Tài liệu Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm nuôi lồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC NHẰM BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM HÙM NUÔI LỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT Nha Trang - 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG TRẦN VŨ ĐÌNH NGUYÊN NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTIC NHẰM BỔ SUNG VÀO THỨC ĂN CHO TÔM HÙM NUÔI LỒNG Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60 54 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VŨ NGỌC BỘI TS. NGUYỄN VĂN DUY Nha Trang – 2013 -i- LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào. Tác giả luận văn Trần Vũ Đình Nguyên - ii - LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này. Trƣớc hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu - Trƣờng Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ thực phẩm và Lãnh đạo Khoa Sau đại học sự kính trọng, niềm tự hào đƣợc học tập tại Trƣờng trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin đƣợc giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Nguyễn Văn Duy - Trƣờng Đại học Nha Trang đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này. Đặc biệt, xin đƣợc ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: ThS. Lê Đình Đức - Bộ môn Công nghệ sinh học, các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm, các cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ chế biến và Công nghệ thực phẩm, các thầy cô giáo - Trung tâm Thí nghiệm thực hành - Trƣờng Đại học Nha Trang đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập tại Trƣờng. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, ngƣời thân, bạn bè đã tạo điều kiện và động viên khích lệ tôi vƣợt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Học viên Trần Vũ Đình Nguyên - iii - MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN………………………. .....................................................................i LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii MỤC LỤC ................................................................................................................. iii DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT ................................................................................... vi DANH MỤC BẢNG .................................................................................................vii DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................viii LỜI MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 4 1.1. Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus ...................................................... 4 1.1.1. Giới thiệu về probiotic .................................................................................... 4 1.1.2. Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic ......................................................... 5 1.1.2.1. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật chủ. .................................................................................................................... 5 1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của probiotic.................................................................... 6 1.1.3. Phân loại probiotic.......................................................................................... 8 1.1.4. Probiotic từ vi khuẩn Bacillus ......................................................................... 9 1.2. Ứng dụng chế phẩm probiotic trong nuôi tôm hùm và nuôi trồng thủy sản ...... 10 1.2.1 Tôm hùm ....................................................................................................... 10 1.2.2. Tình hình sản xuất thức ăn và phòng trừ dịch bệnh ở tôm hùm ..................... 12 1.2.3. Bệnh Vibriosis đối với tôm hùm và động vật thủy sản .................................. 13 1.2.4. Ứng dụng của probiotic ................................................................................ 16 1.2.4.1. Trong y học, chăn nuôi và bảo vệ môi trƣờng ............................................ 16 1.2.4.2. Trong nuôi trồng thủy sản .......................................................................... 18 1.3. Tình hình nghiên cứu về sản xuất chế phẩm probiotic trong lĩnh vực nuôi tôm 20 1.3.1. Quy trình sản xuất chế phẩm probiotic ......................................................... 20 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................ 22 1.3.3. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc .................................................................. 27 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29 2.1. Nguyên vật liệu ............................................................................................... 