Tài liệu Nghiên cứu khả năng nhân giống cây nhân sâm (panax ginseng c.a. meyer) bằng phương pháp in vitro

c ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ LIÊN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY NHÂN SÂM (Panax ginseng C.A. Meyer) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Thái Nguyên, năm 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM DƯƠNG THỊ LIÊN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG NHÂN GIỐNG CÂY NHÂN SÂM (Panax ginseng C.A. Meyer) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH - CNTP - Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Thái Nguyên, năm 2014 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm em đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) bằng phương pháp in vitro”. Qua thời gian làm việc tại phòng nuôi cấy mô Khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm đến nay em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm Khoa cùng các thầy cô giáo trong bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: ThS. Nguyễn Thị Tình đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện cả về vật chất và tinh thần để em có thể hoàn thành đề tài này. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên đề tài không tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 05 tháng 06 năm 2014 Sinh viên thực hiện Dương Thị Liên DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 4.1: Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 7 ngày nuôi cấy) ........................................... 26 Bảng 4.2: Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 20 ngày nuôi cấy) .................................................................................................. 29 Bảng 4.3: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 30 ngày nuôi cấy) .... 32 Bảng 4.4: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 30 ngày nuôi cấy) ................................................................................................................. 35 Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với các nồng độ IBA, NAA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 30 ngày nuôi cấy)............................. 38 Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................................................................................. 41 Bảng 4.7: Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 30 ngày nuôi cấy) ......................................................................................... 44 Bảng 4.8: Kết quả ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau 30 ngày theo dõi) ... 49 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật ...... 9 Hình 4.1: Biểu đồ kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) (sau 7 ngày nuôi cấy)............................... 27 Hình 4.2.a: Tỷ lệ tái sinh chồi Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) trên môi trường MS, B5, WPM (sau 20 ngày nuôi cấy) ................................ 29 Hình 4.2.b: Chồi Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) sau 20 ngày nuôi cấy trên môi trường MS, B5, WPM ........................................................ 30 Hình 4.3.a: Hệ số nhân chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung nồng độ BA khác nhau ....... 32 Hình 4.3.b: Chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) trên môi trường bổ sung BA (sau 30 ngày nuôi cấy) ở các nồng độ khác nhau ............... 33 Hình 4.4.a: Hệ số nhân chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) sau 30 ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung Kinetin ................................ 35 Hình 4.4.b: Chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) được nuôi cấy ở các nồng độ Kinetin khác nhau sau 30 ngày ........................................... 36 Hình 4.5.a: Hệ số nhân chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) trên môi trường bổ sung BA (0,5mg/l) kết hợp với nồng độ IBA, NAA và IAA (sau 30 ngày nuôi cấy) .................................................................... 39 Hình 4.5.b: Chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng CA. Meyer) trên môi trường kết hợp BA (0,5mg/l) với các nồng độ IBA, NAA và IAA sau 30 ngày nuôi cấy ................................................................................................... 