Tài liệu Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ---------------------------- Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC Nguyễn Văn Bắc NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI KHUẨN LAO KHÁNG ĐA THUỐC BẰNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Nghiêm Ngọc Minh Hà Nội – 2010 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Lời cảm ơn! Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh, Trưởng phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học – người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thái Sơn Học viện Quân y cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ sinh học Môi trường, Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận. Qua đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh học và các thầy cô giáo trong bộ môn Sinh lý Thực vật và Hóa sinh, trường Đại học KHTN đã hướng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin dành cho những người thân trong gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc, những người thân yêu đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Văn Bắc Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Bp : Base pairs CNSH : Công nghê ê sinh học CTCLQG : Chương trình chống lao quốc gia DNA : Acit deoxyribonucleic dNTPs : Deoxyribonucleotide Triphosphate EDR : Extensively drug resitant (Kháng thuốc mở rô êng) EMB : Ethambutol. HRS : Ba loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin HRSE : Bốn loại thuốc isoniazid, rifampicin, streptomycin và ethambutol INH : Isoniazid IPTG : Isopropyl-thio-β-D-galactoside Kb : Kilo base LB : Luria - Bertani MDR : Multidrugs resistant (Kháng đa thuốc) PAS : Paraminosalicylic acid PAZ : Pyrazinamid PCR : Polymerase Chain Reaction RMP : Rifampicin RNA : Acid Ribonucleic RRDR : Rifampin resistance determining region (Vùng quyết định kháng rifampicin) Taq polymerase : Thermus aquaticus DNA polymerase TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới V : Volume (thể tích) X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỤC LỤC MỞ ĐẦU...........................................................................................................................1 Chương 1 – TỔNG QUAN..............................................................................................3 1.1. BỆNH LAO............................................................................................................3 1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC....................................................................3 1.3. VI KHUẨN LAO....................................................................................................5 1.3.1. Cấu tạo............................................................................................................5 1.3.2. Cơ chế gây bệnh.............................................................................................8 1.3.3. Đặc điểm hệ gen..............................................................................................9 1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO.................................................9 1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao........................................................................9 1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc...................................................................10 1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng........................................................................12 1.4.4. Isoniazid và cơ chế