29 - iv - 2.1.1. Chủng vi sinh vật .......................................................................................... 29 2.1.2. Thức ăn tôm hùm và dầu mực ...................................................................... 29 2.1.3. Hóa chất, môi trƣờng .................................................................................... 29 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng .................................................................................... 31 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................. 31 2.2.1. Xác định hoạt tính sinh protease ................................................................... 31 2.2.2. Xác định hoạt tính kháng Vibrio spp. gây bệnh trên tôm hùm ....................... 32 2.2.3. Nhuộm Gram tế bào vi khuẩn ....................................................................... 32 2.2.4. Định danh vi khuẩn Bacillus ......................................................................... 32 2.2.5. Xác định khả năng sinh trƣởng ..................................................................... 32 2.2.6. Nuôi cấy và thu sinh khối probiotic .............................................................. 33 2.2.7. Bố trí thí nghiệm xác đị nh các điều kiện nuôi cấy thí ch hợp ......................... 33 2.2.8. Bố trí thí nghiệm xây dựng quy trình lên men ở quy mô pilot ....................... 34 2.2.9. Xác định các thông số của quá trình đông khô .............................................. 35 2.2.10. Bố trí thí nghiệm xác định chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô các vi khuẩn probiotic ............................................................................................ 37 2.2.11. Xác định tỷ lệ tế bào sống sau đông khô .................................................... 38 2.2.12. Xác định hàm lƣợng ẩm tồn dƣ ................................................................... 39 2.2.13. Khảo sát tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn ...................................................... 39 2.2.14. Xử lý thống kê ............................................................................................ 40 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 41 3.1. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trƣờng nuôi . 41 3.1.1. Đánh giá hoạt tính probiotic của các chủng nghiên cứu ................................ 41 3.1.1.1. Xác định hoạt tính sinh protease ngoại bào ................................................ 41 3.1.1.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ................................................................. 42 3.1.2. Đƣờng cong sinh trƣởng và xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian .. 45 3.1.2.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu .................... 45 3.1.2.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn theo thời gian .......................................... 48 3.1.3. Một số đặc điểm sinh học của các chủng probiotic nghiên cứu ..................... 49 3.1.4. Xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy các chủng vi khuẩn đã lựa chọn ............................................................................................................. 53 -v- 3.1.4.1. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng probiotic nghiên cứu ............................................................................................................. 53 3.1.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ...... 54 3.1.4.3. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu . 55 3.1.4.4. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 56 3.1.4.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .......... 57 3.1.5. Xây dựng quy trình lên men ......................................................................... 58 3.1.5.1. Xác định pH thích hợp cho quá trình lên men ............................................ 58 3.1.5.2. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men .................................... 59 3.1.5.3. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men ................................... 59 3.1.5.4. Đề xuất quy trình lên men ......................................................................... 60 3.2. Xây dựng quy trình đông khô .......................................................................... 61 3.2.1. Xác định quy trình đông khô đối với sinh khối vi khuẩn ............................... 61 3.2.2. Chất chống đông........................................................................................... 63 3.3. Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic ........ 65 3.3.1. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic .......................................... 65 3.3.2. Sản xuất thử nghiệm chế phẩm ..................................................................... 66 3.4. Thử nghiệm sử dụng chế phẩm probiotic phối trộn với thức ăn tôm hùm......... 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 72 PHỤ LỤC ................................................................................................................. 77 - vi - DANH MỤC CHƢ̃ VIẾT TẮT OD : Optical Density (Mật độ quang) CFU : Colony Forming Unit FDA : Food and Drug Administration (Cục quản lý thực phẩm và dƣợc : phẩm Hoa Kỳ) TCBS : Thiosulphate citrate bile salt agar FCR : Hệ số chuyển đổi thƣ́c ăn TSB : Trypton Soy Broth TSA : Trypton Soy Agar APW : Alkaline Peptone Water LB : Lauria Broth GRAS : Generally recognized as safe - vii - DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Bệnh gây bởi Vibrio spp. trong nuôi trồng thủy sản ..................................... 15 Bảng 1.2 Chế phẩm probiotic sử dụng trong nuôi tôm, cua, cá, sò và hiệu quả của chúng .................................................................................................................... 19 Bảng 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào ................................................................ 41 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng V1.1...................................................................................................................... 43 Bảng 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng V3.3...................................................................................................................... 43 Bảng 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu đối với chủng DYO5 ................................................................................................................... 45 Bảng 3.5 Kết quả định danh chủng B3.10.2 bằng bộ kít hóa sinh API 50CHB ............ 51 Bảng 3.6 Quy trình đông khô sinh khối các chủng probiotic nghiên cứu ..................... 62 Bảng PL.1. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng probiotic nghiên cứu theo thời gian. ................................................................................................ 77 Bảng PL.2. Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng nghiên cứu theo thời gian. .............................................................................................................. 77 Bảng PL.3. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng TSB và LB . 77 Bảng PL.4. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trên môi trƣờng TSB và LB . 78 Bảng PL.5. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.1 trên môi trƣờng TSB và LB ... 78 Bảng PL.6. Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.4 trên môi trƣờng TSB và LB ... 78 Bảng PL.7. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 79 Bảng PL.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu .............................. 79 Bảng PL.9. Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu 79 Bảng PL.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu.......... 79 Bảng PL.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ....... 80 Bảng PL.12. Ảnh hƣởng của pH đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 110 ........ 80 Bảng PL.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trình lên men bằng thiết bị BioFlo 11081 Bảng PL.14. Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau khi đông khô ....................................... 81 Bảng PL.15. Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau khi đông khô ..................................... 81 Bảng PL.16. Ảnh hƣởng của dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời gian tan trong môi trƣờng nƣớc biển ............................................................................. 82 Bảng PL.17. Áp suất bay hơi theo nhiệt độ ................................................................. 82 - viii - DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác đị nh các thông số đông khô tối ƣu cho quá trì nh đông khô vi khuẩn probiotic ...................................................................... 37 Hình 2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ chất chống đông phù hợp cho quá trình đông khô vi khuẩn probiotic .............................................................. 38 Hình 3.1 Hoạt tính sinh protease ngoại bào của các chủng probiotic nghiên cứu ......... 41 Hình 3.2 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V1.143 Hình 3.3 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng V3.344 Hình 3.4 Hoạt tính kháng khuẩn của các chủng probiotic nghiên cứu với chủng DY05 ........ 