39 Hình 4.6.a: Hệ số nhân chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) trên môi trường bổ sung hàm lượng nước dừa (sau 30 ngày nuôi cấy) ......... 42 Hình 4.6.b: Chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) trên môi trường bổ sung hàm lượng nước dừa khác nhau (sau 30 ngày nuôi cấy) ........... 42 Hình 4.7.a: Số rễ trung bình tạo thành từ chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) sau 30 ngày nuôi cấy khi môi trường bổ sung NAA và than hoạt tính ................................................................................................... 45 Hình 4.7.b: Chất lượng rễ tạo thành từ chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) khi bổ sung NAA và than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy sau 30 ngày ....................................................................................... 46 Hình 4.8.a: Kết quả ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm (sau 30 ngày theo dõi) ... 49 Hình 4.8.b: Cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) sau 30 ngày trồng trên các giá thể khác nhau ....................................................................... 50 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin HCl B3 : Nicotinic acid B5 : Gamborg’s B6 : Pyridoxine HCl BA : 6-Benzyladenin CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IAA : Indol-3- axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphthalene axetic acid CT : Công thức WPM : Woody Plant Medium IBA : Indol-3- butyric acid THT : Than hoạt tính Cồn : C2H5OH HSN : Hệ số nhân TLMSKN : Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm Số rễ TB/cây : Số rễ trung bình/cây MỤC LỤC Trang PHẦN 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................... 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài ................................................................... 2 1.2.1. Mục đích của đề tài .................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu của đề tài .................................................................................... 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .................................................... 2 1.3.1. Ý nghĩa khoa học ..................................................................................... 2 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn ...................................................................................... 2 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 2.1. Giới thiệu về cây Nhân Sâm ....................................................................... 3 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố cây Nhân Sâm .................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái của cây Nhân Sâm .................................................... 4 2.1.3. Đặc điểm thích nghi ................................................................................. 5 2.1.4. Thành phần hóa học ................................................................................. 5 2.1.5. Công dụng của Nhân Sâm ........................................................................ 5 2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 8 2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................... 8 2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật..................................... 8 2.3. Các giai đoạn trong nhân giống in vitro...................................................... 9 2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật ..................... 10 2.4.1. Auxin ...................................................................................................... 10 2.4.2. Cytokinin ................................................................................................ 11 2.5. Tình hình nghiên cứu cây Nhân Sâm trên thế giới và trong nước ............ 12 2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ......................................................... 