kháng...........................................................................15 1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN LAO KHÁNG THUỐC........................16 1.5.1. Đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm cận lâm sàng................................16 1.5.2. Xác định kiểu hình.......................................................................................18 1.5.3. Xác định kiểu gen.........................................................................................18 1.5.4. Kỹ thuật real-time PCR và multiplex real-time PCR..............................19 Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................23 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU..................................................................................23 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu..................................................................................23 2.1.2. Vâ ât liê âu thiết bị và dụng cụ nghiên cứu.....................................................23 2.1.3. Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu..........................................................24 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................................25 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu..........................................................................................25 2.2.2. PCR nhân đoạn gen đích.............................................................................26 2.2.3. Tạo dòng gen.................................................................................................27 2.2.4. Multiplex real-time PCR.............................................................................28 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................30 3.1. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ................................................30 3.1.1. Kết quả nhân gen katG và rpoB từ DNA tách từ vi khuẩn lao...............30 3.1.2. Kết quả tách dòng gen.................................................................................31 3.1.3. Kết quả phân tích trình tự gen katG..........................................................34 3.1.4. Kết quả phân tích trình tự gen rpoB..........................................................36 3.2. TỐI ƯU HÓA PHẢN ỨNG MULTIPLEX REAL-TIME PCR PHÁT HIỆN NHANH VI KHUẨN LAO KHÁNG THUỐC..........................................................41 3.2.1. Thiết kế các primer và probe cho phản ứng multiplex real-time PCR. 41 3.2.2. Kết quả tối ưu thành phần và chu trình phản ứng multiplex real-time PCR phát hiện đột biến liên quan kháng thuốc..................................................44 KẾT LUẬN.....................................................................................................................60 KIẾN NGHỊ...................................................................................................................61 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................62 PHỤ LỤC........................................................................................................................69 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc MỞ ĐẦU Bệnh lao và vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis) đã được biết rõ từ một thế kỷ nay. Hiện nay tỷ lệ nhiễm lao được ước tính là 1/3 dân số thế giới, khoảng 9 triệu người mắc lao mới và hơn 3 triệu người chết do lao mỗi năm. Bệnh lao đang trở nên nghiêm trọng hơn với sự xuất hiện các chủng lao kháng đa thuốc (Multi-Drugs Resistant - MDR), tức là thể lao với vi khuẩn kháng ít nhất hai loại thuốc chống lao mạnh nhất là isoniazid (INH) và rifampicin (RMP). Theo số liệu thống kê của chương trình chống lao Quốc gia năm 2007, thế giới có khoảng 511.000 trường hợp nhiễm lao kháng đa thuốc, trong đó có hơn 130.000 trường hợp tử vong. Do những khó khăn trong việc điều trị những bệnh nhân mang các chủng lao kháng thuốc phổ rộng và đa kháng mà việc phát hiện sớm các chủng lao kháng đa thuốc sẽ trở nên rất quan trọng trong điều trị bệnh lao. Hiện nay nhiều nơi chẩn đoán vi khuẩn lao kháng thuốc vẫn dựa vào phương pháp nuôi cấy vi khuẩn và làm kháng sinh đồ là chủ yếu, tuy nhiên, việc ứng dụng sinh học phân tử cũng đang tạo ra những đột phá trong phát hiện vi khuẩn lao kháng thuốc. Cơ chế kháng thuốc ở vi khuẩn lao là do trong quá trình tiến hóa, có nhiều đột biến xuất hiện trong một số gen chức năng, trước hết là ở gen rpoB và katG. Thời gian chẩn đoán có thể rút ngắn chỉ còn vài ngày, với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, tạo điều kiện cho kiểm soát bệnh lao dễ dàng hơn. Các nghiên cứu về sinh học phân tử trong chẩn đoán lao kháng thuốc đã chỉ ra rằng mỗi loại kháng thuốc là do xuất hiện các đột biến trên gen tương ứng chịu trách nhiệm. Chính vì vậy việc xác định các trường hợp nhiễm lao kháng thuốc thường đi kèm với những chẩn đoán phát hiện đột biến gen đối với các chủng lao phát hiện được. Các chủng vi khuẩn lao kháng isoniazid là do có liên quan tới đột biến tại codon 315 trên gen katG, đối với các chủng kháng rifampicin do xuất hiện các đột biến ở một vùng nóng gồm 27 codon nằm gần trung tâm của gen rpoB. 1 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát hiện vi khuẩn lao kháng đa thuốc bằng kỹ thuật sinh học phân tử” Với mục tiêu nghiên cứu: phát hiện nhanh các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc thông qua xác định các vị trí đột biến liên quan kháng thuốc trên gen katG và rpoB bằng phương pháp giải trình tự và kỹ thuật multiplex real-time PCR. Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi tiến hành một số nội dung nghiên cứu như sau: 1. Xác định trình tự gen rpoB và katG. 2. Phân tích đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn lao kháng thuốc phân lập tại Việt Nam trên cơ sở trình tự nucleotide của hai gen rpoB và katG. 3. Tối ưu hóa thành phần và chu trình bộ kit multiplex real-time PCR phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc. 2 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. BỆNH LAO Lao (Tuberculosis) là một bệnh truyền nhiễm mạn tính, là tình trạng nhiễm vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, thường gặp nhất ở phổi nhưng cũng có thể ảnh hưởng đến hệ thần kinh trung ương (lao màng não), hệ bạch huyết, hệ tuần hoàn (lao kê), xương và khớp. Bệnh lao gắn liền với sự phát triển của xã hội loài người từ hàng ngàn năm nay, trên thế giới chưa bao giờ và không một quốc gia nào, một khu vực nào, một dân tộc nào không có người mắc và chết vì bệnh lao. Trực khuẩn lao lần đầu tiên được bác sĩ Robert Koch đã phát hiện vào ngày 24/3/1882. Trong thời gian này ở Mỹ và châu Âu, cứ 7 người thì có 1 người chết vì lao, do vậy, phát hiện của Robert Koch là một bước ngoặt quan trọng trong việc khống chế và loại trừ căn bệnh này. Trước đây, lao được xem là một trong những căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất trên thế giới, lưu hành với tỷ lệ mắc bệnh khá cao, đặc biệt ở các nước thuộc châu Phi và khu vực châu Á, trong đó có Việt Nam. Việt Nam đứng thứ 12 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu. Trong khu vực