44 Hình 3.5 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.1 trên môi trƣờng TSB và LB ..... 46 Hình 3.6 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 trên môi trƣờng TSB và LB ..... 46 Hình 3.7 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.1 trên môi trƣờng TSB và LB ....... 47 Hình 3.8 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.7.4 trên môi trƣờng TSB và LB ....... 47 Hình 3.9 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V1.1 của các chủng nghiên cứu theo thời gian .................................................................................................... 48 Hình 3.10 Hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng V3.3 của các chủng .......................... 49 nghiên cứu theo thời gian ............................................................................................ 49 Hình 3.11 Hình ảnh hình thái khuẩn lạc của các chủng probiotic nghiên cứu .............. 50 Hình 3.12 Hình ảnh nhuộm Gram tế bào các chủng probiotic nghiên cứu ................... 50 Hình 3.13 Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .. 53 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến các chủng nghiên cứu ............................... 54 Hình 3.15 Ảnh hƣởng của nồng độ muối đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu .. 55 Hình 3.16 Ảnh hƣởng của pH đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ................... 56 Hình 3.17 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sinh trƣởng của các chủng nghiên cứu ........... 57 Hình 3.18 Ảnh hƣởng của pH đến quá trình lên men .................................................. 58 Hình 3.19 Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến quá trì nh lên men ........................................... 59 Hình 3.20 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng B3.10.2 khi nuôi trên thiết bị lên men BioFlo 110 ................................................................................................. 60 Hình 3.21 Sơ đồ quy trì nh lên men ............................................................................. 61 Hình 2.22 Chế phẩm probiotic trƣớc (a) và sau khi đông khô (b) ................................ 62 - ix - Hình 3.23 Tỷ lệ sống của chủng B3.10.2 sau đông khô ............................................... 63 Hình 3.24 Tỷ lệ sống của chủng B3.7.4 sau đông khô ................................................. 63 Hình 3.26 Quy trì nh sản xuất chế phẩm probiotic dạng đông khô ............................... 65 Hình 3.27 Chế phẩm probiotic Bio – Lobster .............................................................. 67 Hình 3.28 Ảnh hƣởng của tỉ lệ trộn dầu mực vào thức ăn bổ sung probiotic đối với thời gian tan trong môi trƣờng nƣớc biển .......................................................... 67 Hình 3.29 Thức ăn khi mới cho vào nƣớc biển(A) và sau khi để 8 giờ (B) .................. 68 Hình 3.30 Thức ăn trộn quá nhiều dầu mực ................................................................ 68 -1- LỜI MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài Tôm hùm là một loại đặc sản có giá trị kinh tế cao nên nghề nuôi tôm hùm đang rất đƣợc quan tâm phát triển ở khu vực miền Trung cũng nhƣ trong cả nƣớc. Nghề nuôi tôm hùm phát triển mạnh từ năm 2000 mang lại công ăn việc làm và thu nhập cho ngƣ dân các tỉnh Khánh Hoà, Phú Yên, Ninh Thuận, Bình Định và Bình Thuận. Gần đây, việc nuôi tôm trên khắp thế giới thƣờng xuyên bị ảnh hƣởng bởi các bệnh do vi khuẩn, gây ra tổn thất nặng nề. Trong đó điển hình là nhóm vi khuẩn Vibrio, ví dụ nhƣ vi khuẩn Vibrio alginolyticus là một trong những tác nhân gây ra bệnh đỏ thân ở tôm hùm. Một yếu tố nữa ảnh hƣởng đến quá trình nuôi tôm là do sức đề kháng của tôm yếu làm quá trình lột xác không thực hiện đƣợc khi tôm đến kỳ lột xác và làm cho tôm dễ bị nhiễm bệnh. Để kiểm soát vi sinh vật gây hại, phƣơng pháp truyền thống là dùng các hóa chất diệt khuẩn và kháng sinh, tuy nhiên các hóa chất diệt khuẩn nhƣ chlorin ngoài việc làm tăng mật độ Vibrio sau khi sử dụng, các dẫn xuất của chlorin còn là những chất gây đột biến và ung thƣ nhƣ: chloroform (CHCl3), bromodichloro-methane (CHBrCl2), dibromodichlo-romethane (CHBrCl2), và bromoform (CHBr3). Các loại kháng sinh tạo ra các chủng kháng kháng sinh, các plasmid mã hóa cho các gen kháng kháng sinh có thể truyền từ vi sinh vật gây bệnh ở thủy sản sang các vi sinh vật gây bệnh cho động vật và ngƣời. Vì lẽ đó ngày nay nhiều loại kháng sinh đã bị cấm sử dụng trong nuôi thủy sản và làm thế nào để cải thiện môi trƣờng sinh thái của nuôi trồng thủy sản đã trở thành tâm điểm chú ý của nuôi trồng thủy sản quốc tế. Từ lâu đã có những mối quan tâm đến việc tìm ra các chất thay thế kháng sinh trong nuôi trồng