12 2.5.2. Tình hình nghiên cứu trong nước........................................................... 13 PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................. 16 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................. 16 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................ 16 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu ............................................. 16 3.3. Hóa chất và thiết bị sử dụng ...................................................................... 16 3.3.1. Hóa chất.................................................................................................. 16 3.3.2. Thiết bị ................................................................................................... 17 3.4. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ...................................................... 17 3.4.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................. 17 3.4.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung ........................................................ 18 PHẦN 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................. 26 4.1. Kết quả ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ...................................................................................................... 26 4.2. Kết quả ảnh hưởng của môi trường MS, B5 và WPM đến khả năng tái sinh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ........................... 28 4.3. Kết quả ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và nước dừa tới khả năng nhân nhanh của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) 30 4.3.1. Kết quả ảnh hưởng nồng độ BA và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ................................... 31 4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA (0,5mg/l) kết hợp với các nồng độ IBA, NAA và IAA đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ................................................................................ 37 4.3.3. Kết quả ảnh hưởng của hàm lượng nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ................................... 41 4.4. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ........................ 43 4.5. Kết quả ảnh hưởng của một số loại giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm ......................................................... 48 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 52 5.1. Kết luận ..................................................................................................... 52 5.2. Kiến nghị ................................................................................................... 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 52 1 PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Nhân Sâm có tên khoa học Panax ginseng C.A. Meyer là một loại dược thảo quý hiếm, trong Nhân Sâm có chứa hàm lượng saponin triterpen khá cao, đặc biệt là nhóm dammaran với các hợp chất saponin mà đại diện chính là ginsenosides Rb1, Rb2, Rh2, Rg1, Rg3 [48]. Nhân Sâm có vai trò quan trọng cung cấp nguyên liệu cho các ngành dược liệu, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng... Theo các nghiên cứu khoa học, ngoài tác dụng bổ dưỡng Nhân Sâm còn nhiều tác dụng đáng ghi nhận như: ngăn chặn quá trình lão hóa, kích thích hoạt động của bộ não, tăng cường chức năng hệ thống miễn dịch, chống oxy hóa, chống stress, chống viêm, kháng khuẩn, chống khối u [27], [41], giảm lượng glucose - kích thích tiết insulin và tế bào B [42], chống trầm cảm, bảo vệ gan, giảm cholesterol và lipit máu, điều hòa tim mạch [6]... Chính vì vậy, Nhân Sâm đang được dùng khá phổ biến. Tuy nhiên, Nhân Sâm có thời gian sinh trưởng dài, phạm vi phân bố hẹp và đang bị khai thác quá mức. Phương pháp nhân giống truyền thống bằng hạt, đầu mầm thân rễ hiệu quả không cao, tỷ lệ nảy mầm của hạt kém, thường xảy ra biến dị gây khó khăn cho việc phát triển diện tích trồng trọt, không đáp ứng đủ nhu cầu sử dụng trên thị trường [5], [11]. Ngoài ra, việc điều khiển các loại dịch bệnh, sự kháng các loại thuốc trừ sâu cũng là một vấn đề nghiêm trọng [18]. Do đó, phương pháp nuôi cấy mô tế bào là phương pháp hiệu quả để nhân giống, sản xuất số lượng lớn cây giống mà vẫn đảm bảo chất lượng cây giống sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, đồng thời khắc phục được nhược điểm của phương pháp nhân giống truyền thống [23]. Nhận thức được vấn đề bảo tồn và phát triển loài dược liệu quý này nên tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) bằng phương pháp in vitro”. 