% đối với loài nấm Glomus fasciculatum. Hàm lƣợng P đƣợc tích luỹ trong rễ bắp ở dạng hỗn hợp phân tử P hữu cơ và acid hoà tan. Hàng ngày P đƣợc di chuyển đến các bộ phận của cây bắp theo phƣơng pháp động lực học, và phụ thuộc vào từng giai đoạn sinh trƣởng của cây [7]. Nhƣ vậy, các kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của AMF đối với sự sinh trƣởng và phát triển của các loại cây trồng khác nhau cho thấy chúng đều có tác dụng tăng sinh khối, tăng quá trình trao đổi chất và thu nhận chất dinh dƣỡng, tăng hoạt động của các enzyme. Tóm lại vai trò cộng sinh của Mycorrhiza đối với sự sinh trƣởng, phát triển của cây trồng đƣợc khái quát nhƣ sau [52]: 13 * Khả năng huy động nƣớc và các chất dinh dƣỡng: Hệ sợi nấm cộng sinh xung quanh vùng rễ làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc, tăng khả năng hút nƣớc và các chất dinh dƣỡng. Đối với các chất dinh dƣỡng kém di động (nhƣ ion phốtphat, đồng, kẽm…), cây trồng hút các ion này nhanh hơn khả năng khuếch tán của chúng trong dung dịch đất nên thƣờng hình thành vùng hẹp cạn kiệt xung quanh rễ. Khi đó, hệ sợi nấm nhanh chóng dài ra, vƣợt qua vùng cạn kiệt để đến với nơi có đủ phốtpho dễ tiêu. Do có đƣờng kính nhỏ hơn so với lông hút của rễ, sợi nấm có thể len lỏi khắp nơi trong đất, kể cả các lỗ hổng rất nhỏ mà rễ không qua đƣợc để hút dinh dƣỡng cung cấp cho cây. Đối với phốtpho bị cố định chặt, sợi nấm cộng sinh sẽ tiếp cận và tiết ra các axít hữu cơ qua phản ứng của anion hữu cơ phân tử nhỏ (nhƣ oxalate…) để sau đó có thể đổi chỗ cho phốtpho (bị hút chặt bề mặt bởi hydroxide kim loại) bằng phản ứng trao đổi, hoà tan oxide kim loại, tạo phức kim loại trong dung dịch, do vậy ngăn chặn đƣợc sự kết tủa của phốtphát kim loại. Nấm cộng sinh Mycorrhiza còn giải phóng phốtpho vô cơ thông qua khoáng hoá chất hữu cơ (thuỷ phân hợp chất ester phốtphát hữu cơ). Các hình thức cộng sinh Ericoid Mycorrizha và Ectomycorrizha còn có vai trò quan trọng trong việc khoáng hoá nitơ. Chỉ cần một lƣợng nhỏ AMF có thể huy động dinh dƣỡng từ khối lƣợng lớn xác thực vật có tỷ lệ C/N cao (hàm lƣợng lignin và tannin cao). * Dòng chảy cacbon trong cây cộng sinh Mycorrhiza: Dòng cacbon có thể chỉ theo một chiều cƣỡng bức từ cây xuống AMF hoặc cũng có thể theo chiều thoả thuận do AMF tự phân giải hợp chất giàu cacbon ở đất. Dòng chảy cacbon từ cây xuống đất không làm cây trồng thiếu hụt cacbon vì khi AMF xâm nhiễm vào rễ cây sẽ kích thích quá trình quang hợp mạnh hơn gấp bội (trừ trƣờng hợp ánh sáng quá yếu). Trong hệ sinh thái, dòng chảy cacbon xuống nấm và đất có một số vai trò quan trọng sau: - Sợi AMF sản sinh ra các enzyme thủy phân (nhƣ protease, phosphatase…) có vai trò quan trọng trong quá trình khoáng hoá chất hữu cơ và huy động chất dinh dƣỡng cho cây trồng. 