Tây Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung Quốc và Philippines về số bệnh nhân lao, cũng như số bệnh nhân lao xuất hiện hằng năm. Hiện nay nguy cơ nhiễm lao ở nước ta hằng năm được ước tính là 1,5% dân số (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%). Trên thực tế chỉ số nguy cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5%, như vậy, các con số nêu trên còn có thể lớn hơn. Điều đó sẽ tăng thêm sự khó khăn đối với công tác phòng chống lao không những trong các năm tới mà có thể trong thời gian khá dài, có thể đến hàng chục năm, ngay cả khi ở thiên niên kỷ mới [3, 35]. 1.2. TÌNH HÌNH LAO KHÁNG THUỐC Bệnh lao ngày càng trở nên phức tạp và có ảnh hưởng nặng nề khi xuất hiện thêm vi khuẩn lao kháng thuốc tạo nên một dạng bệnh khó phòng chống. Các chủng 3 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc lao kháng thuốc được chia làm hai thể, đó là lao kháng đa thuốc (Multi-drugs resistant - MDR) và lao kháng thuốc phổ rộng (Extensively drug resistant - XDR), những chủng vi khuẩn lao kháng thuốc này là nguồn lây nhiễm và là mối đe dọa cho sức khỏe của cộng đồng. Theo ước tính của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), trên thế giới có khoảng 42 vạn người mắc lao kháng đa thuốc, chiếm số lượng lớn nhất là ở khu vực Tây Thái Bình Dương có 15 vạn trường hợp, kế đến là khu vực Đông Nam Á và sau đó là khu vực Châu Phi và Đông Âu. Một số chủng lao vừa kháng đa thuốc vừa kháng thuốc phổ rộng, có thể coi là loại siêu kháng thuốc [17]. Tình hình lao siêu kháng thuốc cũng ngày càng trở nên trầm trọng, do vậy từ tháng 11/2004 đến 11/2005, WHO và Trung tâm Kiểm soát Bệnh Hoa Kỳ đã phân tích 17.890 mẫu đờm gửi từ 40 quốc gia trên toàn thế giới, và thấy rằng có 20% trường hợp là kháng đa thuốc và 2% trường hợp là kháng thuốc phổ rộng. Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của Chương trình Chống lao Quốc gia thì có 32,5% các trường hợp bệnh lao mới mang vi khuẩn lao kháng thuốc [1, 3]. Vi khuẩn lao kháng thuốc là một thách thức lớn, đe dọa công cuộc phòng chống lao trên toàn cầu, vì các thuốc chống lao có hiệu quả hiện nay đang bị vi khuẩn lao kháng lại nhất là kháng đa thuốc [10]. Thuốc chống lao có nhiều loại, tác dụng của mỗi thuốc trên trực khuẩn lao không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao thành hai loại: (1) các thuốc chống lao chủ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại một, thuốc chống lao hàng đầu), (2) các thuốc chống lao thứ yếu (còn gọi là các thuốc chống lao loại hai, thuốc chống lao hàng thứ hai). Trong khi các thuốc chống lao loại một là những thuốc có hiệu quả nhất và cũng ít độc tính nhất, thì các thuốc chống lao hàng thứ hai là những thuốc có tác dụng kém hơn lại có độc tính cao và giá thành rất đắt. Ở New York, chi phí điều trị bệnh nhân nhạy với thuốc chỉ mất 2.000 USD trong khi đó điều trị bệnh nhân kháng thuốc hết 250.000 USD. Hiện nay số tử vong hàng năm do lao trên thế giới còn lớn hơn số tử vong do HIV, sốt rét và các bệnh nhiệt đới cộng lại. Tổ chức Y tế Thế giới đã nhận định bệnh lao hiện nay đã quay trở lại và trở nên tồi tệ hơn bởi sự kháng thuốc của vi khuẩn lao [17]. 