2 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 1.2.1. Mục đích của đề tài Nghiên cứu khả năng nhân giống cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) bằng phương pháp in vitro. 1.2.2. Yêu cầu của đề tài - Xác định được ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến khả năng tạo vật liệu sạch nấm và vi khuẩn từ đoạn thân cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). - Xác định được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy (MS, B5, WPM) đến khả năng tái sinh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). - Xác định được ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng và nước dừa đến khả năng nhân nhanh chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). - Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến khả năng sinh trưởng và phát triển của cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) ở giai đoạn sau nuôi cấy mô ở ngoài vườn ươm. 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. Ý nghĩa khoa học - Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ đưa ra được kỹ thuật nhân giống cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer) bằng phương pháp in vitro. Đánh giá được tác động của một số chất kích thích sinh trưởng trong nhân giống cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). - Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo cho công tác nghiên cứu và sản xuất cây Nhân Sâm (Panax ginseng C.A. Meyer). 1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp số lượng lớn cây giống có chất lượng cao, đồng đều cho sản xuất. - Bảo tồn được loại dược liệu quý. 3 PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Nhân Sâm 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại và phân bố cây Nhân Sâm 2.1.1.1. Nguồn gốc cây Nhân Sâm Tên khoa học: Panax ginseng C.A. Meyer Tên khác: Đường Sâm, Hồng Sâm, Bạch Sâm, Sâm Cao Ly, Sâm Triều Tiên, Viên Sâm. Nhân Sâm (Radix gensing hay Radix gensing sylvestris) là rễ chế biến rồi phơi hay sấy khô của cây Nhân Sâm trồng hoặc mọc hoang (Panax ginseng C.A. Meyer) [1]. 2.1.1.2. Phân loại khoa học [47] Giới (Regnum) : Plantae Ngành (Phylum) : Magnoliophyta Lớp (Class) : Magnoliopsida Bộ (Ordo) : Araliales Họ (Family) : Araliaceae Chi (Genus) : Panax Loài (Species) : Ginseng Họ Nhân Sâm (Araliaceae) trong hệ thực vật nước ta ước có khoảng 141 loài và 17 thứ thuộc 19 chi. Trong đó, có tới 63 loài và 12 thứ là đặc hữu [14]. Sách đỏ Việt Nam (2007) đã ghi nhận có 7 loài, trong đó có 2 loài thuộc chi Sâm (Panax) đã bị đe dọa ở mức độ rất nguy cấp, 2 loài thuộc các chi Ngũ gia bì (Acanthopanax), 1 loài trong chi Sâm (Panax), 1 loài thuộc chi Thông thảo (Tetrapanax) ở mức độ nguy cấp và 1 loài thuộc chi Thù du ngũ gia bì (Evodiopanax) ở mức độ sẽ nguy cấp [3]. 4 2.1.1.3. Phân loại Nhân Sâm Căn cứ vào cách chế biến có thể chia làm 2 loại chính: + Hồng Sâm: củ được cho vào hấp sau khi thu hoạch sau đó sấy khô + Bạch Sâm: củ sau khi thu hoạch đem phơi khô dưới ánh nắng mặt trời [44]. 2.1.1.4. Phân bố Chi Panax L. có khoảng hơn 10 loài trên thế giới, phân bố ở vùng ôn đới Bắc bán cầu. Trong đó, Nhân Sâm là loại cây thuốc nổi tiếng trong nền y học phương Đông từ thời thượng cổ đến nay [1]. Cây Nhân Sâm mọc hoang và được trồng chủ yếu ở Trung Quốc, Triều Tiên, vùng Viễn Đông của Liên Xô cũ, còn được trồng ở Nhật Bản, Mỹ nhưng nổi tiếng vẫn là ở Triều Tiên và Trung Quốc [1], [12]. Tại Triều Tiên, Khai Thành là nơi trồng nhiều Nhân Sâm nhất, đã có trên 200 năm kinh nghiệm [12]. 