14 - Sợi nấm kéo dài làm tăng liên kết với các hạt đất, cải thiện cấu tƣợng đất, thông thƣờng có đến 1 – 20 m sợi nấm/gam đất. - Tạo nên cộng đồng vi sinh vật vùng rễ. Đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá độ phì nhiêu của đất. * Tăng khả năng chống chịu hạn: trong môi trƣờng đất khô nấm rễ giúp cây hấp thu nƣớc bằng cách tăng cƣờng tốc độ thoát hơi nƣớc so với những cây không có nấm rễ cộng sinh. Allerm cho rằng tác dụng của nấm trong vùng khô hạn biểu hiện chủ yếu là làm tăng tính chịu hạn của cây và tăng nhanh tốc độ truyền nƣớc trong cây. Năm 1982, Berea và đtg lại cho rằng tác dụng của nấm rễ là cải thiện kết cấu đất và nâng cao lƣợng nƣớc trong đất từ đó làm tăng khả năng hấp thu nƣớc cho cây [21]. * Giúp cây chống chịu với bệnh hại: nấm cộng sinh ở rễ cây có tác dụng bảo vệ cây chống lại một số vi sinh vật gây bệnh nhƣ Phytophthora infestans (một loài tảo tƣơng tự nấm). Do Phytophthora infestans không thể xâm nhập qua hệ sợi nấm để lọt vào rễ [10]. - Ngăn chặn cơ học sự xâm nhập của nguồn bệnh bằng cấu trúc sợi nấm đan xen trong rễ cây. - Sản sinh các hợp chất kháng sinh (antibiotic). - Cạnh tranh dinh dƣỡng với vi sinh vật gây bệnh, góp phần làm tăng sức đề kháng cho cây chủ. 1.6. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AMF TRÊN THẾ GIỚI BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về nấm Mycohriza ở mức độ phân tử nhƣ RFLP, RAPD khuyếch đại trên nhiều vùng khác nhau của nấm đƣợc thống kê theo bảng 1.2. Tuy nhiên việc phân loại bào tử bằng sinh học phân tử vẫn còn nhiều hạn chế do khả năng thu nhận DNA tổng số từ bào còn thấp. 15 Bảng 1.2. Kết quả nghiên cứu AMF bằng sinh học phân tử [45] Vùng gen SSU rDNA Genomic DNA Kỹ thuật sinh học phân tử Đoạn mồi VANS1 PCR PCR– RADP Tế bào đích Tài liệu tham khảo Glomales 109 Glomusversiforme OPA-02 và OPA-04 Gl. mosseae . Gl. Caledoniu OPA-18 và P124 Acaulosporalaevis Gigasporamargarita OPA-18 và P124 Scutellospora gregaria 39 SSU rDNA PCR VANS1 và NS21 G. intraradices 83 Genomic DNA Competitive PCR PO và M3 G. Mosseae 46 ITS PCR–RFLP ITS1 và ITS4 Glomus sp., Scutellospora sp. 41 SSU 1492¢ PCR NS71 và SSU1492¢ Gigaspora sp. 75 SS38 và VANS1 Rễ và bảo tử của AM, VANS1 Scutellospora và Glomus VAGIGA Gigasporaceae Partial rDNA PCRpartial 30 ITS1 and ITS2 PCR ITS1 và ITS2 G. margarita 32 ITS PCR ITS1 và ITS4 G.mosseae và Gigaspora margarita 29 LR1 và FLR2 Dƣới nhóm của Glomales FLR2-5.23 và FLR2-8.23 G. mosseae, G. intraradices SSU rDNA PCR-RFLP PCRnested 45 G. roseae LR1-23.46 28S rDNA PCR–SSCPs LSU-Primers Glomus sp. 82 SSU rDNA PCR NS31 và AM1 Glomus sp. 4 16 Dƣới nhóm của Glomales SSU rDNA PCR–SSCP VANS1 Nested-PCR ITS, AM1 ITS PCR–RFLP ITS1 và ITS4 G. mosseae ITS Nested PCR– SSCP Eukaryotic universal primer Glomus sp. ITS Nested-PCR ITS 5 và ITS4 PCR SSU-Glom/LSUGlom 1 ITS ITS5 và ITS4 Glomus-specific ITS primer 60 74 110 Glomeromycota (except Archaeosporaceae) 44 Các nhóm chính với Glomeromycota 44 1.