4 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Thuốc kháng sinh đầu tiên dùng để điều trị lao là streptomycin, nhưng vài năm sau khi kháng sinh này được sử dụng thì người ta đã nhận thấy hiện tượng đề kháng lại streptomycin của vi khuẩn lao. Sau đó các kháng sinh chống lao khác tiếp tục ra đời: para – aminosalysilic, isoniazid, rifampicin nhưng đều không mang lại hiệu quả sau một thời gian điều trị nhất định [7]. Nghiên cứu tìm kiếm hoá dược mới có hiệu quả điều trị lao, đặc biệt là lao kháng thuốc luôn luôn được thực hiện và càng ngày càng có nhiều hợp chất chống lao mới được đưa vào sử dụng, ví dụ, gần đây là linezolid [43]. Tuy nhiên, theo cơ chế và áp lực, vi khuẩn không ngừng biến đổi tạo nên nhiều chủng mới hơn có khả năng kháng thuốc nhanh chóng hơn [52]. Khả năng điều trị thành công có thể đạt 95-100% đối với những bệnh nhân mắc lao thông thường, trong khi tỷ lệ thành công với bệnh nhân mắc lao kháng thuốc chỉ là 20 – 30%, thậm chí còn không điều trị được khi mắc lao kháng đa thuốc và kháng thuốc phổ rộng mặc dù đã dùng kết hợp đến năm loại kháng sinh điều trị lao. Vì vậy, việc phát hiện và ngăn chặn sự lan truyền các chủng lao kháng đa thuốc là vấn đề quan trọng nhất trong điều trị lao hiện nay [7, 10, 35]. 1.3. VI KHUẨN LAO 1.3.1. Cấu tạo Trực khuẩn lao có dạng hình que, thân mảnh dẻ, không có nha bào, kích thước 2 - 3 µm, dày 0,3 µm, kháng cồn, kháng acid (hình 1.1). Khi được nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen, trực khuẩn lao bắt màu đỏ thẫm, do không bị cồn và acid làm mất màu carbonfuchsin. Ở môi trường nuôi cấy có độ acid đậm đặc nhất định, trực khuẩn lao vẫn phát triển được, vì vậy, chúng được gọi là trực khuẩn kháng cồn, kháng toan (acid fast bacilli - AFB), đây là đặc điểm nổi bật của vi khuẩn thuộc chi mycobacteria. Đặc điểm này rất quan trọng để phát hiện trực khuẩn lao bằng phương pháp hình thái học (nhuộm màu) trong các mẫu bệnh phẩm. Một số giả thiết cho rằng mức kháng acid là do độ dài của các chuỗi mycolic acid. M. tuberculosis có khả năng 5 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc thể hiện tất cả các cơ chế cần thiết để tổng hợp các vitamin, amino acid và các enzyme cofactor thiết yếu của tế bào. Mycobacteria có cấu trúc gần giống với vi khuẩn Gram dương nhưng chúng không được xếp vào loại vi khuẩn Gram dương do các phân tử gắn với thành tế bào là lipid chứ không phải protein hay polysaccharide. Do đó, chúng không giữ lại tinh thể màu tím xuất hiện trong nhuộm Gram [2, 5, 37, 38]. Trực khuẩn lao rất hiếu khí, phát triển tốt nhất ở 37 oC và dưới áp suất của O 2 là 100 mmHg. Đỉnh phổi và vùng phổi dưới xương đòn thường hay mắc lao nhất vì có áp suất O2 từ 120 – 130 mmHg (khi đứng) rồi đến thân xương và đầu xương vì áp suất O 2 ở đây là 100 mmHg. Lách, gan, dạ dày, thực quản ít mắc lao hơn vì áp suất O 2 thấp. Trực khuẩn lao sinh sản rất chậm, cứ 20 giờ mới có một lần phân chia tế bào, trong điều kiện phòng thí nghiệm thì cứ 12 đến 24 giờ M. tuberculosis phân chia một lần trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng Loewenstein [46]. Tốc độ phát triển chậm có thể là do tính thẩm thấu của thành tế bào hạn chế trong việc hấp thụ chất dinh dưỡng và liên quan đến tốc độ tổng hợp ribosome (Hình 1.2). Hình 1.1. Hình dạng của tế bào M. tuberculosis (http://www.diseasedetectives.org/micro be_gallery/tuberculosis) Hình 1.2. Tế bào vi khuẩn lao phát triển trong môi trường nuôi cấy. (http://abcnews.go.com/Health/Germs/st ory?id=3079114&page=1) 6 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Trực khuẩn lao có cấu tạo rất phức tạp, hoàn hảo mà ít vi sinh vật nào có được. Dưới kính hiển vi điện tử trực khuẩn lao có cấu tạo chính như sau (hình 1.3): - Lớp trong cùng có cấu trúc màng, có thành phần chủ yếu là các phospholipid gồm 2 nhóm: nhóm ưa nước hướng vào bên trong, nhóm kỵ nước quay ra ngoài. Cấu trúc này tạo nên màng sinh học có tác dụng giúp trực khuẩn điều hòa sự thẩm thấu của vỏ ngoài trực khuẩn, màng còn chứa các protein chức năng khác như các protein truyền tín hiệu đến bộ máy trao đổi chất