Tài liệu Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên động vật thực nghiệm của phân đoạn chiết chloroform từ thân cây ý dĩ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM TỪ THÂN CÂY Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ ĐÔNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM TỪ THÂN CÂY Ý DĨ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 60 72 04 08 Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương HÀ NỘI 2013 Lời cảm ơn Trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn này, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị, các em và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới Ts. Phùng Thanh Hương, người thày luôn sát cánh tận tình hướng dẫn, quan tâm giúp đỡ cũng như động viên tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu trường Trường đại học Dược Hà Nội, trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lý, Phòng sau đại học trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các thày cô giáo, anh, chị, em kỹ thuật viên Bộ môn Hóa sinh, Bộ môn Dược lý trường Đại Học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa dược trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm tại Bộ môn Xin gửi lới cảm ơn tới bạn bè, các anh chị em đồng nghiệp trường Cao đẳng Dược trung ương Hải Dương, các bạn trong lớp Cao học 16 đã động viên và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn. Lời cảm ơn cuối cùng tôi muốn giành tặng cho những người thân trong gia đình đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ và giành mọi thời gian để tôi học tập làm việc và hoàn thành luận văn này. HV. Nguyễn Thị Đông MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ ....................................................................................................1 Chương 1 ...........................................................................................................3 TỔNG QUAN ....................................................................................................3 1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG ......................................................................3 1.1.1. Định nghĩa, phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán .....................................3 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh......................................................................................4 1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường typ 1.............................................................4 1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường typ 2.............................................................6 1.1.3. Hướng tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường ...............................9 1.1.3.1. Insulin [1] ..............................................................................................9 1.1.3.2. Các thuốc làm tăng cường lượng insulin..............................................9 1.1.3.3. Các thuốc tăng cường tác dụng của insulin ở mô đích.......................11 1.1.3.3. Các thuốc làm ức chế tiêu hóa hấp thu glucid ....................................13 1.1.3.4. Các thuốc có tác dụng tương tự insulin trong điều hòa chuyển hóa glucid ................................................................................................................13 1.2. CÁC MÔ HÌNH GÂY TĂNG GLUCOSE HUYẾT THỰC NGHIỆM .14 1.2.2. Đái tháo đường do di truyền .................................................................15 1.2.3. Động vật đái tháo đường typ 2 do chế độ dinh dưỡng.........................15 1.3. CÂY Ý DĨ..................................................................................................16 1.3.