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở VIỆT NAM Ở Việt Nam, Mycorrhiza đƣợc nghiên cứu từ những năm 60 của thế kỷ XX nhƣng đến nay mới đạt đƣợc một số kết quả nghiên cứu về nấm ngoại cộng sinh, hầu nhƣ chƣa có thành tựu trên nấm nội cộng sinh, đặc biệt là với cây cam. Nghiên cứu đầu tiên về nấm cộng sinh trong lâm nghiệp là việc sử dụng lớp đất tầng mặt của rừng thông để gieo ƣơm cây con - đây có thể đƣợc coi nhƣ một hình thức nhiễm nấm tự nhiên của Lâm Công Định và đã đƣợc sử dụng nhƣ một biệp pháp lâm sinh trong một thời gian khá dài [2]. Sau đó là các kết quả nghiên cứu của Nguyễn Sỹ Giao (1976) về sự có mặt của nấm ngoại cộng sinh ở rễ cây thông. Nghiên cứu sử dụng nấm cộng sinh thuần chủng để tạo rễ nấm cho cây thông con, kết quả cho thấy sự vƣợt trội về chiều cao và đƣờng kính của những cây đƣợc nhiễm nấm so với công thức đối chứng là 20 – 30% [1]. Bên cạnh đó, Nguyễn Sỹ Giao và Nguyễn Thị Nhâm (1980) còn nghiên cứu sử dụng nấm nội cộng sinh để phòng bệnh vàng còi ở thông con và cũng đã đạt đƣợc những kết quả nhất định [3]. Từ năm 1970 – 1980, Viện Nghiên cứu lâm nghiệp (nay là Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam) đã tiến hành phân lập và nuôi cấy thuần chủng 17 nấm cộng sinh [3]. Một vài thí nghiệm đã đƣợc tiến hành trên đất cằn với cây chủ là một số loài thông nhập nội. Tuy nhiên, những thí nghiệm này sau đó phải dừng lại vì nhiều lý do. Những nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh trong lĩnh vực lâm nghiệp trong giai đoạn tiếp theo bị ngƣng trệ [15,16]. Năm 1998, Phạm Quang Thu và đtg tiếp tục nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, kết quả là xác định đƣợc 37 loài nấm (thuộc 9 họ và 7 bộ) cộng sinh với 3 loài thực vật (thông nhựa Pinus merkussi, thông đuôi ngựa Pinus massoniana và thông caribe Pinus caribaea). Công trình này đƣợc coi nhƣ sự khởi đầu lại cho những nghiên cứu về nấm cộng sinh với thực vật, đặc biệt trên đối tƣợng cây lâm nghiệp. Kết quả không chỉ dừng lại ở việc xác định thành phần loài nấm mà còn đi sâu hơn trong việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm nấm cộng sinh, ứng dụng rộng rãi trong gieo ƣơm cây con ở keo và bạch đàn. Đây là một mốc quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng nấm cộng sinh vì đã chủ động đƣợc nguồn nấm lây nhiễm thông qua các chế phẩm sinh học. Giá trị của nghiên cứu này còn đƣợc thể hiện trong thực tiễn sản xuất tại tỉnh Vĩnh Phúc, sử dụng chế phẩm nấm cộng sinh đã cải thiện đáng kể tình hình sinh trƣởng của cây trồng ở nhiều vùng đất đồi [14]. Đối với AMF với cây dƣợc liệu, nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đƣợc cũng chỉ dừng lại ở thu thập mẫu bào tử nấm cộng sinh [5]. Một điều đáng mừng cho khoa học Việt Nam về nấm cộng sinh nói chung và AMF nói riêng tại Hội thảo về nấm cộng sinh đầu tiên của Việt Nam đã đƣợc tổ chức tại Viện Thổ nhƣỡng nông hoá vào năm 2004 với sự góp mặt của các nhà nghiên cứu cơ bản thuộc Đại học Quốc gia Hà Nội và các ngành nông nghiệp, lâm nghiệp, dƣợc học... Tuy các tham luận tại Hội thảo này còn mang tính lý luận, ít đề cập đến các kết quả nghiên cứu nhƣng nấm nội cộng sinh đã đƣợc chú ý nhƣ một nội dung chính của Hội thảo, một số nhà khoa học còn đề xuất định hƣớng nghiên cứu AMF trong những năm tiếp theo. 18 Năm 2005, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Văn Sức và đtg [12], khi tiến hành nghiên cứu “Nấm rễ nội cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza Fungi) và quần thể vi sinh vật trong đất trồng bƣởi đặc sản Đoan Hùng, Phú Thọ” đã phát hiện sự có mặt của AMF trong tất cả các mẫu thu thập đƣợc nhƣng tỷ lệ xâm nhiễm thấp chỉ đạt mức 3/5 [33], khả năng nảy mầm của các bào tử nấm rễ bƣởi thấp (chỉ đạt 16%). Trong một nghiên cứu khác, các tác giả đã sử dụng 3 loại cây ký chủ (ngô, cao lƣơng, lúa mạch) và 3 chủng AMF để nhân bào tử rồi đƣa ra kết luận: Khi nhân bào tử nhờ cây ký chủ, mỗi loài cây ký chủ thích hợp cho một chủng nấm, riêng cao lƣơng không thích hợp dùng làm cây ký chủ để nhân nhanh bào tử AMF, thời gian thu bào tử tốt nhất là 25 – 40 ngày sau khi cây ký chủ mọc [13]. Các kết quả nghiên cứu gần đây của Nguyễn Thị Minh (2005, 2007) trên cây họ đậu cũng cho một số kết quả khả quan ban đầu [8, 9]. Cùng năm 2007, Nguyễn Hoàng Yến công bố công trình nghiên cứu đầu tiên về phân bố của AMF trong cây họ Sao dầu ở Đồng Nai [17]. Tuy có nhiều tài liệu đề cập đến vai trò của nấm cộng sinh AMF nhƣng chƣa có nghiên cứu về vai trò của nấm cộng sinh đối với cây cam cũng nhƣ ảnh hƣởng của các biện pháp kỹ thuật canh tác, dinh dƣỡng đất đến nấm cộng sinh trên cây cam.Các nghiên cứu sâu rộng về AMF ở mức độ sinh học phân tử, bằng các phƣơng pháp nhƣ RFLP, RAPD chƣa đƣợc tiến hành hoặc chƣa đƣợc công bố. Tóm lại, mối quan hệ cộng sinh nấm rễ – thực vật ít đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng ở Việt Nam, đặc biệt chƣa có công trình khoa học nào nghiên cứu về AMF ở cây cam. Bởi vậy đề tài: “Nghiên cứu hệ nấm cộng sinh (Arbuscular Mycorrhiza) trong đất trồng cam ở Quỳ Hợp – Nghệ An” đƣợc thực hiện nhằm góp phần thiết thực vào hƣớng nghiên cứu mới: Ứng dụng AMF để nâng cao năng suất cây cam nói riêng và cây trồng nông – lâm nghiệp nói chung trên cơ sở bảo vệ môi trƣờng sinh thái theo hƣớng phát triển bền vững trong thế kỉ XXI. 19