Tài liệu Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột rong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ---------- NGUYỄN PHƯỚC BẢO HOÀNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CELLULASE KỸ THUẬT TỪ XẠ KHUẨN VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM BỘT RONG THỰC PHẨM Chuyên ngành: Công nghệ sau thu hoạch Mã số: 60. 54. 10 LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS TRẦN THỊ LUYẾN Khánh Hòa - 2012 ương nghiên cứu Trang i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Luận văn này Trước hết tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến GS.TS Trần Thị Luyến đã định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, sửa luận văn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành cuốn luận văn này. Đồng thời, tôi cũng gửi xin cảm ơn quý Thầy, Cô trong Hội đồng bảo vệ đề cương thạc sĩ đã có những ý kiến đóng góp, lời khuyên quý báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Xin gửi lời cảm ơn quý Thầy Cô Viện công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng thí nghiệm Viện CNSH và Bộ môn Hóa - Vi sinh, Khoa Chế Biến, Trường Đại học Nha Trang đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian tôi thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc nhất của bản thân đến gia đình vì tình yêu thương, đã luôn ở bên cạnh động viên và ủng hộ trong suốt quá trình học cũng như thời gian tôi thực hiện đề tài. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc, tôi chân thành cảm ơn tất cả mọi người đã dành cho tôi tình cảm quý báu này! Xin trân trọng cảm ơn! Khánh Hòa, tháng 01 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Phước Bảo Hoàng i ương nghiên cứu Trang ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu độc lập của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của GS.TS Trần Thị Luyến. Các số liệu và kết quả nghiên cứu được nêu trong luận văn là trung thực, có trích dẫn nguồn gốc rõ ràng và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác. Khánh Hòa, tháng 03 năm 2012 Tác giả luận văn Nguyễn Phước Bảo Hoàng ii ương nghiên cứu Trang iii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... i LỜI CAM ĐOAN............................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC HÌNH ..........................................................................................vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................x MỞ ĐẦU ............................................................................................................1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................4 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn................................................................................4 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên..........................................................4 1.1.2. Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn...............................................5 1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn ..................................................................7 1.1.4. Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora.................8 1.2. Tổng quan enzyme cellulase .....................................................................10 1.2.1. Cơ chất của enzyme cellulase ..................................................................10 1.2.2. Phức hệ enzyme cellulase phân cắt cellulose............................................15 1.2.3. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase ............................................................................................................24 1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng enzyme cellulase..............................29 1.3.1. Lược sử nghiên cứu cellulase trên thế giới và trong nước ........................29 1.3.2. Các lĩnh vực ứng dụng cellulase ..............................................................32 1.4. Rong Mứt ..................................................................................................36 1.4.1. Giới thiệu chung ......................................................................................36 1.4.2. Hệ thống và đặc điểm phân loại rong Mứt ...............................................36 1.4.3. Tình hình chế biến và sử dụng thực phẩm được từ rong biển tại Việt Nam .......39 Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................43 2.1. Đối tượng và hóa chất...............................................................................43 2.1.1. Đối tượng ................................................................................................43 2.1.2. Hóa chất và thiết bị chuyên dụng .............................................................44 iii ương nghiên cứu Trang iv 2.2. Phương pháp nghiên cứu .........................................................................48 2.2.1. Phương pháp hóa sinh..............................................................................48 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật ........................................................49 2.2.3. Phương pháp đánh giá phân tích ..............................................................50 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ................................................................51 2.3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu chính .............................................................51 2.3.2. Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng xạ khuẩn và môi trường thích hợp sinh tổng hợp enzyme cellulase.................................................................................51 2.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần môi trường và điều kiện nuôi sinh enzyme ..............................................................................................................54 2.4. Bố trí thí nghiệm thu nhận C-CPE từ dịch nuôi cấy...............................57 2.4.1. Lựa chọn tác nhân kết tủa ........................................................................57 2.4.2. Lựa chọn nồng độ kết tủa.........................................................................58 2.4.3. Xác định tính chất lý hóa của C-CPE..........................................................58 2.5. Thử nghiệm sản xuất bột rong thủy phân từ rong Mứt Porphyra vietnamensis..59 2.6. Phương pháp xử lý số liệu ........................................................................64 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................65 3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao..65 3.1.1. Kết quả nghiên cứu lựa chọn chủng và môi trường lên men thích hợp................65 3.1.2. Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC-A-1787 ....................67 3.2. Xác định các điều kiện môi trường tối ưu sinh tổng hợp cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 ......................................................................72 3.2.1. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian...............72 3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ......................74 3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nguồn carbon ...............76 3.2.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn và nồng độ nitrogen ...................79 3.2.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy ..................................82 3.2.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy ban đầu .................83 3.2.7. Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme celluase có hoạt tính cao nhất theo quy hoạch Box – Behnken. ..........................................................85 iv ương nghiên cứu Trang v 3.3. Nghiên cứu tách chiết và xác định một số đặc tính của cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787 ..................................................................................................91 3.3.1. Kết quả nghiên cứu xác định tác nhân kết tủa C-DC ....................................91 3.3.2. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ tác nhân kết tủa .................................93 3.3.3. Nghiên cứu tính chất lý hóa của C-CPE cellulase.........................................94 3.4. Đề xuất quy trình thu chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ chủng xạ khuẩn chi Micromonospora VTCC-A-1787.....................................................95 3.5. Nghiên cứu sản xuất bột rong thực phẩm ...............................................96 3.5.1. Kết quả nghiên cứu xác định các thành phần chủ yếu trong rong Mứt Porphyra Vietnamensis......................................................................................97 3.5.2. Kết quả nghiên cứu sử dụng C-CPE của chủng Micromonospora VTCC-A1787 trong quá trình thủy phân ..........................................................................98 3.5.3. Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng bột rong ..........................................98 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................101 Kết luận...........................................................................................................101 Kiến nghị ........................................................................................................101 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................102 PHỤ LỤC.......................................................................................................106 Phụ lục 1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ PHÂN TÍCH..........................106 Phụ lục 2. BẢNG KẾT QUẢ CÁC THÍ NGHIỆM..........................................111 Phụ lục 3. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG ..................................114 Phụ lục 4. MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM .............................................116 v ương nghiên cứu Trang vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Hàm lượng cellulose của các loại thực vật .........................................13 Bảng 1.2. Phân nhóm VSV theo khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau ........25 Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng trong 100g rong Mứt ...................................39 Bảng 2.1. Nhóm xạ khuẩn chi Micromonospora-VTCC.....................................43 Bảng 2.2. Thành phần hóa học môi trường nuôi cấy ..........................................45 Bảng 2.3. Thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm .............................................47 Bảng 3.1. Định tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày............65 Bảng 3.2. Hoạt tính cellulase của 3 chủng Micromonospora sau 3 ngày ............67 Bảng 3.3. Mô tả đặc điểm sinh lý hóa Micromonospora VTCC-A-1787..............68 Bảng 3.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 ..............................................................77 Bảng 3.5. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen..........................................................80 Bảng 3.6. Các nhân tố và khoảng biến thiên của quy hoạch thực nghiệm...........86 Bảng 3.7. Các kết quả thí nghiệm của quy hoạch thực nghiệm...........................86 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tác nhân tủa khác nhau đên C-CPE cellulase Micromonospora VTCC-A-1787...................................................................................................92 Bảng 3.9. Thành phần hóa học trong rong Porphyra vietnamensis khô ..............97 Bảng 3.10. Kết quả của quá trình thủy phân rong Mứt bằng C-CPE ..................98 Bảng 3.11. Trạng thái cảm quan của bột rong thủy phân....................................99 Bảng 3.12. Thành phần dinh dưỡng cơ bản của bột rong ...................................99 Bảng 3.13. Kết quả kiểm nghiệm vi sinh vật bột rong thủy phân .....................100 vi ương nghiên cứu Trang vii DANH MỤC HÌNH Hình 1-1. Cấu trúc của xạ khuẩn..........................................................................5 Hình 1-2. Cấu trúc cellulose trong tế bào thực vật .............................................11 Hình 1-3. Cấu trúc không gian (a) và cấu trúc phân tử cellulose (b)...................11 Hình 1-4. Liên kết β-1,4 glucoside trong mạch cellulose ...................................12 Hình 1-5. Liên kết hydro giữa các sợi cellulose .................................................12 Hình 1-6. Cơ chế hoạt động của Exo-glucanase.................................................16 Hình 1-7. Cơ chế hoạt động của Endoglucanase ................................................16 Hình 1-8. Cơ chế hoạt động của β-glucosidase ..................................................17 Hình 1-9. Mô hình phân hủy cellulose tinh thể ..................................................17 Hình 1-10. Cơ chế tác dụng của hệ enzyme cellulase lên cellulose ....................19 Hình 1-11. Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase..................20 Hình 1-12. Cơ chế thủy phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) .................21 Hình 1-13. Các loại rong Mứt phổ biến tại Việt Nam ........................................37 Hình 2-1. Các chủng xạ khuẩn Micromonospora VTCC....................................43 Hình 2-2. Hình dáng rong Mứt Porphyra vietnamensis......................................44 Hình 2-3. Rong Mứt Porphyra vietnamensis tươi ..............................................44 Hình 2-4. Các nguyên liệu bổ sung vào môi trường nuôi cấy.............................45 Hình 2-5. Quá trình định tính cellulase ..............................................................48 Hình 2-6. Đường chuẩn glucose theo phương pháp so màu ...............................49 Hình 2.7. Mẫu rong mứt tươi Porphyra vietnamensis ........................................61 Hình 2.8. Mẫu rong Mứt Porphyra vietnamensis khô sau khi xử lý ...................61 Hình 2.9. Mẫu rong ngâm xử lý CH3COOH 1% ................................................62 Hình 2.10. Bột rong Mứt nguyên liệu ................................................................63 Hình 3-1. Vòng phân giải cơ chất của chủng Micromonospora sau 3 ngày ........66 Hình 3-2. Khuẩn lạc Micromonospora VTCC-A-1787 ......................................67 Hình 3-3. Khả năng lên men đường của Micromonospora VTCC-A-1787..........68 Hình 3-4. Đường cong sinh trưởng của Micromonospora VTCC-A-1787..........69 Hình 3-5. Ảnh hưởng của chế độ nuôi cấy đến hoạt tính cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 ...................................................................................................71 vii ương nghiên cứu Trang viii Hình 3-6. Vòng phân giải cơ chất CMC theo thời gian ......................................72 Hình 3-7. Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase theo thời gian của chủng Micromonospora VTCC-A-1787.......................................................................73 Hình 3-8. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất CMC đến kích thước vòng phân giải .....74 Hình 3-9. Ảnh hưởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 ........................................75 Hình 3-10. Ảnh hưởng của nguồn carbon đến vòng phân giải CMC...................76 Hình 3-11. Ảnh hưởng của nồng độ bã mía đến hoạt tính enzyme cellulase của chủng MicromonosporaVTCC-A-1787 ..............................................................78 Hình 3-12. Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến vòng phân giải CMC................80 Hình 3-13. Ảnh hưởng của nồng độ bột cá đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787.........................................81 Hình 3-14. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến vòng phân giải cơ chất ................82 Hình 3-15. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 ........................................83 Hình 3-16. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ban đầu đến vòng phân giải cơ chất CMC.....................................................................................................84 Hình 3-17. Ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến khả năng tổng hợp enzyme chủng MicromonosporaVTCC-A- 1787 ................................................84 Hình 3-18a. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở nồng độ pH 6,5 với nhiệt độ và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D ........................................................................87 Hình 3-18b. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzymepH 6,5 với nhiệt độ và thời gian nuôi cấy dạng mặt phẳng ...........................................................................88 Hình 3-19a. Bề mặt đáp ứng của hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH và thời gian nuôi cấy ở dạng 3D. .......................................................................88 Hình 3-19b. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở thời gian là 132 giờ với pH và nhiệt độ ở dạng mặt phẳng.................................................................................89 Hình 3-20a. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzymeở nhiệt đô 32,50C với pH và thời gian ở dạng 3D ..................................................................................................89 viii ương nghiên cứu Trang ix Hình 3-20b. Bề mặt đáp ứng hoạt tính enzyme ở nhiệt đô 32,50C với pH và thời gian ở dạng mặt phẳng.......................................................................................90 Hình 3-21. C-DC cellulase của Micromonospora VTCC-A-1787.......................91 Hình 3-22. Vòng phân giải cơ chất CMC của C-DC cellulase của chủng Micromonospora VTCC-A-1787 theo quy trình tối ưu.......................................91 Hình 3-23. Kết quả đường kính thủy phân trước và sau khi kết tủa....................92 Hình 3-24. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt độ enzyme ......................93 Hình 3-25. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt độ enzyme ....................................94 Hình 3-26. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzyme...........................................95 ix ương nghiên cứu Trang x DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Cel Cellulose CMC Carboxyl methyl cellulose C-DC Cellulase dịch chiết C-CPE Cellulase chế phẩm enzyme kỹ thuật CS Cộng sự DC Dịch chiết DD Dung dịch ĐC Đối chứng IU International Unit (Đơn vị hoạt độ) MT Môi trường OD Optical density (Mật độ quang) VSV Vi sinh vật XK Xạ khuẩn V/v Volume/volume W/v Weight/volume x ương nghiên cứu Trang 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Dưới góc độ y học, rong biển là nguồn thực phẩm tự nhiên quý giá giàu chất dinh dưỡng, có tác dụng đến sức khỏe và sự ổn định của cơ thể con người. Hiện nay, nhu cầu sử dụng rong biển làm thực phẩm trên thế giới ngày càng tăng và phổ biến. Tuy nhiên vấn đề khai thác và chế biến rong biển ở Việt Nam còn nhiều mới mẻ và hạn chế, không sử dụng hết sản lượng cũng như hiệu quả lợi ích mà rong đem lại. Hơn nữa, các sản phẩm từ rong biển ở nước ta chưa nhiều, chưa thực sự được chú ý và phổ biến, rất ít người dân biết đến loại thực phẩm đặc biệt này, đây đang là một vấn đề còn đang bỏ ngỏ [21]. Ngoài các thành phần dinh dưỡng cơ bản và hàm lượng acid amin quan trọng vốn có, rong biển còn chứa lượng cel lớn mà cơ thể con người không có khả năng tiêu hóa. Cel là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào thực vật, là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy cel bằng các tác nhân lý hóa (acid, bazơ mạnh) gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hưởng đến tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp và không được khuyến khích trong chế biến thực phẩm ngày nay. Chính vì vậy mà yêu cầu đặt ra là phải thay thế bằng các phương pháp an toàn hơn. Để giải quyết vấn đề này, chúng tôi nhận thấy có thể ứng dụng các chế phẩm vi sinh vật có hoạt tính cellulase tác động một cách đặc hiệu lên cơ chất cel, đây là loại enzyme hiện nay đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm. Cellulase là một phức hợp enzyme bao gồm 3 loại enzyme thủy phân cel. Các enzyme này kết hợp với nhau và tham gia phân cắt ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong phân tử cel và một số loại polysaccharide tương tự khác tạo thành glucose và một số đường chức năng như Oligossacharide. Các nghiên cứu về Oligossacharide trong thực phẩm và dinh dưỡng đang là vấn đề quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Đây là nhóm thực phẩm có giá trị dinh dưỡng và mức năng lượng thấp, nhưng lại chứa các hoạt chất cải thiện chất lượng sản phẩm và tăng cường sức khỏe con người [42, 39]. 1 ương nghiên cứu Trang 2 Cellulase được sinh tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật và chủ yếu vẫn là từ VSV như vi khuẩn (Pseudomonas fluorescens, Cllulosemanas), nấm (Trichoderma viride, Aspergillus niger) và xạ khuẩn (Actinomycetes). Trong những năm gần đây, nhóm XK đang được các nhà sinh vật thế giới quan tâm nghiên cứu dùng để sản xuất kháng sinh và enzyme gồm 2 chi là Streptomyces và Micromonospora. Việc hướng đến sử dụng chế phẩm từ VSV trong sản xuất thực phẩm ngày nay ngày càng rộng rãi, đây là một hướng đi mới tất yếu và hiệu quả trong điều kiện các ngành sản xuất truyền thống bằng phương pháp hóa học đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng [17]. Trong sản xuất và đời sống, enzyme nói chung và cellulase nói riêng được sử dụng ngày càng phổ biến, sản lượng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trường thế giới tăng 20÷30% mỗi năm. Enzyme và những chế phẩm có liên quan được sử dụng trong các ngành công nghiệp nhẹ, nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm ở Việt Nam hiện nay chủ yếu được nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao mặc dù nước ta có nguồn phế phẩm nông nghiệp dùng làm nguyên liệu để sản xuất enzyme cellulase là rất phong phú, dễ kiếm, rẻ tiền như: mạt cưa, mùn gỗ, mạt dừa, rơm. Bên cạnh đó, ở Việt Nam nhóm XK chi Micromonospora được nghiên cứu từ những năm 90 nhưng kết quả còn rất hạn chế. Do đó, với mong muốn được tiếp tục tìm hiểu về đặc tính phân loại và khả năng sinh tổng hợp enzyme của nhóm XK chi Micromonospora, góp phần nghiên cứu sản xuất các chế phẩm enzyme hoạt tính cao có nguồn gốc tự nhiên, tiếp tục nghiên cứu để sản xuất được cellulase có giá thành rẻ đáp ứng nhu cầu thị trường và các loại thực phẩm có các thành phần chứa hoạt tính sinh học nhằm gia tăng giá trị rong biển Việt Nam, đề tài: “Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn và ứng dụng sản xuất thử nghiệm bột rong thực phẩm” là cần thiết. 2. Mục đích nghiên cứu của đề tài Thăm dò các điều kiện thích hợp để khai thác và thu nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thuật từ XK chi Micromonospora. Sau đó sử dụng C-CPE này thủy phân rong Porphyra Việt Nam để sản xuất bột rong thực phẩm. 2 ương nghiên cứu Trang 3 3. Nội dung nghiên cứu của đề tài - Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn Micromonospora thích hợp và nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase có hoạt tính cao. - Nghiên cứu phương pháp thích hợp để thu nhận dịch chiết và chế phẩm enzyme kỹ thuật ở quy mô phòng thí nghiệm. - Bước đầu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme trên thủy phân rong mứt sản xuất bột rong thực phẩm và đánh giá chất lượng của bột rong này. 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của luận văn góp phần thêm những hiểu biết về đặc tính enzyme cellulase sản xuất từ XK được phân lập tại Việt Nam và ứng dụng của enzyme này trong chế biến thực phẩm. - Tạo ra dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho sinh viên và cán bộ kỹ thuật, bổ sung vào các tài liệu phục vụ cho giảng dạy ngành Công nghệ Thực phẩm, ngành Công nghệ sinh học. 5. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Bước đầu nghiên cứu sử dụng enzyme chiết rút từ XK Micromonospora để thủy phân rong biển và thu chế phẩm là bột rong. Kết quả thu được là cơ sở để đánh giá hiệu quả và khả năng ứng dụng của enzyme cellulase VSV. Từ đó cải thiện, nâng cao chất lượng và góp phần tìm ra hướng giải quyết mới mang lại hiệu quả kinh tế cho enzyme sản xuất từ VSV Việt Nam và cho rong biển Việt Nam. 3 ương nghiên cứu Trang 4 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về xạ khuẩn 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) hay còn gọi là nấm tia, theo từ cổ Hy Lạp “Acti” có nghĩa là tia, thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Theo Agre và một số tác giả khác (1969) thì sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Ngay từ những năm đầu của thế kỷ XX, Mike đã phân lập được các chủng XK ưa nhiệt thuần khiết trong quá trình phân hủy rác, bã, rơm rạ, cỏ khô. Rabinowitch (1895) và Tsiklinsky (1903) đã phân lập được xạ khuẩn ưa nhiệt từ phân. Năm 1912, Noack phân lập được chúng từ cỏ khô. Năm 1912, Gilbert cũng đã phân lập được XK ưa nhiệt từ nhiều cơ chất khác nhau như không khí, cát, sa mạc, than bùn, đặc biệt là trong ruột người và nước cống thải. Tendler (1959) và Burkholder (1960) đã phân lập được hơn 100 chủng XK ưa nhiệt thuộc 2 giống Thermomonosprora và Streptomyces từ các mẫu đất khác nhau của các nước Mỹ, Pháp, Tây Ban Nha, Ý, Pêru, Chilê. Kosmather (1953, 1962) đã phân lập được nhiều chủng XK ưa nhiệt từ các vùng Liên Xô cũ như miền Bắc, miền Tây, các vùng núi cao như Capcazơ, Palmia… Waksman (1959) khi phân lập và tuyển chọn XK ưa nhiệt đã cho thấy chúng hầu như có mặt trong tất cả các loại đất và ở các mùa trong năm. Ngay ở vùng ôn đới nhiều loại đất cũng thường có 10.000÷15.000 mầm XK trong 1 gam đất khô. Vào mùa đông số lượng XK ưa nhiệt chỉ chiếm khoảng 10÷15% so với tổng vsv ưa nhiệt, nhưng đến mùa hè thì số lượng chúng tăng lên đến 70÷90%. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000÷2.400.000 mầm XK, chiếm 9÷45% tổng số VSV [45]. Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ, độ pH môi trường. XK được chia làm 2 loại là ưa ấm, phát triển và sinh trưởng ở nhiệt độ từ 25÷45oC và ưa nhiệt từ 50÷70oC, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và 4 ương nghiên cứu Trang 5 kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8÷7,5. Ở các vùng đất khô chúng có thể chiếm 25% tổng số hệ vsv đất. Trong XK, chủng Streptomyces và Micromonospora chiếm tỷ lệ lớn, đây là chủng có khả năng phân hủy cellulose mạnh và là nhóm vsv amôn hóa, có khả năng tiết kháng sinh vào môi trường đất. 1.1.2. Cấu tạo và đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Về kích thước thì XK tương đối nhỏ bé và tương đương với vi khuẩn. XK có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập [6, 22]. Hình 1-1. Cấu trúc của xạ khuẩn Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới dày 10-20nm, có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp và không có chứa cel hay chitin nhưng chứa nhiều enzyme tham gia vào quá trình trao đổi và vận chuyển chất qua màng tế bào. Dưới thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein, có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn chưa có nhân phân hóa rõ rệt (không có cấu trúc điển hình), nhân thuộc loại đơn giản, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng nhân. 5 ương nghiên cứu Trang 6  Về đặc điểm hình thái - Khuẩn lạc: Có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Hình dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm. Khuẩn lạc XK có màu sắc khác nhau: da cam, vàng, nâu tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh [6]. - Khuẩn ty: Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là khuẩn ty cơ chất với chức năng dinh dưỡng là chủ yếu, tùy thuộc vào từng loài mà mức độ đâm sâu vào môi trường thạch khác nhau. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh với chức năng chủ yếu là sinh sản. Đường kính khuẩn ty XK thay đổi trong khoảng 0,2÷0,1µm đến 2÷3µm [23]. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào XK hay được tiết ra trong môi trường.  Về cách thức sinh sản - Sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi: Mỗi đoạn sợi xạ khuẩn khi đứt ra đều có khả năng nảy chồi tạo ra hệ sợi XK. - Bằng sự nãy chồi phân nhánh: Trên bề mặt XK xuất hiện những mấu lồi, những mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi lớn lên thành nhánh mới. - Phân cắt trực tiếp tế bào. Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử. Cuống sinh bào tử ở các loài XK khác nhau thì có kích thước và hình dạng khác nhau. Đây là cơ quan sinh sản đặc trưng của XK, đặc điểm hình dạng cuốn sinh bào tử là một trong những tiêu chuẩn quan trọng nhất phân loại XK. Cuốn sinh bào tử của XK có loài có cấu trúc theo dạng thẳng hoặc hình lượn sóng (RF), có loài dạng lò xo (S) hay xoắn ốc. Sắp xếp của các cuốn sinh bào tử cũng khác nhau, có thể sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc 6 ương nghiên cứu Trang 7 vòng hoặc từng chùm. Bào tử được hình thành từ cuốn sinh bào có thể theo 2 kiểu kết đoạn hoặc cắt khúc. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm [6]. 1.1.3. Ý nghĩa thực tiễn của xạ khuẩn XK là nhóm vi sinh vật dị dưỡng phân bố rộng rãi. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của XK là khả năng hình thành chất kháng sinh và tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá, phân giải nhiều hợp chất hữu cơ trong đất, nước như cel, tinh bột. Dùng để sản xuất nhiều enzyme như protease, amylase, cellulase, một số acid amin và acid hữu cơ. Khả năng đồng hóa các chất ở các loài hay chủng XK khác nhau là khác nhau. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do XK sinh ra, 60÷70% XK được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh [23]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại XK hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium. Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Bên cạnh khả năng tổng hợp nhiều chất kháng sinh quan trọng, các nhà sinh học còn chú ý đến một đặc tính khác của XK là năng lực phân giải một số polysaccharide bền vững, điển hình là cel. Đây là nguồn hữu cơ tự nhiên vô tận do cây xanh quang hợp và một phần tồn tại trong các phế phụ phẩm nông nghiệp như bã mía, lõi ngô, vỏ lạc, xơ bông, cám gạo, mùn cưa. Năm 1930, Jensen đã phân lập được nhiều loại trong giống Micromonospora có khả năng phân giải cellulose. Năm 1946, Hungate đã phân lập từ ruột mối một loại thuộc Micromonospora có khả năng phân giải cel đặt tên là Micmonospora propiocini. Cho đến nay, khả năng phân giải cel của XK đã được nhiều nhà nghiên cứu chú ý và đã đem lại nhiều ứng dụng trong thực tiễn. 7 ương nghiên cứu Trang 8 1.1.4. Hệ thống và đặc điểm phân loại xạ khuẩn chi Micromonospora Theo một số tài liệu [31,37,41,45] vị trí phân loại của Micromonospora được xếp như sau: Giới (Kingdom) Bacteria Actinobacteria Ngành (Phylum) Actynomycetes Lớp (Class) Actinomycetales Bộ (Order) Micromonosporaceae Họ (Family) Chi (Genus) Micromonospora 1.1.4.1. Khả năng phân bố Mỗi loại VSV có sự phân bố trong tự nhiên là khác nhau, ngay cả khi chúng cùng một chủng loại. Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy Micromonospora có rất ít trong đất, chỉ chiếm 1,2% Micromonospora trong khi phân lập Actinomycetes. Szabo’Zsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ 50÷60%. Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của Micromonospora. Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000 Micromonospora. Nước hồ có rất ít Actinomycetes nhưng có đến 76% là Micromonospora, trong khi đó Streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy, 1941). Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nước biển và đất phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong các phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển. 1.1.4.2. Đặc điểm hình thái của Micromonospora - Micromonospora có hệ sợi sinh trưởng mạnh, khuẩn ty cơ chất phân nhánh, thường không có khuẩn ty khí sinh, có vách ngăn, bắt màu Gram dương (+), không nhuộm kháng acid. Đường kính khuẩn ty trung bình từ 0,2 đến 0,6µm. - Bào tử không có khả năng di động, bào tử riêng lẻ không cuống hoặc có cuống nằm phân tán hoặc thành từng đám trên hệ sợi cơ chất phân nhánh. Thành 8 ương nghiên cứu Trang 9 bào tử dày tạo sự khúc xạ ánh sáng mạnh. Bào tử hình tròn, oval, hoặc các dạng khác nhau, bề mặt bào tử nhẵn, có gai hoặc xù xì. - Khuẩn lạc của Micromonospora có dạng hình cầu nhỏ nhô lên trên bề mặt môi trường. Trong những ngày phát triển đầu tiên khuẩn lạc của các loài rất giống nhau có màu da cam nhạt đến da cam. Khi nuôi cấy già có thể tạo sắc tố đặc trưng tuỳ thuộc vào môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy. Khi hình thành bào tử khuẩn lạc có màu nâu hoặc màu đen, chúng có thể khô hoặc trở thành ướt và nhầy. Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính chất thành tế bào kiểu II của nó. 1.1.4.3. Đặc tính sinh lý, sinh hoá - Màu và hình dạng của khuẩn lạc không được coi là những đặc tính cơ bản, vì màu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang da cam, hồng, đỏ, nâu và đen. - Có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ từ 20÷40oC, nhưng không phát triển trên 50oC. - Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ khí. Hóa dị dưỡng hữu cơ, chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác nhau. Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH dưới 6,0. - Bào tử của Micromonospora ngược lại với bào tử Streptomyces, chịu được nhiệt độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nước 60oC trong 90 phút, nhưng chết ở 90oC trong 15 phút. Bào tử chịu được pH từ 6,0÷8,0, thường bị mẫn cảm ở pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi hữu cơ nồng độ không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton. 1.1.4.4. Ứng dụng trên quần thể Micromonospora Các Micromonospora có các đặc tính sinh lý, sinh hoá như phân hủy cel, kitin, lignin, xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein, đóng vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ và trong sự mùn hoá. Ngoài ra Micromonospora có khả năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về mặt hoá học như: amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid [44]. 9