thủy sản, các hoạt chất, chế phẩm sinh học giúp tăng sức đề kháng của vật nuôi, cải thiện và nâng cao hiệu quả chăn nuôi. Những vi sinh vật sống trong đƣờng tiêu hóa của vật nuôi có ảnh hƣởng sâu sắc đến các quá trình sinh trƣởng, phát triển của vật nuôi. Vì vậy, điều quan trọng là phải hiểu cơ chế của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa vật nuôi, tìm ra các hoạt chất thay thế các chất kháng sinh độc hại. Cơ sở khoa học của việc sử dụng các chế phẩm vi sinh là tăng sức khỏe cho động vật nuôi, cải thiện môi trƣờng và khống chế số lƣợng vi sinh gây bệnh (Farzanfar, 2006). Trong trạng thái bình thƣờng thì trong hệ tiêu hóa có sự cân bằng giữa vi khuẩn có lợi và gây bệnh. Nó bị ảnh hƣởng bởi các tƣơng tác, quan hệ cộng sinh và cạnh tranh. Hệ vi sinh -2- vật có lợi không chỉ bảo vệ bộ máy tiêu hóa mà còn tăng khả năng hấp thụ thức ăn giúp cho vật chủ tăng khả năng sinh trƣởng và phát triển. Nuôi trồng thủy sản, cũng nhƣ ngành công nghiệp khác, liên tục đòi hỏi kỹ thuật mới, sử dụng các tác nhân mới nhƣ vi khuẩn lactic và Bacillus spp. đƣợc đƣa vào để thúc đẩy sự tăng trƣởng của vật nuôi trong nuôi trồng thủy sản. Ngày nay, các chế phẩm sinh học đƣợc ứng dụng rộng rãi tại Hoa Kỳ, Nhật Bản, các nƣớc châu Âu, Indonesia, Ấn Độ và Thái Lan, với kết quả khả quan. Nghiên cứu về probiotic có thể tạo ra một lĩnh vực mới của sản phẩm công nghiệp, giống nhƣ các lĩnh vực công nghiệp chế biến sản phẩm nuôi trồng và chế biến thực phẩm nuôi trồng thủy sản. Trung Quốc là một nƣớc lớn trong nuôi trồng thủy sản. Trong những năm gần đây, chính phủ Trung Quốc đã nhận thức đƣợc giá trị kinh tế và lợi ích xã hội tiềm năng của các ứng dụng của men vi sinh trong nuôi trồng thuỷ sản, và gần đây, quan tâm nhiều hơn đến việc nghiên cứu và phát triển của men vi sinh trong nuôi trồng thủy sản. Do đó, chính phủ đã tăng kinh phí nghiên cứu cho nó. Probiotic chủ yếu ức chế sự tăng trƣởng và giảm khả năng gây bệnh của vi khuẩn gây bệnh, tăng cƣờng dinh dƣỡng của các loài động vật thủy sản, cải thiện chất lƣợng nƣớc nuôi trồng thủy sản và giảm việc sử dụng kháng sinh và hóa chất khác, do đó giảm ô nhiễm môi trƣờng của các kháng sinh còn lại và hóa chất. Điều này có nghĩa là lợi ích của men vi sinh sẽ đƣợc lâu dài, và các ứng dụng của men vi sinh sẽ trở thành một lĩnh vực quan trọng trong việc phát triển nuôi trồng thủy sản trong tƣơng lai (Maqsood, 2010). Sử dụng các chế phẩm vi sinh trong nuôi thủy sản nói chung và trong nuôi tôm nói riêng ở nƣớc ta là một xu hƣớng tích cực và ngày càng mở rộng. Chính từ những lý do trên, dƣới sự hƣớng dẫn của TS. Vũ Ngọc Bội và TS. Nguyễn Văn Duy, tôi quyết định chọn đề tài “Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm probiotic nhằm bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm nuôi lồng”. Mục tiêu của đề tài - Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic. - Thử nghiệm phối trộn chế phẩm probiotic vào thức ăn của tôm hùm. Nội dung nghiên cứu 1) Nghiên cứu quy trình nuôi cấy vi khuẩn và thu sinh khối từ canh trường nuôi. 2) Xác định các thông số thích hợp cho quy trình đông khô chế phẩm vi khuẩn: kỹ thuật đông khô, chất chống đông… -3- 3) Xây dựng quy trình sản xuất và sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic. 4) Đánh giá khả năng sử dụng chế phẩm trong lĩnh vực làm thức ăn nuôi tôm hùm lồng. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài. Việc sử dụng các chế phẩm sinh học, nhất là probiotic, trong nuôi trồng hải sản là hƣớng nghiên cứu khá mới, đầy triển vọng nhằm góp phần phòng trừ dịch bệnh, cải thiện chất lƣợng sản phẩm, giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng và phát triển bền vững nghề nuôi trồng thủy sản. Xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm probiotic cho đối tƣợng tôm hùm là một vấn đề mới trên thế giới và Việt Nam. Nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng bổ sung vào thức ăn cho tôm hùm sẽ góp phần làm tăng sức đề kháng bệnh tật, tăng khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng, nâng cao khả năng sinh trƣởng và phát triển của tôm hùm. Việc sử dụng chế phẩm probiotic làm hạn chế việc sử dụng các chất kháng sinh, các chất kích thích tăng trƣởng làm ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm, tránh đƣợc việc tồn đọng dƣ lƣợng các chất độc hại trên tôm hùm gây ảnh hƣởng không có lợi cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng và giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng xung quanh. Từ đó tăng khả năng tiêu thụ, xuất khẩu sản phẩm, mang lại giá trị lợi nhuận và hiệu quả kinh tế cao. Đó cũng chính là góp phần vào việc phát triển nền kinh tế đất nƣớc, phát huy thế mạnh tiềm năng, sử dụng các nguồn lợi từ biển, góp phần giải quyết việc làm cho ngƣời lao động trong lĩnh vực nuôi trồng và chế biến thủy sản. -4- CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về probiotic và vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Giới thiệu về probiotic Thuật ngữ “probiotic” đƣợc Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tả những chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trƣởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật) khác. Năm 1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ: “Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ” (Parker, 1989). Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học (có lẽ là do ghép 2 chữ tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotics – sự sống). Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới đƣợc chú ý trong 20 năm trở lại đây, nhƣng tác dụng của nó đã đƣợc nhận thấy từ lâu. Elie Metnhicoff là ngƣời đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic, ông đề nghị sử dụng vi khuẩn lactic để kéo dài tuổi thọ con ngƣời vào năm 1908. Ngày nay chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng khá hiệu quả trong chăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con ngƣời và bảo vệ môi trƣờng. Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản (tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây. Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữu hiệu) do giáo sƣ, tiến sỹ Teruo Higa, Trƣờng đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản đề xuất năm 1980 đã đƣợc sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng nhƣ bảo vệ môi trƣờng đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980). Đến nay chế phẩm này đƣợc hơn 80 nƣớc và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái Bình Dƣơng trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam. Thành phần của các chế phẩm probiotic là các vi sinh vật đƣợc sử dụng phổ biến nhƣ: vi khuẩn lactic (Lactobacilli, Streptococci và Bifidobacteria), Bacillus sp., nấm men (Saccharomyces cerevisiae) và nấm sợi (Aspergillus oryzae). Những chủng probiotic này đƣợc tìm thấy trong ruột của động vật khỏe mạnh với số lƣợng lớn. Chúng đƣợc xem là an toàn (GRAS) theo lời của FDA, Mỹ. Các chế phẩm probiotic đƣợc sử dụng dƣới nhiều dạng nhƣ: dạng bột, dạng viên nén, viên nang hay bột nhão (Fuller, 1992). Tiêu chuẩn lựa chọn robiotic: - Kiểm tra in vitro đối với hoạt tính kháng khuẩn. -5- - Kiểm tra khả năng bám dính và tồn tại của chủng probiotic. - Đánh giá ảnh hƣởng của chế phẩm sinh học trên vật chủ, hiệu quả kinh tế trƣớc khi sản xuất thƣơng mại. Một probiotic phải có hiệu quả và an toàn (Verschuere et al, 2000). Nó không có hại và có thể nhận đƣợc bởi động vật chủ thông qua hệ tiêu hóa trực tiếp. Nó không chứa gen kháng độc lực hoặc kháng kháng sinh. 1.1.2. Cơ sở khoa học của công nghệ probiotic 1.1.2.1. Hệ vi sinh vật đƣờng ruột và tác dụng của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật chủ. Theo Jans (2005), một mặt hệ vi sinh vật đƣờng ruột liên quan đến việc tiêu hóa, mặt khác nó tác động đến hệ thống miễn dịch do đó mục tiêu của việc sử dụng chế phẩm sinh học là để giúp ổn định sức khỏe và dinh dƣỡng cho vật chủ. Sự hỗ trợ của hệ vi sinh vật đƣờng ruột giúp ức chế sự phát triển của mầm bệnh, tác nhân gây bệnh tiềm năng và các vi sinh vật khác từ đó ngăn chặn các vi sinh vật có hại xâm nhập vào cơ thể. Trong hệ vi sinh vật đƣờng ruột, số lƣợng loài đƣợc xác định có khoảng 400 đến 500 loài khác nhau. Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đƣờng tiêu hóa cũng khác nhau: - Dạ dày: 101-103 cfu/ml, chủ yếu gồm Lactobacilli, Enterobacteria, Bacteroides. - Tá tràng: 101-104 cfu/ml. - Ruột non: 105-108 cfu/g, chủ yếu gồm Bacteroides (104-107), Steptococci, Lactobacilli, Enterobacteria. - Ruột già: 109-1012 cfu/g, chủ yếu gồm Bifidobacteria, Bacteroides, Enterobacteria (105-107), Enterococci (102-105), Lactobacilli, Clostridia, Fusobacteria, Veillomella, Staphylococci, nấm men, Proteus, Pseudomonas. Tùy thuộc vào điều kiện trong đƣờng tiêu hóa mà trạng thái cân bằng động giữa các loài khác nhau đƣợc thành lập. Theo Jans (2005), hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng khi nhóm vi khuẩn kị khí (Clostridia, Bifidobacteria, Lactobacilli, Bacteroides, Eubacteria) chiếm trên 90%; nhóm vệ tinh (Satellite flora) gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli chiếm khoảng 1% và nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại nhƣ Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas... chiếm dƣới 0,01%. -6- Nhóm vi khuẩn chính, nhóm vệ tinh và nhóm vi sinh vật còn lại tạo thành một tỷ lệ 90:1:0,01 đƣợc gọi là "eubiosis", tiếng Hy Lạp có nghĩa là "chung sống" của các vi sinh vật với nhau cũng nhƣ với các sinh vật chủ. Mối quan hệ này là quan hệ cộng sinh giữa vật chủ và hệ vi sinh vật. Vật chủ sẽ tạo điều kiện sống lý tƣởng nhƣ nhiệt độ , pH, chất dinh dƣỡng và đào thải các chất chuyển hóa . Khi hệ vi sinh vật ở trạng thái cân bằng sẽ chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây hại , tổng hợp vitamin B và K , kích thích hệ miễn dịch và sinh trƣởng của vật chủ . Nếu mối quan hệ này bị gián đoạn nghiêm trọng, tình trạng này đƣợc gọi là dysbiosis (“chung sống có hại”). Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đƣờng tiêu hóa bị tác động bởi các nhân tố vô sinh và hữu sinh nhƣ: sinh lý vật chủ (hệ miễn dịch, muối mật, enzyme…), thành phần và chất lƣợng thức ăn. Tác động của dysbiosis làm cho vật chủ có thể trạng yếu, tăng trƣởng kém và các triệu chứng về tiêu hóa. 1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của probiotic a. Cạnh tranh dinh dƣỡng Bên cạnh cạnh tranh nguồn dinh dƣỡng cacbon, nitơ và nhiều loại muối khoáng, tất cả các vi sinh vật đều cần sắt để tăng trƣởng. Siderophore là một chất có khả năng gắn với ion sắt, hòa tan sắt dễ dàng cho vi sinh vật. Các vi sinh vật vô hại sinh siderophore có thể sử dụng nhƣ probiotic để cạnh tranh sắt với các vi khuẩn gây hại (Vine et al., 2006). b. Cạnh tranh vị trí bám dính với vi sinh vật gây bệnh Khả năng bám dính của các vi khuẩn probiotic vào niêm mạc ruột đƣợc xem là một trong những tiêu chí lựa chọn chủng probiotic. Các tế bào biểu mô đƣờng ruột là tế bào chủ cho hàng triệu vị trí gắn thụ thể của vi khuẩn khác nhau. Khi probiotic liên kết với vị trí gắn thụ thể trên tế bào biểu mô sẽ làm thay đổi niêm mạc của tế bào đó và tế bào lân cận. Do đó vi khuẩn có hại ít có khả năng bám dính lên miên mạc ruột. Probiotic có thể tìm thấy điểm gắn trong rất nhiều vị trí, do đó ngăn ngừa vi khuẩn có hại xâm nhập. Vi khuẩn bám dính trên niêm mạc ruột nhờ cơ chế đặc trƣng (chất bám dính và các phân tử thụ thể của ruột) và cơ chế không đặc trƣng (dựa vào những yếu tố hóa học). Một vài thành phần cấu tạo của vi khuẩn: protein, thành tế bào, carbonhydrate, và acid lipoteichoic đƣợc xem là có liên quan đến tính bám dính của probiotic vào ruột. -7- c. Sản xuất các hợp chất kháng khuẩn Thành phần chất tiết ra khó có thể xác định đƣợc nên đƣợc gọi chung là chất ức chế. Vi khuẩn lactic từ lâu đƣợc biết là chủng vi khuẩn tiết ra chất kháng khuẩn (bacteriocin). Phần lớn các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản là nhóm Gram âm. Nhiều vi khuẩn tiết ra chất ức chế chống lại các vi khuẩn gây bệnh nhƣ Aeromonas hydrophila và Vibrio parahaemolyticus (Nair et al., 1985). Cơ chế tiết ra chất chống lại vi khuẩn gây bệnh trong các thử nghiệm ở mức tế bào in-vitro rất phổ biến trong môi trƣờng nƣớc. Có rất nhiều nghiên cứu chứng minh rằng có nhiều dòng vi khuẩn in-vitro kìm hãm đƣợc các mầm bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Những nghiên cứu này cũng chứng minh khả năng kìm hãm vi khuẩn của những dòng vi khuẩn thông thƣờng dễ tìm thấy trong môi trƣờng (Fuller, 1989). Những quần thể sinh vật này có thể tiết vào môi trƣờng những chất có tính sát khuẩn hoặc kìm khuẩn, gây ảnh hƣởng đến quần thể vi sinh khác, nhằm gián tiếp cạnh tranh dinh dƣỡng và năng lƣợng có sẵn trong môi trƣờng. Sự hiện diện của những vi khuẩn này sản sinh chất kìm hãm, có thể tiết trong ruột, trên bề mặt cơ thể vật chủ hay ra môi trƣờng nƣớc làm rào cản gây ức chế các vi sinh vật gây bệnh (Vine et al., 2006). d. Ức chế cơ chế kiểm soát mật độ tới hạn (Quorum Sensing) Theo Đặng Tố Vân Cầm (2009), mỗi vi khuẩn có thể phóng thích ra một loại phân tử hóa học đặc trƣng. Các phân tử này sẽ khuếch tán vào trong môi trƣờng nƣớc. Khi tích lũy đến một nồng độ tới hạn nào đó, các phân tử hoá học sẽ trở thành một loại tín hiệu giúp vi khuẩn có thể dò tìm và nhận biết đồng loại. Nói cách khác, Quorum Sensing là cơ chế vi khuẩn điều khiển gene liên quan đến mật độ quần thể bằng cách tạo ra (producing), phóng thích (releasing) và dò tìm (detecting) các phân tử tín hiệu; là tiến trình các tế bào vi khuẩn thông tin liên lạc với nhau bằng các phân tử tín hiệu. Nhờ Quorum Sensing, vi khuẩn có thể kích hoạt sự hoạt động của các gen mã hóa các tiến trình nhƣ: tạo màng sinh học, tạo bào tử, phát sáng, sản xuất kháng sinh, tiết ra các độc tố,… Hệ thống Quorum Sensing của vi khuẩn đã đƣợc phát hiện từ lâu. Chúng có chức năng điều khiển độc lực của rất nhiều loài vi khuẩn và là tác nhân gây bệnh cho ngƣời, cho vật nuôi và cho cây trồng. Các phân tử tín hiệu của vi khuẩn Gram âm là Acyl Homoserine Lactone (AHL). -8- Việc phá hủy hệ thống Quorum Sensing của tác nhân gây bệnh nhằm làm bất hoạt mà không ảnh hƣởng đến sự phát triển của tác nhân gây bệnh, là hƣớng nghiên cứu - ứng dụng hoàn toàn mới trong lĩnh vực phòng trị bệnh bằng probiotic. e. Cải thiện chất lƣợng nƣớc Theo Sihag và Sharma (2012), việc bổ sung chế phẩm sinh học giúp cải thiện chất lƣợng nƣớc, đặc biệt là vi khuẩn Bacillus spp. Trong ao nuôi chứa nhiều bùn sẽ tích tụ nhiều nitrogen, một số vi khuẩn gram âm tiết ra chất nhầy làm ngăn cản khuyếch tán oxy vào lớp bùn đáy. Dó đó lớp chất thải ở đáy ao không bị phân hủy, probiotic giúp phân hủy làm sạch chất thải ở đáy ao. Nhóm vi khuẩn có lợi có khả năng loại bỏ chất thải chứa nitơ (ammonia, nitrite và nitrát) nhờ enzyme ngoại bào do chúng chuyển hóa. Cho nên nhóm vi khuẩn này giải phóng enzyme trong ao có tác dụng làm giảm vi khuẩn, virus gây bệnh trong ao (Bùi Quang Tề, 2009). Nhóm vi khuẩn này lấn át nhóm vi khuẩn gây bệnh nhƣ Vibrio spp., Aeromonas spp… Khi vi khuẩn probiotic đƣợc sử dụng trong môi trƣờng nuôi có tảo, một số chủng vi khuẩn ức chế sự tăng trƣởng của các loại tảo đơn bào (Pavlova lutheri) ở các mức độ khác nhau (Munro et al.,1995). 1.1.3. Phân loại probiotic Các chế phẩm sinh học đƣợc sử dụng ở động vật có thể đƣợc chia thành ba nhóm chính: vi khuẩn lactic, Bacillus spp. và nấm men (Jans, 2005). - Vi khuẩn lactic: Vi khuẩn này đƣợc sử dụng trong nhiều thiên niên kỷ trong việc sản xuất sản phẩm sữa lên men và thực phẩm muối chua. Một số chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn làm chế phẩm probiotic nhƣ: Lactobacillic, Pediococci, Bifidobacteria và Enterococci. Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic chuyển đổi một số loại đƣờng thành acid lactic. Tính năng đặc trƣng của nhóm chế phẩm sinh học này là sinh các chất kháng khuẩn và sự hình thành màng sinh học để bảo vệ màng nhầy ruột. sản xuất các chất ức chế nhƣ aicd béo mạch ngắn làm giảm pH. Loại trừ các vi sinh vật gây bệnh hoặc ngăn chặn chúng dính vào màng nhầy ruột. Sự gia tăng số lƣợng vi khuẩn lactic tạo thành một hàng rào chống lại các vi sinh vật khác trong ruột. Ngăn chặn sản xuất độc tố. Kích thích hệ thống miễn dịch trong ruột. Ảnh hƣởng các điều kiện lý hóa trong ruột, ví dụ pH và thế oxy hóa khử, qua đó hạn chế các điều kiện tăng trƣởng. Ảnh hƣởng trên sự chuyển hóa của các acid mật và do đó thúc đẩy sự hấp thụ chất béo, tác dụng trên biểu mô ruột, cải thiện khả năng hấp thụ. -9- - Vi khuẩn Bacillus: Là vi sinh vật đƣợc tìm thấy phổ biến trong đất, vi khuẩn có dạng hình que, bắt màu gram dƣơng. Khả năng tự nhiên của men vi sinh Bacillus chống lại các ảnh hƣởng bên ngoài. Rengpipat và cs (2000), chỉ ra rằng việc sử dụng các vi khuẩn Bacillus sp. cung cấp bảo vệ bệnh bằng cách kích hoạt hệ miễn dịch tế bào và miễn dịch dịch thể ở tôm Sú (Penaeus monodon). Vi sinh vật thuộc nhóm Bacillus nhờ môi trƣờng thích hợp sẽ phát triển số lƣợng rất lớn, cạnh tranh sử dụng hết thức ăn của động vật nguyên sinh, Vibrio và các vi sinh vật có hại, ngăn cản sự phát triển của chúng, từ đó giảm đƣợc các tác nhân gây bệnh. - Nấm men: Chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae đã đƣợc sử dụng trong nhiều thế kỷ đối với sản xuất thực phẩm. Nấm men đã đƣợc sử dụng khoảng 370 trƣớc Công nguyên, Hippocrates đã phát hiện ra tác dụng lợi tiểu của nấm men và coi nó nhƣ là một loại thuốc. Một số chủng Saccharomyces cerevisiae có thể để cung cấp chất dinh dƣỡng: peptide, vitamin, acid hữu cơ. 1.1.4. Probiotic từ vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn, gram dƣơng, tế bào hình que và thẳng, kích thƣớc 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 μm, di động bằng chu mao. Chi Bacillus rất đa dạng về sinh lý và sinh thái. Chúng là vi sinh vật hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện nhƣng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Là vi khuẩn dị dƣỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lƣợng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ. Các chủng này sinh trƣởng tốt trong môi trƣờng chứa glucose, amonium sulphate và một vài loại muối khoáng. Nhiều loài Bacillus có khả năng kháng nhiệt, chịu đƣợc điều kiện khô hạn, pH cực trị, chất khử và các phân tử có hại khác. Đa số Bacillus sinh trƣởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 nhƣ Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 nhƣ Bacillus acidocaldrius. Về nhiệt độ có nhiều chủng ƣa nhiệt độ cao (450 – 750C), hay ƣa lạnh (50 – 250C), nhƣng thƣờng gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340 – 370C (Gordon, 1973). Vi khuẩn Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nƣớc, không khí, một số loài còn thấy trong khoang miệng, trong đƣờng ruột của ngƣời và động vật (Lƣơng Đức phẩm, 1998). Các loài thuộc chi Bacillus đặc trƣng cho trực khuẩn sinh bào tử mà vẫn giữ nguyên hình que khi mang bào tử, trong một số trƣờng hợp chỉ hơi phình to lên một chút. Mỗi tế bào sinh dƣỡng thƣờng chỉ hình thành một nội bào tử. Thông thƣờng bào