2.1.2. Đặc điểm hình thái của cây Nhân Sâm Nhân Sâm là một cây thân thảo, sống lâu năm. Rễ phình thành củ thuôn dài, màu vàng nâu, phân nhánh ở quãng giữa như hình người chính vì vậy nên được gọi là Nhân Sâm. Thân mảnh, hình thoi hoặc gần như hình trụ, mọc đứng, không phân nhánh. Cuống lá dài. Lá kép chân vịt, mọc vòng, gồm 5 lá chét, 3 lá tận cùng lớn hơn các lá bên, hình elip hoặc bầu dục, dài 4 - 15cm, rộng 2 - 6,5cm, gốc hình nôm, đầu hơi nhọn, mép lồi lõm hoặc hơi răng cưa [1]. Nếu cây Nhân Sâm mới được một năm thì cây chỉ có một lá với ba lá chét, nếu cây được hai năm cũng chỉ có một lá với 5 lá chét. Cây Nhân Sâm 3 năm có 2 lá kép, cây Nhân Sâm 4 năm có 3 lá kép, cây Nhân Sâm 5 năm trở lên có 4 - 5 lá kép, tất cả đều có 5 lá chét (đặc biệt có thể có 6 lá chét) hình trứng, mép lá chét có răng cưa sâu [12]. Cụm hoa mọc ở ngọn thân tán thành hình bán cầu, hoa tạp tính, màu hồng, có cuống mảnh, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu hạ 2 núm [1]. Qủa mọng hơi dẹt, nhỏ, khi chín màu đỏ, quả ra hàng năm đối với cây Nhân Sâm 3 - 4 tuổi [1]. Mỗi quả chứa 2 hạt, vỏ hạt cứng khó nảy mầm, thời 5 gian nảy mầm lâu, tỷ lệ nảy mầm đạt 47%. Hạt Nhân Sâm năm thứ 3 chưa tốt thường bấm bỏ đi đợi cây được 4 - 5 năm mới để ra quả và lấy hạt làm giống [12]. Bắt đầu từ năm thứ 3 trở đi cây mới cho hoa, kết quả. Mùa hoa: tháng 3 5, mùa quả: tháng 6 - 8 [1]. 2.1.3. Đặc điểm thích nghi Nhân Sâm phân bố ở vùng ôn đới, thường mọc tập trung ở các khu vực núi cao, ưa khí hậu ẩm mát và chịu đựng tốt điều kiện nhiệt độ thấp. Nhân Sâm là cây đặc biệt ưa bóng. Chính vì vậy, người ta phải trồng Nhân Sâm trong điều kiện vườn có mái che tới trên 80%. Để thích nghi với thời kỳ nhiệt độ thấp trong năm, toàn bộ phần trên mặt đất của cây bị tàn lụi qua mùa đông. Chồi ngủ ở đầu rễ củ hình thành ngay từ giữa mùa hè chỉ mọc lên khỏi mặt đất vào đầu mùa xuân năm sau [1]. 2.1.4. Thành phần hóa học Thành phần chính trong Nhân Sâm là các saponin triterpen. Khi thủy phân các saponin này ta thu được 3 loại sapogenin là axit oleanolic; 20 (s) protopanaxadiol và 20 (s) protopanaxatriol, hai loại sau có cấu trúc dammaran. Các saponin có trong Nhân Sâm gọi là ginsenosid được phân loại dựa vào cấu trúc của 3 loại sapogenin trên [1]. Protopanaxadiol bao gồm các ginsenosid Rb1, Rb2, Rc và Rd. Re, Rf, Rg1 và Rg2 thuộc nhóm protopanaxatriol. Ngoài ra, ở tất cả các bộ phận của cây còn chứa các hợp chất khác như acid amin, alkaloid, phenol, protein, polypeptid, vitamin B1 và B2 [44]. 2.1.5. Công dụng của Nhân Sâm 2.1.5.1. Tác dụng dược lý theo Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam [12] - Tác dụng trên hệ thần kinh Từ xưa ở Trung Quốc người ta đã nghiên cứu tác dụng giảm mệt trên người của Nhân Sâm. Trong các năm 1949 - 1951, Liên Xô cũ cũng tiến hành nghiên cứu tác dụng này trên chuột. Năm 1947, Lazarev nghiên cứu và kết luận, Nhân Sâm có tác dụng hưng phấn thần thần kinh trung ương, tăng hiệu suất công việc, giảm mệt tốt hơn thuốc phenamin. 6 Năm 1954, Drake đã chứng minh Nhân Sâm có tác dụng rút ngắn thời kỳ phản xạ tiềm phục của thần kinh. - Tác dụng trên huyết áp và tim Burkrat và Xakxopov (1947) và Kixelev (1948-1959) đã nghiên cứu tác dụng hạ huyết áp của Nhân Sâm. - Tác dụng trên hô hấp Năm 1947, Burkrat và Xakxopov tiêm dung dịch Nhân Sâm vào tĩnh mạch mèo thấy có tác dụng gây hưng phấn hô hấp. - Tác dụng đối với chuyển hóa cơ bản Năm 1922, tác giả Nhật Bản: Hà Bộ Thắng Mã và Nại Đằng Hệ Bình nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của Nhân Sâm. Năm 1954 và 1956, một số tác giả Trung Quốc cũng xác nhận trong Trung Hoa nội khoa tạp chí và Trung Hoa y học tạp chí tác dụng hạ đường huyết của Nhân Sâm. Năm 1955 trên lâm sàng người ta đã thấy rằng nếu dùng chung Nhân Sâm với insulin thì giảm bớt lượng insulin, thời gian hạ đường huyết kéo dài hơn và chữa được bệnh tiểu đường. - Tác dụng đối với sinh trưởng và phát dục của động vật: người ta thấy trọng lượng con vật tăng và thời gian giao cấu của con vật kéo dài. - Tác dụng chống đỡ bệnh tật Theo Daugolnikov (1950 - 1952), Brekhman và Phruentov (1954 1957) và Abramov (1953) Nhân Sâm có tác dụng tăng sức đề kháng của động vật với bệnh tật. 2.1.5.2. Tác dụng dược lý theo nghiên cứu hiện đại Năm 1992, Liu CX và Xiao PG đã nghiên cứu tác dụng của Nhân Sâm. Nhân Sâm kích thích hệ thần kinh trung ương, hệ tim mạch và hệ bài tiết, thúc đẩy chức năng của hệ miễn dịch và trao đổi chất, giảm stress và chống lão hóa… Các tác dụng này đã được chính thức thử nghiệm lâm sàng ở Trung Quốc [36]. 