và di truyền trong nguyên sinh chất, các enzyme liên quan đến quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng, các chất mang làm trung gian cho quá trình vận chuyển các chất dinh dưỡng và các ion. Các enzyme xuyên màng và tổng hợp màng, tạo thành vách ngăn trong phân chia tế bào, tập hợp và tiết một số enzyme ngoại bào, sao chép DNA [2, 4, 37, 38]. - Lớp tiếp theo là peptidoglucan liên kết với đường arabinose và các phân tử mycolic acid tạo nên một bộ khung định hình cho vi khuẩn đảm bảo cho vi khuẩn có độ cứng nhất định. Thành tế bào của mycobacteria là cấu trúc phức tạp nhất được biết ở prokaryote, có một số thành phần hóa học và liên kết chéo bất thường, mức độ liên kết giữa peptidoglucan ở thành tế bào M. tuberculosis là 70 - 80% trong khi ở vi khuẩn E. coli là 20 - 30% [38] - Lớp ngoài được tạo nên bởi sự liên kết giữa các mycolic acid và các chất phức tạp, đây là lớp tạo nên độc tính của vi khuẩn lao và có cấu trúc phức tạp làm tăng khả năng chống thấm nước của thành tế bào vi khuẩn giúp trực khuẩn tồn tại lâu với môi trường bên ngoài, chống khả năng bị hủy diệt bởi đại thực bào và các tế bào miễn dịch [38]. - Lớp vỏ ngoài cùng có vai trò rất quan trọng, có cấu trúc peptidoglyolipid. Nó đảm bảo cho sự tồn tại của trực khuẩn, làm cho trực khuẩn bền vững với hiện tượng thực bào, giúp bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu nên khi vào cơ thể trực khuẩn khó bi tiêu diệt. 7 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Hình 1.3. Cấu tạo thành tế bào của M. tuberculosis (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis/Research/basicResearch/biology cell.htm) 1.3.2. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn lao có thể xâm nhập vào cơ thể qua nhiều con đường khác nhau: thường là đường hô hấp, hoặc có thể qua đường tiêu hóa, da, kết mạc mắt. Sau khi gây tổn thương tiên phát, vi khuẩn lao có thể theo đường bạch huyết hoặc đường máu để đến gây tổn thương thứ phát ở các cơ quan khác: Phổi, thận, màng não, xương, hạch nhưng thường bị hơn cả là đỉnh phổi, nơi có áp suất oxy là 120 mmHg vì đây là điều kiện hoạt động tốt cho vi khuẩn lao. Độc lực của vi khuẩn lao có liên quan đến “Cord factor” (trehalose - 6,6’- dimycolate) là chất gây ức chế hoạt động của tế bào bạch cầu, gây nên những u hạt mạn tính [7]. Khi vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể, trong cơ thể xuất hiện đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Lúc này, đại thực bào, các tế bào lympho T, lympho B và các nguyên bào sợi kết tập lại tạo các u hạt, với các tế bào lympho vây quanh đại thực bào. Chức năng của các u hạt không chỉ ngăn cản sự lan tỏa của tế bào M. tuberculosis mà còn tạo môi trường tại chỗ cho các tế bào của hệ miễn dịch trao đổi thông tin [23]. Bên trong các u hạt, tế bào lympho T tiết ra các cytokine, như γ interferon, hoạt hóa đại 8 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc thực bào khiến chúng diệt khuẩn tốt hơn. Tế bào lympho T cũng tiêu diệt trực tiếp các tế bào bị nhiễm. Nhưng điều quan trọng là vi khuẩn không bị u hạt loại trừ hoàn toàn mà trở nên bất hoạt tạo dạng nhiễm khuẩn “tiềm ẩn” (latent tuberculosis) [18]. 1.3.3. Đặc điểm hệ gen Toàn bộ hệ gen của vi khuẩn lao M. tuberculosis chủng H37Rv được giải trình tự, phân tích và công bố năm 1998 gồm 4.411.529 bp, với đặc tính là chứa nhiều guanine và cystosine (G + C khoảng 65 %). Trên 90% trình tự được dự đoán là có mã hóa cho protein và chỉ có 6 gen giả (pseudogene - gen không mang thông tin di truyền mã hóa cho protein) [28, 38, 44]. Dữ liệu hệ gen của một số vi khuẩn thuộc chi Mycobacterium, trước hết là của vi khuẩn lao (M. tuberculosis) và vi khuẩn phong (M. leprae) có tầm quan trọng đặc biệt trong nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử hỗ trợ dịch tễ học, di truyền học và nghiên cứu kháng thuốc, số liệu đã được lưu giữ tại một số trung tâm và có thể sử dụng một số chương trình để truy cập khám phá và sử dụng [11, 53]. 1.4. CƠ CHẾ KHÁNG THUỐC Ở VI KHUẨN LAO 1.4.1. Kháng sinh trong điều trị lao Thuốc chống lao có nhiều loại, và tác dụng của chúng lên trực khuẩn lao cũng không giống nhau. Hiện nay người ta chia thuốc chống lao làm hai loại: (1) Các thuốc chống lao chủ yếu: gồm năm thuốc chủ yếu đó là: isoniazid (INH), rifampicin (RMP), ethambutol (EMB), pyrazinamid (PZA), streptomycin (SM). Đây là những thuốc kháng lao hiệu quả và cũng ít độc tính nhất. (2) Các thuốc chống lao thứ yếu: là những thuốc chống lao có tác dụng kém hơn và có độc tính cao, không được dùng trong phác đồ điều trị lao nhưng lại được dùng trong các trường hợp điều trị thất bại do vi khuẩn lao kháng lại các loại thuốc chống lao loại một. Các thuốc này gồm có: ethionamide, prothionamide, paraminosalysilic acid (PAS), cycloserine, kanamycin, capreomycin, thiacetazone, ofloxacin, các quinolone… 9 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Các thuốc isoniazid, cycloserine, kanamycin có tác dụng ức chế tổng vách tế bào. Các thuốc streptomycin, kanamycin, capreomycin có tác dụng ức chế tổng hợp protein. Các thuốc rifampicin và ethambutol có tác dụng ức chế sự tổng hợp nucleic acid. Thuốc paraminosalicylic acid có tác dụng chống chuyển hóa [7, 35, 37, 38]. 1.4.2. Nguyên nhân gây kháng thuốc Vi khuẩn lao kháng thuốc là khi chúng không chịu sự tác động của các loại kháng sinh dùng điều trị chúng. Thường nói tới vi khuẩn lao kháng thuốc là nói tới những trường hợp vi khuẩn lao kháng với một trong những thuốc chống lao dòng thứ nhất: isoniazid, rifampicin, pyrazinamide, ethambutol hoặc streptomycin [7, 35] Tính kháng thuốc bao gồm chủ yếu 3 nguyên nhân chính: - Thuốc hoặc các gen đích bị làm biến đổi trong các chủng kháng thuốc do đó các thuốc không còn tác dụng nữa trong việc tiêu diệt vi khuẩn. - Sản phẩm của gen, mà hoạt tính của nó bị ức chế bởi thuốc được vi khuẩn sản xuất thừa ra, do đó lượng thuốc mà bệnh nhân uống vào không đủ để ức chế hoàn toàn vi khuẩn lao. - Những thay đổi xảy ra ở mức độ phân tử và cơ chế xâm nhập của thuốc vào bên trong tế bào vi khuẩn làm cho nồng độ thuốc bên trong tế bào không đạt tới nồng độ tối thiểu có khả năng giết chết vi khuẩn gây bệnh. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn lao có thể xảy ra trước khi xâm nhập (tiên phát) hoặc sau khi nhập vào cơ thể người bệnh (thứ phát). Vi khuẩn lao kháng thuốc tiên phát là hiện tượng lây nhiễm bởi một chủng đã kháng thuốc mà vi khuẩn này đã có sự đề kháng tự nhiên. Vì vậy, bệnh nhân mắc lao do sự lây nhiễm này, ngay từ đầu vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể đã có sự đề kháng với thuốc đang sử dụng. Còn hiện tượng kháng thuốc thứ phát xảy ra đối với các chủng vi khuẩn lao ở bệnh nhân nào đó dùng 10 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc thuốc chống lao không đúng quy định, không đúng liều lượng, thời gian sử dụng thuốc do đó đã chọn lọc vi khuẩn lao khang thuốc [1, 38]. Các chủng vi lao kháng thuốc được chia làm hai loại: (1) Các chủng lao kháng đa thuốc (MDR – TB): Là trường hợp khi các chủng vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin. (2) Các chủng lao kháng thuốc phổ rộng (XDR – TB): Là trường hợp khi vi khuẩn lao đã ở tình trạng kháng đa thuốc và có thêm tính kháng một trong ba loại thuốc chống lao là capreomycin, kanamycin, amikacin [49]. Ngày nay khi nghiên cứu về sinh học phân tử, người ta đã xác định được cơ chế kháng lại nhiều loại kháng sinh có liên quan đến các gen tương ứng. Trong hình 1.4 mô tả các cơ chế phân tử của hiện tượng kháng đa thuốc ở vi khuẩn lao. Trong đó, kháng isoniazid được cho là liên quan đến các gen: KatG, inhA, aphC và kasA. Kháng streptomycin có thể là do đột biến ở gen rpsL. Kháng pyrazinamid có thể liên quan đến gen pncA. Kháng quinolone có thể liên quan tới gen gyrA. Kháng rifampicin được xác định là liên quan đến đột biến ở vùng gần lõi của gen rpoB, gen mã hóa tiểu phần β của RNA polymerase [7, 25]. Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu cơ chế kháng đa thuốc, tức là trường hợp vi khuẩn lao kháng đồng thời hai thuốc chống lao mạnh nhất hiện nay là isoniazid và rifampicin, điều đó đồng nghĩa với việc nghiên cứu các đột biến trên gen rpoB với katG. 11 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Hình 1.4. Cơ chế kháng đa thuốc của vi khuẩn lao (http://www3.niaid.nih.gov/topics/tuberculosis). 1.4.3. Rifampicin và cơ chế kháng Rifampicin tên khoa học là 3 –[[(4 – methyl – 1 – pipeainyl) imino] methyl] (hình 1.5A). Rifampicin là dẫn xuất bán tổng hợp từ rifampicin B, một kháng sinh được chiết xuất từ nấm Streptomyces mediterranei, là thuốc có hoạt tính diệt khuẩn mạnh, tiệt khuẩn, thuốc diệt vi khuẩn lao trong và ngoài tế bào. Rifampicin không có hiện tượng kháng thuốc chéo với các loại thuốc chữa lao khác. Nồng độ ức chế tối thiểu (minimum inhibitory concentration - MIC) đối với vi khuẩn là 5 - 200 ng/ml (in vitro). Đây là thuốc ức chế RNA polymerase mạnh nhất [29, 48]. 12 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc A B Hình 1.5. Công thức cấu tạo của rifampicin (A) và isoniazid (B) [48] Cơ chế tác động của rifampicin liên quan đến khả năng ức chế hoạt động của RNA polymerase. Enzyme này là một phức hợp oligomer gồm bốn tiểu đơn vị khác nhau (α, β, β’, ω), và được mã hóa tương ứng bởi các gen rpoA, rpoB, rpoC, rpoD [7, 20]. Khi rifampicin gắn với tiểu đơn vị β của RNA polymerase (rpoB), làm ức chế các hoạt động sao chép tạo ra các mRNA của vi khuẩn lao và do đó làm ngưng trệ các hoạt động sống của vi khuẩn lao. Đây là cơ chế cơ chế tác dụng của RMP đối với vi khuẩn lao (hình 1.6). Hình 1.6. Cấu trúc tinh thể liên kết giữa rifampicin và RNA polymerase [20] 13 Luận văn thạc sĩ Nguyễn Văn Bắc Gen rpoB có kích thước 3519 bp, mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase (Tuberculosis, 2007). Những đột biến kháng kháng sinh rifampicin thường xảy ra trên đoạn gen rpoB, nhất là đoạn nằm gần trung tâm của gen dài 81 bp được giới hạn từ bộ ba 507 đến 533, người ta gọi đây là vùng “nóng” – “hot-spot region” (hình 1.7). Đột biến ở bộ ba thứ 526, 516, 531, cho kết quả đề kháng với rifampicin cao; đột biến ở bộ ba 510, 515 và 512 thì cho khả năng kháng rifampicin ở mức độ thấp hơn [47]. Đoạn nucleotide của vùng nóng gồm: 507-GGC ACC AGC CAG CTG AGC CAA TTC ATG GAC CAG AAC AAC CCG CTG TCG GGC TTG ACC CAC AAG CGC CGA CTG TCG CGC CTG-533 Mỗi nucleotide trên đoạn này có thể bị thay thế, hoán đổi vị trí, mất đi, thêm vào để tạo ra các đột biến được thể hiện trên hình 1.7 như sau: [41]. Hình 1.7. Trình tự nucleotide và các vị trí có khả năng xảy ra đột biến trên đoạn “nóng” của gen rpoB [41] - Khi xảy ra đột biến gần vùng lõi của gen rpoB sẽ làm thay đổi cấu trúc tiểu phần β của RNA polymerase mà nó mã hóa nên làm cho khả năng kết hợp của RMP với tiểu phần này giảm đi. Kết quả là tác dụng của rifampicin đối với vi khuẩn lao 14