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................17 1.3.2. Phân bố..................................................................................................17 1.3.3. Thu hái ...................................................................................................18 1.3.4. Bộ phận dùng ........................................................................................18 1.3.5. Thành phần hóa học ..............................................................................18 1.3.6. Các nghiên cứu về tác dụng dược lý .....................................................18 1.3.6.1. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng dược lý của cây Ý dĩ ..........18 1.3.6.2. Các nghiên cứu trong nước liên quan đến tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ý dĩ ..............................................................................................19 Chương 2 .........................................................................................................21 ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......21 2.1. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ....................................22 2.1.1. Dược liệu nghiên cứu.............................................................................22 2.1.2. Động vật thí nghiệm ..............................................................................22 2.1.3. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu...............................................................23 2.1.3.1. Thiết bị, dụng cụ..................................................................................23 2.1.3.2. Hóa chất nghiên cứu ...........................................................................23 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................24 2.2.1. Phương pháp chiết xuất dược liệu và điều chế mẫu thử .....................24 2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột thực nghiệm ...............26 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng bình thường ..........................................................................................................................27 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột nhắt trắng tăng glucose huyết thực nghiệm bằng STZ...........................................................................27 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của HDCL trên chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm...................................................................................................28 2.2.3. Các kỹ thuật định lượng hóa sinh.........................................................30 2.2.3.1. Định lượng glucose huyết....................................................................30 2.2.3.2. Định lượng insulin huyết thanh ..........................................................31 2.2.3.3. Xác định hoạt độ enzym G6Pase gan ..................................................32 2.2.3.4. Đánh giá khả năng ức chế protein tyrosin phosphatase 1B in vitro của HDCL ...............................................................................................................34 2.2.4. Kỹ thuật xét nghiệm mô bệnh học ........................................................36 2.2.5. Xử lý số liệu............................................................................................36 Chương 3 .........................................................................................................37 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU..............................................................................37 3.1. Tác dụng của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ trên chuột nhắt trắng bình thường ................................................................. 37_Toc371443689 3.2. Tác dụng của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ trên chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bằng streptozocin...................................................38 3.2.1. Tác dụng trên mô hình tăng glucose huyết bởi STZ liều 200mg/kg ...38 3.2.2. Tác dụng trên mô hình tăng glucose huyết bởi STZ liều 150mg/kg..39 3.2.2.1. Kết quả định lượng glucose huyết .......................................................40 3.2.2.2. Kết quả định lượng insulin huyết thanh .............................................41 3.3. Kết quả ảnh hưởng của HDCL trên chuột cống trắng gây ĐTĐ typ 2 thực nghiệm .....................................................................................................45 3.3.1. Kết quả về glucose huyết .......................................................................45 3.3.2. Kết quả định lượng insulin huyết thanh...............................................46 3.3.3. Kết quả hoạt độ enzym G6Pase gan .....................................................47 3.3.4. Kết quả trên mô bệnh học tụy...............................................................48 3.4. Kết quả ảnh hưởng của HDCL trên khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 ....................................................................................51 3.5. Kết quả đánh giá khả năng ức chế PTP1B in vitro ................................53 Chương 4 .........................................................................................................55 BÀN LUẬN......................................................................................................55 4.1. VỀ TÁC DỤNG HẠ GLUCOSE HUYẾT CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ ..............................................................55 4.2. VỀ CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA PHÂN ĐOẠN CHIẾT CHLOROFORM THÂN CÂY Ý DĨ ..............................................................59 ĐỀ XUẤT.........................................................................................................68 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1 PHỤ LỤC 2 DANH MỤC CÁC CHỮ KÝ HIỆU VIẾT TẮT CTLA-4 Cytotoxic T lymphocyte antigen-4 DM: Dung môi DPP4 Dipeptidyl-peptidase-4) ĐTĐ: Đái tháo đường FFA: Free fatty acid (acid béo tự do) GLP: Glucagon like peptide GLUT: Glucose transporter (yếu tố vận chuyển glucose) HDCL: Hỗn dịch pha từ cắn phân đoạn chiết chloroform IR: Insulin receptor IRS: Insulin receptor substrate LHA: Human leucocyte antigen (kháng nguyên bạch cầu người) PĐC: Cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ PEPCK: Phosphoenol pyruvate carboxykinase pHPS: Para hydroxybenzen sulfonic acid PPAR: Peroxisome proliferator activator receptor PTP1B: Protein tyrosine phosphatase 1B SGLT1: Sodium-glucose linked transporter STZ: Streptozocin TNF: Tumor necrosis factor DANH MỤC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần ăn của chuột thí nghiệm.29 Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch insulin chuẩn………………...………31 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng đánh giá tác dụng trên PTP1B........................35 Bảng 3.1. Ảnh hưởng của HDCL đến glucose huyết của chuột nhắt trắng bình thường..................................................................................................................37 Bảng 3.2. Nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi STZ liều 200 mg/kg...............................................................................................38 Bảng 3.3. Nồng độ glucose huyết của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg…………………………………………………………………….40 Bảng 3.4. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột nhắt trắng tăng glucose huyết bởi STZ liều 150mg/kg…………………………………………………………………42 Bảng 3.5. Hoạt độ enzym G6Pase của chuột gây tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg………………………………………………………………………………44 Bảng 3.6. Nồng độ glucose huyết của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử…………………………………………………………………………………45 Bảng 3.7. Hoạt độ G6Pase gan của chuột ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử…………………………………………….……………...………………………..48 Bảng 3.8. Mức độ ức chế PTP1B của các nồng độ cắn phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ......................................................................................54 DANH MỤC HÌNH TRANG Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin…………………………….…..7 Hình 1.2. Hình ảnh cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi (L). var. ma-yuen Stapf……17 Hình 2.1. Hình ảnh thân cây Ý dĩ (Coix lachryma-jobi (L). var. ma-yuen Stapf)22 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình chiết xuất phân đoạn chloroform thân cây Ý dĩ…...25 Hình 2.3. Tóm tắt quy trình định lượng insulin………………………..………….32 Hình 3.1. Mức độ hạ glucose huyết của các lô chuột trên mô hình tăng glucose huyết bởi STZ liều 200 mg/kg………………………………………………………39 Hình 3.2. Mức độ hạ glucose huyết của các lô chuột nhắt trắng trên mô hình gây tăng glucose huyết bởi STZ liều 150 mg/kg……………………………….…….…41 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và nồng độ insulin……………………………………………….………………..........................42 Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang và lượng phospho vô cơ……………………………………..…………………………………..……........43 Hình 3.5. Nồng độ insulin huyết thanh của chuột cống bị ĐTĐ typ 2 sau 15 ngày uống mẫu thử………………………….………………………………………..….….46 Hình 3.6. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng âm, ( nhuộm HE x 400 lần)……………………………………………………………………………………..48 Hình 3.7. Ảnh vi thể tụy của lô thử (nhuộm HE x 400 lần)………………. ….…49 Hình 3.8. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô chứng dương (nhuộm HE x 400 lần).50 Hình 3.9. Ảnh vi thể tụy của chuột ở lô 4 (chuột bình thường ăn chế độ bình thường (nhuộm HE x 400 lần)……………………… ……………………………...51 Hình 3.10. Sự thay đổi nồng độ glucose huyết của chuột cống ĐTĐ typ 2 trong test dung nạp glucose…………………………………………………………………52 Hình 3.11. Khả năng dung nạp glucose của chuột cống ĐTĐ typ 2 sau 2 giờ uống mẫu thử.......................................................................................................53 Hình 4.1. Tiêu bản mô học tiểu đảo tụy của người bình thường, người bệnh béo phì không ĐTĐ, người bệnh ĐTĐ typ 2………………..………………………….61 ĐẶT VẤN ĐỀ Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh nội tiết đặc trưng bởi tình trạng tăng glucose huyết kèm theo nhiều biểu hiện rối loạn chuyển hoá. Hậu quả của sự tăng glucose huyết là những biến chứng nghiêm trọng có thể đe dọa đến tính mạng của người bệnh [1]. Theo nghiên cứu của Martin Shilink và cộng sự, năm 2010, số lượng bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ là 285 triệu người, chiếm 6,4% dân số thế giới và vẫn tiếp tục gia tăng mạnh [34]. Sự gia tăng đột biến về tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường hiện nay đang là một gánh nặng cho ngành y tế. Chi phí để quản lý, chăm sóc và điều trị bệnh rất tốn kém. Theo công bố của tổ chức y tế thế giới, chi phí trực tiếp mỗi năm cho bệnh nhân ĐTĐ ước tính khoảng 153- 286 tỷ đô la, thậm chí còn cao hơn thế, ước tính đến năm 2025, toàn bộ chi phí cho bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới là 213- 396 tỷ đô la, chiếm khoảng 7- 13% ngân sách chăm sóc sức khoẻ của thế giới [34]. Điều này sẽ gây khó khăn cho những nước đang phát triển, trong đó có Việt Nam. Mặt khác, các thuốc điều trị đái tháo đường có nguồn gốc tổng hợp hoá học thường kèm theo rất nhiều tác dụng không mong muốn, chi phí điều trị cao và người bệnh có xu hướng phải tăng liều sau một thời gian dài dùng thuốc [1]. Một câu hỏi được đặt ra là: Làm thế nào để đáp ứng được nhu cầu sử dụng thuốc ngày càng gia tăng và hạn chế được những biến chứng gây ra bởi bệnh đái tháo đường trong điều kiện kinh tế nước ta? Kế thừa nền y học cổ truyền của dân tộc để từ đó nghiên cứu, sản xuất ra các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược thiên nhiên hiệu quả và an toàn cao đang là hướng lựa chọn hợp lý để giải quyết vấn đề này [7]. Từ hướng nghiên cứu đó, đã có rất nhiều loại thảo dược được nghiên cứu và chứng minh tác dụng hạ glucose huyết như: Dây đau xương, Chè xanh, Thổ phục linh... [5], [6], [10]. 1 Cây Ý dĩ (Coix lachryma jobi) được biết đến như một loại thực phẩm và cũng là một vị thuốc [21]. Theo Y học cổ truyền, Ý dĩ có nhiều công dụng như: lợi sữa, kích thích tiêu hoá, chữa lỵ, viêm khớp, bồi bổ cơ thể...[21]. Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của Ý dĩ chủ yếu tập trung vào hạt [22]. Năm 2009, chúng tôi đã chứng minh được tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước của thân cây Ý dĩ trên chuột bị tăng glucose huyết thực nghiệm [3]. Khảo sát tiếp theo cho thấy tác dụng hạ glucose huyết của dịch chiết nước và dịch chiết ethanol không có sự khác biệt. Từ dịch chiết ethanol, chúng tôi tiến hành chiết xuất và thử tác dụng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết trên một mô hình thực nghiệm. Kết quả sơ bộ cho thấy phân đoạn chloroform có tác dụng hạ glucose huyết tốt nhất. Để tiếp tục nghiên cứu về tác dụng hạ glucose huyết và tìm hiểu cơ chế tác dụng hạ glucose huyết của thân cây Ý dĩ chúng tôi tiến hành đề tài "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết trên động vật thực nghiệm của phân đoạn chiết chloroform từ thân cây Ý dĩ" với 2 mục tiêu: 1. Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform thân cây Ý dĩ trên động vật thực nghiệm. 2. Bước đầu tìm hiểu cơ chế hạ glucose huyết của phân đoạn chiết chloroform từ thân cây Ý dĩ. 2 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. BỆNH ĐÁI THÁO ĐƯỜNG 1.1.1. Định nghĩa, phân loại và tiêu chuẩn chẩn đoán Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh rối loạn chuyển hoá do nhiều nguyên nhân khác nhau gây nên, đặc trưng của bệnh là tăng glucose huyết mạn tính cùng với rối loạn chuyển hoá hydratcarbon, lipid, protein... do thiếu insulin có kèm hoặc không kèm kháng insulin với các mức độ khác nhau. Hệ quả của tăng glucose huyết mạn tính là tổn thương nhiều cơ quan như: Mắt, thận, thần kinh [1] Theo phân loại của hiệp hội đái tháo đường Mỹ (ADA) năm 2011, ĐTĐ được chia thành 4 loại: ĐTĐ typ 1, ĐTĐ typ 2, ĐTĐ thai kỳ và các typ đặc biệt khác, trong đó thường hay gặp là ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2. Bệnh nhân được chẩn đoán xác định là mắc bệnh ĐTĐ khi [13]: - Hemoglobin (A1c) ≥ 6,5% hoặc - Nồng độ glucose huyết lúc đói  7,0 mmol /L ( 126mg/dL) - Có các triệu chứng của tăng glucose huyết và nồng độ glucose huyết ở thời điểm bất kỳ  11,1 mmol /L (200mg/dL) hoặc - Nồng độ glucose huyết ở thời điểm hai giờ sau nghiệm pháp dung nạp glucose đường uống  11,1 mmol/L (200mg/dL) Glucose huyết tăng nhưng không đáp ứng với tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ ở trên được xếp vào loại rối loạn glucose huyết lúc đói (IFG: impaired fasting glucose) hoặc rối loạn dung nạp glucose (IGT: impaired glucose tolerance), tùy thuộc vào loại xét nghiệm đánh giá đã dùng, bệnh nhân được chẩn đoán là tiền ĐTĐ khi: 3 + Glucose lúc đói từ 100mg/dL (5,6 mmol/L) đến 125 mg/dL (6,9mmol/L) (IFG) hoặc + Glucose ở thời điểm hai giờ sau khi uống 75 gam glucose, glucose huyết từ 140mg/dL (7,8 mmol/ L) đến 199mg/dL (11,0 mmol/ L) (IGT) hoặc HbA1c: 5,7 - 6,4 % [13]. 1.1.2. Cơ chế bệnh sinh 1.1.2.1. Bệnh sinh đái tháo đường typ 1 - ĐTĐ typ 1 là tình trạng thiếu insulin tuyệt đối do tế bào beta của đảo tụy bị tổn thương gây nên [13], [34]. Hầu hết các trường hợp ĐTĐ typ 1 là hậu quả của sự phá hủy tế bào beta đảo tụy tự miễn gây thiếu hụt không hồi phục nồng độ insulin trong máu [29]. - Cơ chế bệnh sinh Cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 đầu tiên phải kể đến di truyền có liên quan chặt chẽ với yếu tố kháng nguyên bạch cầu người (human leucocyte antigen -HLA). HLA là những phân tử nằm trên bề mặt các tế bào trình diện kháng nguyên. Hai tập hợp gen HLA có vai trò quan trọng đặc biệt là DR4-DQ8 và DR3-DQ2 được tìm thấy ở hơn 90% người bị ĐTĐ typ 1 [12]. Các cá thể có kiểu gen chứa 2 tập hợp gen này có nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1 cao nhất và khởi phát bệnh từ rất sớm. Có nhiều giả thiết cho rằng các tập hợp gen HLA nguy cơ cao nói trên có vai trò trình diện những đoạn peptid đặc hiệu của tiểu đảo tụy cho lympho T. Gen có vai trò quan trọng thứ hai trong các yếu tố di truyền liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1 là gen mã hóa insulin nằm trên nhiễm sắc thể số 11. Đầu 5’ của gen này có các đoạn polynucleotid lặp lại. Các nghiên cứu cho thấy độ dài của các đoạn lặp này sẽ quyết định nguy cơ mắc ĐTĐ typ 1. Các đoạn lặp có độ dài càng lớn thì nguy cơ mắc ĐTĐ càng thấp và ngược lại [12]. Trong thực tế, 4 nguyên nhân liên quan đến gen mã hóa insulin chiếm 10% tổng số các trường hợp nhạy cảm về di truyền của bệnh ĐTĐ typ 1 [32], [55]. Các nghiên cứu sàng lọc về di truyền học đã chỉ ra ít nhất 15 vị trí gen khác liên quan đến bệnh ĐTĐ typ 1 [25], trong đó, có 2 gen liên quan tới cơ chế hoạt hóa lympho T. Đó là gen mã hóa kháng nguyên lympho T gây độc tế bào (CTLA-4), thuộc nhiễm sắc thể số 2 và gen mã hóa lymphoid tyrosine phosphatase (PTPN22), được biểu thị đặc hiệu ở tế bào lympho T [38]. Yếu tố thứ hai phải kể đến trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ typ 1 là sự tác động của môi trường: Ở những cá thể có yếu tố di truyền nhạy cảm với bệnh như trên, khi gặp một số yếu tố môi trường nhất định, có thể khởi phát hoạt động của hệ miễn dịch, gây thâm nhiểm đảo tụy. Một trong những yếu tố môi trường được chứng minh có liên quan đến bệnh ĐTĐ là virus. Sở dĩ nhiễm virus được coi là nhân tố quan trọng trong các nguyên nhân gây ĐTĐ typ 1 ở người vì tỉ lệ phát bệnh tăng theo mùa, đặc biệt trong mùa có dịch cúm. Mặc khác, từ tiểu đảo tụy của một số bệnh nhân ĐTĐ typ 1 tử vong do nhiễm toan ceton, người ta đã phân lập được virus Coxsacki loại B4. Khi tiến hành gây nhiễm với virus Coxsacki ở động vật thí nhiệm cho thấy tế bào beta bị nhiễm virus và xuất hiện ĐTĐ ở những động vật này [27]. Cuối cùng là sự kết hợp của 3 yếu tố: di truyền, môi trường và miễn dịch: sau khi xuất hiện các yếu tố khởi phát của môi trường, hiện tượng thâm nhiễm đảo tụy ở các cá thể nhạy cảm về di truyền với bệnh bắt đầu xảy ra ở tế bào beta, từ đó sẽ tiếp tục dẫn đến quá trình phá hủy của toàn bộ tiểu đảo tụy. Tế bào beta có thể bị phá hủy bởi 2 cơ chế: Các lympho T hiệu ứng giải phóng các hạt chứa perforin vào tế bào đích. Cơ chế này cần có sự liên kết giữa receptor của lympho T đặc hiệu với tự kháng nguyên và phức hợp hòa hợp tổ chức của tế bào đích. 5 Cơ chế làm chết tế bào beta theo chương trình (apoptosis) thông qua Fas (CD95) và FasL (CD95L). Cơ chế này không cần sự liên kết giữa receptor của tế bào T với phức hợp hòa hợp tổ chức [32]. Sau khi “khởi động”, một loạt phản ứng miễn dịch sẽ diễn ra: các tiểu đảo tụy bị thâm nhiễm bởi các tế bào đơn nhân, các đại thực bào và tế bào lympho T độc (quá trình thâm nhiễm này được gọi là viêm tiểu đảo tụy). Ở giai đoạn này, trong huyết thanh người bệnh xuất hiện rất nhiều kháng thể kháng tiểu đảo tụy, đây gọi là giai đoạn tiền ĐTĐ typ 1. Tế bào beta bị tổn thương làm cho quá trình sản xuất insulin giảm dần, cho đến khi nồng độ insulin không đủ để duy trì nồng độ glucose trong máu ở mức bình thường, bệnh ĐTĐ thật sự sẽ xuất hiện [14]. 1.1.2.2. Bệnh sinh đái tháo đường typ 2 ĐTĐ typ 2 thuộc bệnh rối loạn chuyển với đặc hóa đặc điểm: có sự đề kháng insulin ở mô đích [1],[34] - Hiện tượng kháng insulin Kháng insulin là tình trạng giảm hoặc làm mất tính nhạy cảm của cơ quan đích với insulin [1] Insulin sau khi được tiết ra từ tế bào β đảo tụy, gắn với tiểu đơn vị α của insulin receptor (IR), thông tin sẽ được truyền qua màng tế bào tới vùng bào tương của các tiểu đơn vị β, vùng này có hoạt tính tyrosin kinase nội tại. Tiểu đơn vị β tự phosphoryl hoá tại các đuôi tyrosin gây ra hàng loạt các phản ứng trong tế bào thể hiện trong hình 1.1. 6 Cơ Gan Sự phosphoryl hóa serin Sự phosphoryl hóa tyroxin giảm IRS1 và IRS2 Sự phosphoryl hóa tyroxin Tăng tân tạo đường Nồng độ glucose FFA Nồng độ glucose FFA Hình 1.1. Con đường truyền tin nội bào của insulin ở gan và cơ [26] Con đường truyền tin nội bào bị ức chế sẽ dẫn đến hiện tượng kháng insulin. Trong thực tế, hiện tượng kháng insulin đã được chứng minh theo các cơ chế sau: Bất hoạt insulin receptor (IR) thông qua tăng hoạt tính của các enzym khử phosphoryl của tyrosin trong con đường truyền tin nội bào của insulin. Một số enzym đã được nghiên cứu như các protein tyrosin phosphatase (PTP) trong đó chủ yếu là PTP1B. PTP1B có trong lưới nội chất và trong tế bào mô đích của insulin với tác dụng tăng hoạt tính các enzym khử phosphoryl (ức chế quá trình phosphoryl hoá) của tyrosin trong IR và trong insulin receptor substrate (IRS) do đó giảm tính nhạy cảm của insulin trên tế bào [30], [15]. Sự gia tăng phosphoryl hoá các phân tử serin hoặc threonin không những làm giảm khả năng hoạt hoá IP3 mà còn làm giảm quá trình phosphoryl hoá 7 tyrosin của insulin receptor, tăng thoái hoá IRS do đó làm giảm tác dụng và tăng kháng insulin [17], [26]. Bất hoạt IP3 thông qua ức chế tiểu đơn vị điều hoà ngược p85 nằm trên IP3K: Sự thể hiện quá mức dạng hoạt động p100 trên PI3K hoặc kích thích quá mức Akt đều ức chế p85 làm giảm tác dụng sinh học của insulin [8], [49]. Yếu tố quan trọng làm gia tăng tình trạng kháng insulin là thừa cân, béo phì [64]. Theo Venables, khoảng 80% bệnh nhân ĐTĐ typ 2 liên quan đến béo phì và lối sống ít vận động [67]. Theo báo cáo của trung tâm kiểm soát và phòng bệnh Mỹ, khoảng 55% bệnh nhân ĐTĐ đồng thời mắc béo phì, 85% bệnh nhân ĐTĐ bị thừa cân. Một trong các nguyên nhân gây béo phì là do chế độ ăn nhiều chất béo và ít vận động. Ở những bệnh nhân béo phì, nồng độ acid béo tự do (FFA) tăng cao cạnh tranh với glucose trong chuyển hóa tại cơ vân, gia tăng FFA gây rối loạn sử dụng glucose ở ngoại biên. Sự gia tăng FFA gây đề kháng insulin. FFA có vai trò trong việc điều hòa, phóng thích glucose ở gan và góp phần làm kháng insulin ở gan trên người béo phì [34]. - Hiện tượng bù và sự suy kiệt tiếp theo của tế bào beta Tình trạng kháng insulin làm giảm tác dụng điều hòa chuyển hóa của insulin ở các mô đích, với biểu hiện rõ ràng nhất là sự tăng glucose huyết. Khi nồng độ glucose huyết cao sẽ kích thích tế bào beta của đảo tụy tăng tiết insulin. Bên cạnh đó, các yếu tố nguy cơ còn có tác động trực tiếp đến tế bào beta. Sự kết hợp của hai tác động này đôi khi dẫn đến hiện tượng kích thích quá mức tế bào beta, sau một thời gian sẽ dẫn đến sự suy giảm của tế bào beta. Ngoài ra, nồng độ FFA và glucose trong máu tăng làm tăng chuyển hoá tại ty thể, tăng các gốc tự do gây gia tăng tình trạng viêm. Mặt khác, tăng tổng hợp insulin ở tế bào beta gây ra hiện tượng stress lưới nội chất. Cả hai nguyên nhân này đều dẫn đến sự chết theo chương trình của tế bào beta. Ở giai đoạn này, sự sản xuất và bài tiết 8 insulin ở tụy giảm đi kèm theo hiện tượng kháng insulin sẵn có làm tình trạng mất kiểm soát nồng độ glucose huyết tiếp tục xấu đi kèm theo nhiều biến chứng nghiêm trọng [57]. 1.1.3. Hướng tác dụng của thuốc điều trị đái tháo đường Mục tiêu chung trong điều trị ĐTĐ là nhằm kiểm soát nồng độ glucose huyết trong giới hạn cho phép, ngăn ngừa và hạn chế biến chứng, góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống cho người bệnh. Để đạt được mục tiêu trên, các liệu trình điều trị ĐTĐ thường kết hợp giữa chế độ ăn uống, sinh hoạt, luyện tập hợp lý với việc dùng thuốc. Dưới đây là một số cơ chế chính trong điều trị ĐTĐ. 1.1.3.1. Insulin [1] Insulin là một hormon polypeptid do tế bào beta của đảo tụy tiết ra. Tác dụng chính của insulin lên sự ổn định nồng độ glucose huyết xảy ra sau khi insulin đã gắn với các thụ thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào của các mô nhạy cảm với insulin, đặc biệt là gan, cơ vân và mô mỡ. Insulin ức chế tạo glucose ở gan, tăng sử dụng glucose ở ngoại vi và do đó làm giảm nồng độ glucose trong máu. Insulin ngoại sinh được dùng để thay thế hoặc bổ sung cho sự thiếu hụt của insulin nội sinh trong ĐTĐ typ 1 và ĐTĐ typ 2 giai đoạn sau. 1.1.3.2. Các thuốc làm tăng cường lượng insulin Để bù đắp cho sự thiếu hụt bài tiết insulin hoặc khiếm khuyết trong hoạt động của insulin, bên cạnh việc điều trị bằng insulin ngoại sinh, một hướng điều trị phổ biến là làm tăng cường số lượng insulin nội sinh trong cơ thể, do tăng giải phóng insulin từ đảo tụy. Các cơ chế tác dụng của thuốc kích thích bài tiết insulin bao gồm: - Ức chế kênh K+ phụ thuộc ATP, làm giảm nồng độ K+, gây khử cực màng và mở kênh Ca2+ phụ thuộc điện thế, kết quả là làm tăng giải phóng insulin từ tế bào beta. Với cơ chế tác dụng đó, các thuốc này được dùng trong ĐTĐ typ 9 2, khi tụy vẫn còn khả năng bài tiết insulin [12]. Các thuốc này đã được đưa vào sử dụng trên lâm sàng từ những năm 50 của thế kỷ trước. Hiện có 2 nhóm thuốc đang được sử dụng rộng rãi trong điều trị ĐTĐ là nhóm sulfonylurea (gồm khoảng 20 thuốc chia thành 2 thế hệ) và nhóm meglitinid (gồm 2 thuốc đã được phép lưu hành là lepaglinid và neteglinid) [46]. - Một nhóm chất kích thích bài tiết insulin khác đang được chú ý là các incretin như glucagon-like peptide-1 (GLP1). Các peptid này có khả năng làm tăng bài tiết insulin sau bữa ăn thông qua receptor nằm trên màng tế bào beta [50]. Ngoài ra, GLP1 còn kích thích sinh tổng hợp insulin qua con đường AMPv-PKA. Nhược điểm chủ yếu của các peptid này là dễ bị phân huỷ, đặc biệt dưới tác dụng của enzym dipeptidyl peptidase 4 (DPP4). Để khắc phục nhược điểm này, các nhà khoa học đã tìm ra những dẫn chất tương tự cũng tác dụng trên receptor của GLP-1 nhưng bền vững hơn và có khả năng kháng lại DPP4, điển hình là exenatid. Thử nghiệm trên lâm sàng cho thấy exenatid có tác dụng kéo dài hơn và hiệu quả điều trị tốt hơn chính GLP-1. Một giải pháp khác cho người bệnh ĐTĐ theo hướng này là các thuốc ức chế DPP4, làm tăng thời gian tồn tại và tác dụng của GLP-1. Hiện nay, một số chất ức chế DPP4 đã được sử dụng rộng rãi cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2 là sitagliptin và vildagliptin [50]. - Một trong những hướng nghiên cứu mới thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học là các chất đối vận với ghrelin trên receptor GHSR [28]. Ghrelin là một peptid có 28 acid amin được bài tiết chủ yếu ở dạ dày và hoạt động trên receptor GHSR để kích thích bài tiết hormon tăng trởng GH và làm tăng cảm giác thèm ăn. Do đó, ban đầu các chất đối vận với ghrelin chủ yếu được nghiên cứu với tác dụng điều trị béo phì. Tuy nhiên, từ năm 2001, người ta đã phát hiện ra ảnh hưởng của ghrelin trên bài tiết insulin của tuyến tụy, cụ thể là ức chế bài tiết insulin ở cả người và động vật thí nghiệm. Nồng độ ghrelin và insulin trong máu 10