7 Năm 1992, Wei R và cs đã nghiên cứu ảnh hưởng của Nhân Sâm trong việc tăng cường trao đổi chất của tế bào cơ tim người trong ống nghiệm [46]. Năm 1999, Liu Z và cs đã nghiên cứu tác động của Radix gensing rubra đến cAMP trong vùng thiếu máu cục bộ cơ tim của chuột. Kết quả cho thấy Radix ginseng rubra có thể làm giảm mức độ cAMP trong vùng thiếu máu cục bộ của cơ tim [37] . Năm 2004, Trần Công Luận đã nghiên cứu thành công tác dụng chống stress và tăng lực từ 3 loài (Schfflera elliptica, Schfflera corymbiformis, Schfflera sp.3) thuộc họ Nhân Sâm [13]. Năm 2005, Jing-Tian Xie và cs đã nghiên cứu tác dụng ngăn chặn bệnh tiểu đường của Nhân Sâm [33]. Năm 2006, Ji Yeon Yu và cs đã chứng minh tác dụng của Sâm Triều Tiên trong việc chống sự tạo thành huyết khối và ngưng kết tiểu cầu [32]. Sâm Triều Tiên có tác dụng giải độc. Kim H.S và cs của Trường đại học Kangwon, Hàn Quốc đã chứng minh saponin trong Nhân Sâm ức chế morphin-6-dehydrogenase, enzyme xúc tác sự tổng hợp morphinon thành morphin và kích thích sản sinh glutathion trong gan để giải độc morphin. Ngoài ra, Nhân Sâm còn làm giảm sự nhờn thuốc, sự tăng cảm về tâm thần, hành vi và vận động gây bởi các thuốc hướng thần như methamphetamin, cocain và morphin [34]. Năm 2011, Dong H và cs đã nghiên cứu thành công cơ chế chống ung thư của ginsenosides và dẫn xuất của chúng trong ống nghiệm. Sử dụng các ginsenosides chiết xuất từ Nhân Sâm để đánh giá hiêu lực gây độc tế bào chống lại một loạt các tế bào ung thư [28]. Năm 2012, Hong YJ và cs đã chứng minh Hồng Sâm Triều Tiên (Panax ginseng) có tác dụng cải thiện bệnh tiểu đường type 1 và khôi phục các tế bào miễn dịch [31]. Năm 2012, Tao LL và cs đã nghiên cứu tác dụng của các chất chiết xuất từ Radix gensing, Radix notogensing và Rhizoma Chuanxiong trong ngăn chặn quá trình lão hóa của các tế bào cơ trơn mạch máu ở chuột già [43]. 8 Năm 2013, Yoo YC và cs đã nghiên cứu thành công tác dụng chống virus haemagglutinating gây nhiễm trùng chết người trên chuột ở Nhật Bản nhờ tác dụng của ginsenoside-Rb2 được chiết từ Nhân Sâm Đỏ Hàn Quốc [49]. 2.2. Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.1. Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật (Plant cell and tisue culture) là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng [9]. 2.2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2.2.1. Tính toàn năng di truyền của tế bào Nguyên lí cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng di truyền của tế bào. Mỗi tế bào của cơ thể sinh vật đều chứa đầy đủ vật chất thông tin di truyền của cơ thể sống. Khi tế bào đã chuyển sang giai đoạn biệt hóa, chỉ có một tỷ lệ rất nhỏ các gen trong bộ gen hoạt động phục vụ cho chức năng biệt hóa của tế bào, các gen khác ở trạng thái ngủ nhưng chúng hoàn toàn giữ nguyên hoạt tính, trong những điều kiện nhất định sẽ bộc lộ để từ một tế bào phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh [2]. 2.2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa Cơ thể sinh vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có chức năng khác nhau được hình thành từ nhiều loại tế bào. Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử). Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa). Sau đó, các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau [9]. Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm bảo các chức năng khác nhau. Quá trình phân hóa tế bào có thể biểu thị như sau: Tế bào phôi sinh → Tế bào dãn → Tế bào phân hoá có chức năng riêng biệt 9 Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên biệt, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ. Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngược với quá trình phân hóa tế bào [9]. Phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào chuyển hoá Phản phân hoá Hình 2.1: Sơ đồ quá trình phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật Về bản chất thì sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chế các gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hóa (mà vốn trước nay bị ức chế) để cho ta tính trạng mới, còn một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động. Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến cho quá trình sinh trưởng phát triển của cơ thể thực vật luôn được hài hòa. Mặt khác, khi tế bào nằm trong một khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách riêng từng tế bào hoặc giảm kích thước của khối mô sẽ tạo điều kiện cho sự hoạt hóa các gen của tế bào [7]. 2.3. Các giai đoạn trong nhân giống in vitro Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật gồm 5 giai đoạn sau: 2.3.1. Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy Là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo được nguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ và thời gian xử lý diệt khuẩn thích hợp [2]. 10 2.3.2. Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự phát triển của mô nuôi cấy. Qúa trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/cytokinin được đưa vào trong môi trường nuôi cấy và tuổi sinh lý của mẫu cấy [2]. 2.3.3. Giai đoạn 3: Nhân nhanh Là giai đoạn bao gồm nhiều lần cấy chuyền mô lên các môi trường nhân nhanh nhằm kích thích tạo cơ quan phụ hoặc cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là: phát triển chồi nách, tạo phôi vô tính, tạo đỉnh sinh trưởng mới [9]. Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số nhân cao nhất, là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân nhanh chồi, người ta thường đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết, nấm men… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp [2]. 2.3.4. Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được cấy chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Ở giai đoạn này, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [2]. 2.3.5 Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất Đây là giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ rễ, thân, lá) từ ống nghiệm ra đất, là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro trong thực tiễn sản xuất, đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn [2]. 2.4. Các chất điều hòa sinh trưởng nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.4.1. Auxin Là những hormone tăng trưởng thực vật được Robert Kooc khám phá đầu tiên. Một trong số các auxin đơn giản, phổ biến được tìm thấy nhiều ở 11 thực vật là indol - 3 - axetic acid (IAA). Thực tế những hợp chất khác có cấu trúc tương tự IAA, dẫn xuất hoặc tiền chất của IAA cũng có vai trò kích thích phát triển cây trồng theo cơ chế tương tự có tên chung auxin. Cụ thể, IAA là auxin tự nhiên có tác dụng kích thích sinh trưởng kéo dài tế bào và điều khiển sự hình thành rễ. Naphthalene axetic acid (NAA) và 2,4 - Diclophenoxy acid (2,4 - D) là dẫn xuất của IAA. Các chất này cũng đóng vai trò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ. NAA có tác dụng tăng hô hấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzyme và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường. NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA. NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ [25]. Trong cây auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang phát triển và vùng đỉnh chồi. Từ những vùng này auxin được chuyển xuống các phần phía dưới của cây [25]. 2.4.2. Cytokinin Là nhóm phytohormone được phát hiện năm 1963 bởi Letham và Miler, chúng là dẫn xuất của base Adenine. Việc phát hiện ra cytokinin gắn liền với kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trong các loại cytokinin thì 3 loại phổ biến nhất là: Kinetin (6-furfuryl-aminopurine), BA (6-Benzyladenin) và Zeatin tự nhiên [25]. Cytokinin tồn tại ở cả 2 dạng gồm dạng tự do (dạng hoạt tính) và dạng liên kết (dạng vận chuyển và dạng dự trữ). Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào [25]. Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên năm 1950 trong chiết xuất acid nucleic. Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine. BA là cytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn nhiều Kinetin. Kinetin và BA cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế sự già hoá của tế bào. Ngoài ra các chất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN, tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzyme. Cơ chế tác dụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương