Tài liệu Phát triển bộ kit phát hiện vi khuẩn salmonella hiện diện trong thực phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÁT TRIỂN BỘ KIT PHÁT HIỆN VI KHUẨN SALMONELLA HIỆN DIỆN TRONG THỰC PHẨM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ths. TRẦN THỊ XUÂN MAI SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN THỊ HOÀNG YẾN MSSV:3064433 LỚP:CNSH K32 Cần Thơ, Tháng 5/2010 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) Trần Thị Xuân Mai SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Trần Thị Hoàng Yến DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… …………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2010 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của quí thầy cô và bạn bè:  Cô Trần Thị Xuân Mai, bộ môn Công Nghệ Gen Thực Vật – Viện Nghiên Cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình quan tâm, giúp đỡ, chia sẻ, động viên và truyền đạt những kiến thức quí báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài cũng như trong những năm học vừa qua.  Cô Võ Thị Thanh Phương – Khoa Sư Phạm – Trường Đại Học Cần Thơ, Cô Nguyễn Thị Liên và Cô Nguyễn Thị Pha, bộ môn Công Nghệ Gen Thực Vật – Viện Nghiên Cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.  Thầy Trần Nguyên Tuấn - Viện Nghiên Cứu và phát triển Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Cần Thơ đã quan tâm, chia sẻ, động viên chúng tôi trong các năm học vừa qua.  Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học – khóa 32 đã chia sẻ, động viên và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt những năm học đại học. TRẦN THỊ HOÀNG YẾN Cần Thơ, ngày 3 tháng 5 năm 2010 TÓM TẮT Vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella spp. gây ra đã rất phổ biến trên thế giới. Do vậy việc sản xuất bộ Kit phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella là nhu cầu cần thiết cho các công ty, nhà máy sản xuất thực phẩm, thủy, hải sản… nhằm bảo đảm an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng. Trong nghiên cứu này, tiến hành thực hiện những phương pháp phát triển bộ Kit sao cho làm tối ưu nhất hiệu quả sử dụng bộ Kit. Sử dụng phương pháp trích nhanh trích DNA của Salmonella bằng xử lí nhiệt trong 20 phút để tiết kiệm thời gian và hóa chất trích, khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính của hai loại hỗn hợp thành phần phản ứng PCR (Mix): Mix có thêm Taq DNA polymerase và Mix không thêm Taq DNA polymerase, kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trên các mẫu thực phẩm tại địa bàn thành phố Cần Thơ bằng bộ Kit tự sản xuất Từ khóa: Salmonella, PCR, Salmonella PCR Kit. i MỤC LỤC Trang KÝ TÊN HỘI ĐỒNG ......................................................................................... LỜI CẢM TẠ...................................................................................................... TÓM TẮT ..........................................................................................................i MỤC LỤC.........................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG .......................................................................................vi DANH SÁCH HÌNH .......................................................................................vii TỪ VIẾT TẮT .................................................................................................ix CHƯƠNG 1- GIỚI THIỆU..............................................................................1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................1 1.2. Mục tiêu đề tài.............................................................................................2 CHƯƠNG 2 - LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .........................................................3 I. Giới thiệu về Salmonella............................................................................... .3 1. Đặc điểm chung của Salmonella............................................................. .3 1.1. Hình thái............................................................................................. .3 1.2. Tính chất sinh hóa.............................................................................. .4 2. Phân loại Salmonella .............................................................................. .4 2.1.Kháng nguyên O .................................................................................. .4 2.2.Kháng nguyên H .................................................................................. .5 2.3.Kháng nguyên Vi................................................................................. .5 II – Con đường xâm nhiễm Salmonella và triệu chứng nhiễm bệnh ............. .6 III – Các phương pháp kiểm nghiệm Salmonella .......................................... .8 1. Phương pháp cấy máu............................................................................ .8 2. Phương pháp chuẩn đoán huyết thanh bằng xét nghiệm Widal .......... .9 3. Phương pháp giám định tính chất sinh hóa .......................................... .9 3.1. Làm phong phú vi khuẩn trong mẫu thử.............................................. .9 ii 3.2. Giám định tính chất sinh hóa............................................................... .9 4. Phương pháp kiểm nghiệm Western blot.............................................. .11 5. Phương pháp thực hiện thử nghiệm ELISA.......................................... .11 6. Phương pháp PCR.................................................................................. .11 6.1. Tiến hành phản ứng ............................................................................ .11 6.2. Sắc ký gel agarose............................................................................... .13 6.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR ...................................... .13 6.4. Kỹ thuật PCR đa thành phần ............................................................... .14 IV - Gen mục tiêu để xác định Salmonella..................................................... .14 V – Bộ Kit PCR dùng trong chẩn đoán vi khuẩn Salmonella........................ .15 1. Mục đích sử dụng ..................................................................................... .15 2. Nguyên tắc của phương pháp PCR ........................................................... .15 3. Thành phần cần thiết trong một bộ Kit PCR Salmonella ........................... .16 4. Cách bảo quản bộ Kit ............................................................................... .16 5. Các thiết bị và nguyên vật liệu cần thiết không được cung cấp trong bộ Kit ........................................................................................ .16 6. Những điều cần chú ý khi sử dụng bộ PCR Salmonella Kit ...................... .17 7. Qui trình thực hiện phản ứng PCR............................................................ .18 VI – Một số bộ Kit phổ biến được dùng trong chẩn đoán Salmonella .......... .19 1. Loopamp® Salmonella Detection Kit....................................................... .19 2. Foodproof® Salmonella Detection Kit ..................................................... .19 3. Takara's Salmonella One Step PCR Screening Kit Ver. 2.0 ...................... .20 4. Bộ Kit xét nghiệm Salmonella typhi trong huyết thanh người để chẩn đoán bệnh thương hàn......................................................................................................... .21 CHƯƠNG 3 - PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................................................................... .22 I – Địa điểm và thời gian ................................................................................. .22 II – Phương tiện thí nghiệm ............................................................................ .22 1. Thiết bị..................................................................................................... .22 iii 2. Hóa chất ................................................................................................... .23 3. Nguyên vật liệu ........................................................................................ .23 III – Phương pháp nghiên cứu ........................................................................ .24 1. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... .24 2. Ly trích DNA .......................................................................................... .24 2.1. Qui trình trích DNA bằng Phenol – Chloroform.................................. .24 2.2. Qui trình trích nhanh DNA trong 20 phút bằng xử lý nhiệt.................. .25 3. Thiết kế các đoạn mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella............................. .26 4. Kỹ thuật PCR ........................................................................................ .27 5. Kỹ thuật PCR đa thành phần ................................................................ .28 6. Điện di .................................................................................................... .28 IV – Bố trí thí nghiệm...................................................................................... .29 1. Thí nghiệm 1: So sánh hiệu quả phát hiện Salmonella bằng 2 phương pháp trích DNA: trích DNA bằng Chloroform và trích nhanh DNA ................................... .29 2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính của hai loại Mix PCR: Mix có thêm Taq DNA polymerase và Mix không thêm Taq DNA polymerase...30 3. Thí nghiệm 3: Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trên các mẫu thực phẩm tại địa bàn thành phố Cần Thơ bằng bộ Kit tự sản xuất............................. .30 CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ - THẢO LUẬN...................................................... .31 1. Thí nghiệm 1: So sánh hiệu quả phát hiện Salmonella bằng 2 phương pháp DNA: trích DNA bằng Chloroform và trích nhanh DNA ................................... .31 2. Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính của hai loại Mix PCR: Mix có thêm Taq DNA polymerase và Mix không thêm Taq DNA polymerase...32 a. Mix có thêm Taq DNA polymerase (Mix+Taq)....................................... .32 b. Mix không pha Taq (Mix-Taq) .............................................................. .35 3. Thí nghiệm 3: Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trên các mẫu thực phẩm tại địa bàn thành phố Cần Thơ bằng bộ Kit tự sản xuất............................. .40 CHƯƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. .41 I – KẾT LUẬN................................................................................................. .41 iv II – KIẾN NGHỊ .............................................................................................. .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... .42 PHỤ LỤC......................................................................................................... …. Phụ lục 1: Thành phần các môi trường nuôi vi khuẩn Salmonella 1. Thành phần môi trường Buffered Petone Water ( BPW) 2. Môi trường Rappaport – Vassiliadis R10 Broth ( 1L) ( RV) 3. Môi trường Tetrathionate Broth (1L), (TT) Phụ lục 2: Các hình ảnh về một số thiết bị chủ yếu phụ vụ cho đề tài v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Nồng độ (%) Agarose ........................................................... ………… 13 Bảng 2: Thành phần bộ Kit PCR........................................................ ………….16 Bảng 3: Thành phần bộ Kit Foodproof® Salmonella ......................... ………… 20 Bảng 4: Thành phần của 1 phản ứng PCR với cặp mồi InvA.............. ………… 27 Bảng 5: Thành phần cho 1 phản ứng PCR đa thành phần ................... ………… 28 vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Salmonella paratyphi ........................................................... ………….. 3 Hình 2: Salmonella typhimurium ....................................................... ………….. 3 Hình 3: Salmonella enterica............................................................... ………….. 3 Hình 4: Con đường xâm nhiễm của Salmonella ................................. …………...6 Hình 5: Sự xâm nhiễm vào biểu mô ruột của Salmonella ................... …………...7 Hình 6: Mô hình phản ứng PCR......................................................... …………..12 Hình 7: Sơ đồ qui trình thực hiện phản ứng PCR trong bộ Kit chẩn đoán Salmonella .......................................................................................................... …………..18 Hình 8: Salmonella PCR Kit.............................................................. …………..19 Hình 9: Bộ Kit xét nghiệm Salmonella typhi trong huyết thanh người để chẩn đoán bệnh thương hàn ................................................................................ …………..21 Hình 10: Marker dùng trong chạy điện di........................................... …………..23 Hình 11: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ...................................... …………..27 Hình 12: Sản phẩm PCR cho các mẫu trích bằng phương pháp trích Chloroform .......................................................................................................................... .31 Hình 13: Sản phẩm PCR cho các mẫu trích bằng phương pháp trích nhanh bằng xử lí nhiệt trong 20 phút............................................................................................. .32 Hình 14: PCR với mix + Taq sử dụng ngay sau khi pha xong trên mẫu bò mua ở chợ Xuân Khánh ( 24.12.09)................................................................................... .33 Hình 15 - PCR với mix + Taq giữ trong 1 tuần trên các mẫu mua tại một vài chợ ở địa bàn thành phố Cần Thơ...................................................................................... .34 Hình 16 - PCR với mix + Taq giữ trong 2 tuần trên các mẫu mua tại một vài chợ ở địa bàn thành phố Cần Thơ...................................................................................... .35 Hình 17- PCR với mix - Taq sử dụng ngay sau khi pha xong trên mẫu bò mua ở chợ Xuân Khánh ( 24.12.09)................................................................................... .36 Hình 18 – PCR với mix - Taq giữ trong 1 tuần trên mẫu bò mua ở chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) ......................................................................................................... .37 Hình 19 – PCR với mix - Taq giữ trong 2 tuần trên mẫu bò mua ở chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) ......................................................................................................... .38 vii Hình 20 – PCR với mix không Taq giữ trong 1 tháng trên mẫu bò mua ở chợ Xuân Khánh ( 24.12.09) ............................................................................................ .39 Hình 21 – PCR với mix - Taq giữ trong 2 tháng trên các mẫu mua tại một vài chợ ở địa bàn thành phố Cần Thơ ................................................................................ .40 Hình 22 - Máy ủ lắc GFL 1083 Hình 23 - Máy PCR Biorad PTC 200 Hình 24 - Bồn điện di Run One Hình 25 - Máy chụp hình gel Biorad UV 2000 viii TỪ VIẾT TẮT GMP : Good Manufacturing Practices (quy phạm sản xuất). SSOP: Sanitation Standard Operating Procedure (Quy trình làm vệ sinh và thủ tục kiểm soát vệ sinh ). HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points (Phân tích mối nguy và điểm kiểm soát tới hạn). ISO : International Organization for Standardization LPS: Lipopolysaccharides PS: polysaccharid CDC: Centers for Disease Control and Prevention E.M.B: Eosin Methylene Blue TSI: môi trường thạch sắt đường trisacchride ONPG: ortho-nitrophenyl--D-galactopyranoside. SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. SPI: Salmonella pathogenicity island. Inv: invasion Spv: Salmonella Plasmid Virulence. ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay TE: Tris EDTA TBE: Tris base, Boric acid , EDTA EDTA: ethylene diamine tetraacetic acid PCR: Polymerase Chain Reaction BSA: Bovine Serum Albumin dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate DNA: Deoxyribonucleotide Acid Taq: Taq DNA polymerase ix Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 1 - GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Hiện nay vấn đề ngộ độc thực phẩm đã trở nên vô cùng cấp thiết đối với nhiều nước trên thế giới vì vậy tính an toàn đã trở thành một vấn đề không thể thiếu được của chất lượng sản phẩm. Một sản phẩm đạt chất lượng phải đảm bảo ba thuộc tính: tính an toàn, tính kinh tế và tính khả dụng. Trong đó thuộc tính về chất lượng an toàn được đánh giá là quan trọng nhất. Tuy nhiên, hiện trạng ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật vẫn còn khá phổ biến, trong đó vi khuẩn Salmonella spp. được đặc biệt quan tâm vì chúng gây ra nhiều căn bệnh nghiêm trọng về đường ruột hoặc bệnh thương hàn gây tổn hại lớn đến sức khỏe cho người và động vật. Theo Trung tâm phòng và ngăn ngừa bệnh của Mỹ cho biết nước này hàng năm có khoảng 40.000 người là nạn nhân của vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho người và động vật được truyền từ thực phẩm, chủ yếu là thịt (heo, bò, gia cầm…) và các sản phẩm của thịt, trứng. Ở Canada hàng năm có khoảng từ 6.000 đến 12.000 trường hợp bị bệnh do thực phẩm nhiễm Salmonella spp. Ở Đan Mạch năm 1995 có 2.911 trường hợp nhiễm Salmonella, trong đó có 19% gây bệnh thương hàn do ăn thức ăn là trứng và các sản phẩm của trứng bị nhiễm vi khuẩn này. Năm 1999 ở Hàn Quốc nghiên cứu cho thấy 25,9% mẫu thịt gà tươi sống bị nhiễm Salmonella. Ở Hà Lan, 23% thịt heo nhiễm Salmonella spp. Năm 2001 nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26% thịt heo nhiễm Salmonella. Riêng tại Việt Nam, theo báo cáo của Bộ Y tế cho biết từ năm 2000 – 2006, trong toàn quốc đã có 6.091.039 người mắc bệnh truyền qua thực phẩm và 115 người chết, trong đó tỷ lệ người mắc bệnh do vi khuẩn Salmonella chiếm rất cao. Do đó để tạo ra một sản phẩm an toàn, các nhà chế biến thực phẩm phải kiểm soát quá trình chế biến một cách chặt chẽ bằng cách áp dụng các chương trình kiểm soát chất lượng như GMP, SSOP, HACCP nhằm giảm thiểu các mối nguy làm nhiễm tác nhân có hại vào trong sản phẩm gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng. Theo tiêu chuẩn ISO 6888: 1993 và tiêu chuẩn Việt Nam 5153: 1990 qui định lượng Salmonella trên sản phẩm thịt tươi là 0. Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, công nghệ sinh học được ứng dụng rộng rãi, kỹ thuật PCR cũng được áp dụng để chẩn đoán nhanh Salmonella spp. trong thực phẩm. Do đó việc tạo ra sản phẩm bộ Kit chẩn đoán Salmonella hiện diện trong thực phẩm là vô cùng cần thiết cho Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT những người làm công tác xét nghiệm nhằm giúp họ có định hướng sớm trong chẩn đoán các trường hợp ngộ độc thực phẩm. 1.2. Mục tiêu đề tài Để đóng góp thêm cơ sở khoa học và giải pháp kỹ thuật trong nghiên cứu nhằm xây dựng một bộ Kit hoàn chỉnh để phát hiện nhanh vi khuẩn Salmonella gây bệnh trong thực phẩm bằng các kỹ thuật sinh học phẩn tử. Chúng tôi thực hiện đề tài “ Phát triển bộ Kit phát hiện Salmonella hiện diện trong thực phẩm” với mục đích nghiên cứu :  So sánh hiệu quả phát hiện Salmonella bằng 2 phương pháp trích DNA: trích DNA bằng Phenol - Chloroform và trích nhanh DNA.  Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính của hai loại hỗn hợp thành phần phản ứng PCR (Mix): Mix có thêm Taq DNA polymerase và Mix không thêm Taq DNA polymerase ( Taq).  Kiểm tra sự hiện diện của vi khuẩn Salmonella trên các mẫu thực phẩm tại địa bàn thành phố Cần Thơ bằng bộ Kit tự sản xuất. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG 2 – LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU I. Giới thiệu về Salmonella Salmonella là tên các vi khuẩn gây bệnh được nhà nghiên cứu bệnh học Dr. Daniel Salmon đặt tên sau khi ông phân lập được vi khuẩn này từ ruột của động vật. Tên Salmonella enterica được đặt cho loài vi khuẩn này vì chúng liên quan đến bệnh đường ruột. 1. Đặc điểm chung của Salmonella Hiện nay có hơn 2500 kiểu huyết thanh Salmonella khác nhau. Chúng gây bệnh cho người hoặc động vật hoặc cả hai. Các bệnh do Salmonella gây ra ở người có thể chia thành 2 nhóm: thương hàn và không phải thương hàn 1.1. Hình thái Hình 2- Salmonella typhimurium Hình 1- Salmonella paratyphi (Nguồn: http://www.cdc.gov/Salmonella/typhimurium/update.html) Hình 3 – Salmonella enterica (Nguồn: http://www.salmonellablog.com/) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Salmonella là trực khuẩn gram âm, kích thước 1-3 x 0.5- 0.7  m. Hầu hết các Salmonella đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vì vậy có khả năng di động, không tạo bào tử, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, pH 6- 8, nhiệt độ từ 150C – 410C ( nhiệt độ tối thích là 37.50C ). Salmonella có sức sống và sức đề kháng tốt, trong đất có thể sống vài tháng, trong nước thường từ 2- 3 tuần, trong nước đá từ 2- 3 tháng, trong phân vài tuần. Vi khuẩn bị tiêu diệt ở 500C trong vòng 1 giờ, 600 C trong 20- 30 phút, 1000C 5 phút. Các chất khử trùng thông thường có thể tiêu diệt Salmonella dễ dàng như Chloramin 3%, Phenol 5%... 1.2. Tính chất sinh hóa Salmonella lên men glucose có sinh hơi (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, idol âm tinh, đỏ methyl dương tính, urease âm tính, H2S dương tính ( trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính). .. 2. Phân loại Salmonella Chi Salmonella được chia làm 2 loài là Salmonella bongori và Salmonella enterica. Loài S. enterica được chia làm 6 loài phụ là: o S. enterica subsp.enterica o S. enterica subsp. Salamae o S. enterica subsp.arizonae o S. enterica subsp.diarizonae o S. enterica subsp.indica o S. enterica subsp.houtenae Chỉ riêng loài phụ S. enterica subsp.enterica gây bệnh trên động vật đẳng nhiệt, có hơn 2300 yếu tố kháng nguyên được tìm thấy. Người ta dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella. 2.1.Kháng nguyên O Kháng nguyên O là kháng nguyên thân, bản chất là lipopolysaccharid (LPS), đây chính là nội độc tố của vi khuẩn, chỉ được giải phóng ra khi vi khuẩn bị tiêu diệt. Kháng nguyên O có nhiều loại yếu tố kháng nguyên, mỗi Salmonella có một vài yếu tố kháng nguyên riêng biệt, hiện nay đã phát hiện có trên 76 loại kháng nguyên O. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT 2.2.Kháng nguyên H Kháng nguyên H là kháng nguyên lông, bản chất là Protein không chịu nhiệt, dễ bị tiêu hủy bởi sức nóng và cồn. Kháng nguyên H gồm có hai pha, công thức kháng nguyên có hai thành phần riêng biệt, pha 1 ghi bằng chữ nhỏ a, b, c…, pha 2 đánh số 1, 2, 3,… 2.3.Kháng nguyên Vi Là kháng nguyên bề mặt, bản chất là polysaccharid (PS). Kháng nguyên Vi che lấp các kháng nguyên O ở khắp các bề mặt thân vi khuẩn làm cho vi khuẩn không ngưng kết được với kháng nguyên huyết thanh. Kháng nguyên Vi ngăn chặn quá trình thực bào và ngăn cản quá trình hoạt động của bổ thể, kháng nguyên này chỉ có ở 2 loài là Salmonella typhi và Salmonella paratyphi C. * Một số type huyết thanh Salmonella chủ yếu gây bệnh cho người gồm:  Salmonella typhi: chỉ gây bệnh cho người. Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu do Salmonella typhi gây ra.  Salmonella paratyphi A: gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, đôi khi ở cả súc vật. Bệnh thường gặp ở các nước Châu Âu.  Salmonella paratyphi C: gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột và nhiễm khuẩn huyết. Bệnh thường gặp ở các nước Đông Nam Á.  Salmonella typhimurium và Salmonella enteritidis: gây bệnh cho người và gia súc, gặp trên toàn thế giới. Chúng là nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn do ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella. Salmonella cholerae suis: loại này hay gây nhiễm khuẩn huyết. Giống như những loại vi khuẩn gram âm khác, màng tế bào Salmonella là một cấu trúc LPS phức tạp, chúng được phóng thích khi phân giải tế bào đến những vùng khác trong môi trường. Một phần LPS là những nội độc tố và rất quan trọng trong việc xác định tính độc của vi sinh vật. Đại phân tử nội độc tố phức tạp này bao gồm 3 thành phần: 1 vỏ ngoài là O- polysaccharid, phần giữa là 1 lỏi R và bên trong là một lớp áo lipid A. Cấu trúc của LPS quan trọng bởi vì, thứ nhất, những đơn vị đường được lặp lại ở vỏ ngoài chuỗi O- polysaccharid qui định tính chuyên biệt của kháng nguyên O, nó cũng có thể xác định tính độc của sinh vật. Sự thiếu hoàn thành những đơn vị lặp lại của trình tự O- polysaccharid của Salmonella được gọi là thô, bởi vì sự gồ ghề xuất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 5 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT hiện trên bề mặt những khuẩn lạc, loại này không độc hoặc ít độc hơn so với những loại có khuẩn lạc bề mặt láng, chúng có những thành phần lặp lại đầy đủ của chuỗi đường O- polysaccharid. Thứ 2, kháng thể trực tiếp để chống lại lỏi R (kháng nguyên chung ở vi khuẩn đường ruột) có thể bảo vệ chống lại sự xâm nhiễm của nhiều loại vi khuẩn gram âm với những trình tự lỏi chung và có thể loại trừ hiệu quả gây chết của chúng. Thứ 3, thành phần nội độc tố của màng tế bào có thể đóng một vai trò quan trọng trong sự phát sinh bệnh của nhiều triệu chứng bị nhiễm vi khuẩn gram âm. Nội độc tố gây nên sốt, kích thích huyết thanh, kinin, và hệ thống đông máu, suy giảm chức năng cơ tim và biến đổi chức năng của lympho bào. Sự lưu thông của nội độc tố một phần gây nên những triệu chứng nhiễm trùng, có thể dẫn đến lây nhiễm toàn cơ thể. II – Con đường xâm nhiễm Salmonella và triệu chứng nhiễm bệnh Hình 4 – Con đường xâm nhiễm của Salmonella (Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Salmonella tồn tại trong thực phẩm và nước uống không hợp vệ sinh và thâm nhập qua đường miệng, pH 1 – 2 của dạ dày có thể tiêu diệt một số ít Salmonella trong điều kiện của người khỏe mạnh, nhưng khi pH tăng lên 3 thì một số lượng lớn tế bào vi khuẩn có thể vượt qua một cách dễ dàng, tuy nhiên chúng cần đảm bảo đủ mật số trước khi ảnh hưởng đến cơ thể người bệnh. Khi di chuyển đến ruột non chúng bám Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 6 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT vào thành ruột xâm nhập qua khỏi lớp dịch ruột và tiến sâu vào lớp giữa, nơi những tế bào biểu mô vây quanh chúng. Salmonella ăn sâu vào tế bào biểu mô gây ra phản ứng viêm ở ruột non và ruột già. Hình 5 – Sự xâm nhiễm vào biểu mô ruột của Salmonella (Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Khi Salmonella xâm nhập vào các tế bào biểu mô, mono bào thực bào chúng nhưng chưa giết chết chúng, thậm chí Salmonella vẫn tiếp tục phát triển trong mono bào, đồng thời với sự di trú của mono bào đã góp phần làm lây lan nhanh tế bào vi khuẩn Salmonella trong mô cơ thể. Trong tuần đầu có thể dẫn đến xuất huyết ruột và đôi khi làm thủng cả ruột. Salmonella typhi hay S. paratyphi A, B, C gây ra bệnh thương hàn với các triệu chứng nguy hiểm như sốt cao, đau đầu, sưng lách, nổi đóm đỏ trên da bụng do xuất huyết và thường táo bón hơn là tiêu chảy. Salmonella thâm nhập vào tế bào biểu mô bằng cách tiết ra một protein đặc biệt làm sắp xếp lại màng tế bào biểu mô và chúng xuyên qua dễ dàng. SPI là một vùng gen có chiều dài 400bp trên nhiễm sắc thể mã hóa cho protein HilA – một loại protein thuộc hệ thống bài tiết của Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 7 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32 – 2010 Trường ĐHCT Salmonella, protein này từ tế bào chất xâm nhập vào tế bào kí chủ và gây nên sự loại thảy nhiều protein của tế bào này, đồng thời Salmonella xâm nhập vào tế bào kí chủ. Salmonella tiếp tục sống và nhân lên trong lympo bào, nhờ vào sự di trú và tập trung của lympo bào tại hạch lympo mạc treo và mảng Payer của ruột nên chúng dễ dàng nhiễm vào máu qua hạch bạch huyết. Giai đoạn Salmonella xâm nhập vào hạch bạch huyết cư trú và nhân mật số, kéo dài 7 – 15 ngày, đây là thời kì nung bệnh và thường không có dấu hiệu lâm sàng. Sau thời kì phát triển ở hạch mạc treo ruột vi khuẩn vào máu lần thứ nhất, ở đây vi khuẩn thương hàn chỉ tồn tại trong vòng 24 – 72h, không gây triệu chứng lâm sàng và bị các tế bào biểu mô tiêu diệt tại gan, lách, tủy xương…, một số vi khuẩn khác lan truyền đến túi mật và nhiều cơ quan khác tăng sinh tại đó rồi xâm nhập vào máu lần thứ 2, gây nên các triệu chứng lâm sàng tương ứng với thời kì khởi phát. Triệu chứng lâm sàng với những cơn sốt với nhiệt độ tăng dần, nhiều trường hợp rét run, đến ngày thứ 7 của giai đoạn khởi phát này, bệnh nhân sốt cao 39 – 410C, nhức đầu nhiều, mệt mỏi, ăn ngủ kém, ù tai… Giai đoạn toàn phát bắt đầu khi các tế bào vi khuẩn Salmonella bị tiêu diệt, phóng thích nội độc tố, chính nội độc tố của vi khuẩn thương hàn đóng vai trò quyết định đến các dấu hiệu lâm sàng như rối loạn thân nhiệt, trụy tim mạch và một số tổn thương ở ruột. Bệnh thương hàn do Salmonella có thể gây sưng gan, lách, hạch lympo dẫn đến hoại tử từng vùng, ruột bị tổn thương chủ yếu ở vùng hồi manh tràng, các mảng Payer bị xung huyết, phù to dẫn đến hoại tử, vết loét có thể sâu đến lớp cơ, thanh mạc dẫn đến thủng ruột, gây ổ mủ thứ phát ở nhiều nơi như phổi, màng phổi, viêm túi mật, viêm màng não mủ,…. Thống kê từ đầu năm đến ngày 8.3.2009 trên toàn nước Mỹ có 683 ca nhiễm Salmonella typhimurium, tổ chức CDC (Centers for Disease Control and Prevention) cảnh báo nguy cơ tăng nhanh sự lan truyền Salmonella typhimurium trên các mẫu thực phẩm có nguồn gốc từ bơ, dầu đậu phộng. III – Các phương pháp kiểm nghiệm Salmonella 1. Phương pháp cấy máu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học