Tài liệu Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (paphiopedilum sp.)

1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Trên thế giới, lan hài là một trong những loài lan khó nhân giống vô tính nhất, cho tới nay, có rất ít công bố về nhân giống vô tính in vitro thành công trên đối tượng lan hài. Đây là loài lan có giá trị kinh tế cao, một số giống lan hài quý hiếm có giá 10000 USD/cây như giống Paphiopedilum volonteanum. Lan hài có đặc tính sinh trưởng và phát triển chậm ngoài tự nhiên, nhân giống bằng phương pháp tách cụm thường mất từ 2 - 5 năm chỉ thu được 2 - 3 cây mới từ cây mẹ và tỷ lệ hạt nảy mầm trong tự nhiên rất thấp, do đó, rất hiếm gặp cây con ngoài tự nhiên. Hiện nay, để thu được cây con với số lượng lớn người ta tiến hành gieo hạt lan hài in vitro. Vì vậy, những nỗ lực trong việc nhân giống vô tính là những vấn đề đặc biệt quan tâm và thách thức đáng kể cho việc nghiên cứu loài lan khó tính này. Ở Việt Nam có nhiều loại lan hài quý hiếm và đặc hữu có giá trị thương mại cao (P. delenatii, P. callosum, P. gratrixianum…). Tuy nhiên, tất cả những loài này đang có nguy cơ bị tuyệt chủng do nạn khai thác quá mức và môi trường sống thu hẹp. Các công bố về tái sinh và nhân giống cây lan hài thu được kết quả rất hạn chế vì các tác giả vẫn chưa tìm được phương pháp nhân giống tối ưu, môi trường phù hợp, các điều kiện tác động khác ảnh hưởng đến quá trình tái sinh và nhân giống trên loài lan này. Do vậy, đề tài “Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (Paphiopedilum sp.)” được thực hiện nhằm giải quyết các vấn đề trên. Việc tìm hiểu các kỹ thuật để tái sinh và nhân giống có ý nghĩa rất lớn cho công tác nhân giống, đóng một vai trò quan trọng góp phần làm giảm sự khai thác trái phép ngoài tự nhiên, đồng thời có ý nghĩa trong việc bảo tồn cũng như làm cơ sở cho quá trình lai tạo giống sau này. 2. Mục tiêu và yêu cầu của đề tài Xác định phương pháp tối ưu trong nghiên cứu tái sinh và nhân giống cây lan hài (Paphiopedilum sp.). Phương pháp thực hiện đơn giản, dễ dàng áp dụng vào thực tế, cho hệ số nhân giống cao, cây con sinh trưởng và phát triển khỏe mạnh trong nuôi cấy in vitro và ex vitro. Tìm ra các phương pháp thích hợp nhằm gia tăng tỷ lệ tái sinh của mẫu cấy in vitro ban đầu và đánh giá tác động của chất điều hòa sinh trưởng thực vật kết hợp với các phương pháp nhân giống khác nhau như: phương pháp gây vết thương, phương pháp cắt đốt, phương pháp hủy đỉnh… nhằm mục đích gia tăng hệ số nhân giống lan hài cao hơn so với phương pháp nuôi cấy truyền thống. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài a. Ý nghĩa khoa học của đề tài Có ý nghĩa trong nghiên cứu về sinh lý thực vật, nhân giống vô tính thực vật, khoa học cây trồng. Tìm ra phương pháp tái sinh từ chồi non ex vitro 2 trên đối tượng lan hài mà các công trình nghiên cứu từ trước tới nay đều gặp khó khăn trong quá trình tạo mẫu ban đầu, khắc phục được các khó khăn trong vấn đề nhân giống và tìm ra được phương pháp nhân giống tối ưu. b. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài Đưa ra hướng tuyển chọn nguồn mẫu ban đầu phù hợp như: thu mẫu ban đầu, thao tác rửa mẫu cấy, khử trùng mẫu cấy dễ dàng nhằm nâng cao khả năng tái sinh của mẫu cấy trong quá trình tạo mẫu in vitro. Xây dựng được quy trình nhân giống đơn giản với hệ số nhân giống cao và ổn định, tạo nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất giống thương mại. Tìm ra các yếu tố tác động đến quá trình tái sinh và nhân giống lan hài như: nguồn mẫu ban đầu, môi trường nuôi cấy, giá thể, chất điều hòa sinh trưởng, phương pháp áp dụng cho từng giai đoạn trong quá trính nuôi cấy. Tạo được số lượng lớn cây giống phục vụ cho ngành trồng hoa trên quy mô công nghiệp, đồng thời góp phần vào việc bảo tồn cũng như làm cơ sở cho quá trình lai tạo giống sau này. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài a. Đối tượng nghiên cứu Đối tượng được thực hiện trong nghiên cứu này gồm ba giống lan Vân hài (P. callosum), lan hài Hồng (P. delenatii) và lan hài Tam Đảo (P. gratrixianum) nhằm so sánh các phương pháp thực hiện trên các giống. Từ đó, tìm ra phương pháp thực hiện hiệu quả cho từng giống lan hài. b. Phạm vi nghiên cứu của đề tài Đề tài được thực hiện với sự kết hợp của nhiều phương pháp khác nhau như: phương pháp gieo hạt, phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non, phương pháp cắt đốt, phương pháp tạo vết thương, phương pháp hủy đỉnh, phương pháp nhân giống thông qua callus và PLB. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng chồi non lan hài ex vitro nuôi cấy dưới điều kiện chiếu sáng LED và chiếu sáng ngắt quãng đã tạo ra sự phân đốt rõ rệt và nguồn vật liệu này đã khắc phục được những khó khăn trong quá trình tạo mẫu in vitro ban đầu. Tạo callus từ lát cắt ngang của lóng thân trên đối tượng lan Vân hài và phương pháp cắt đốt trồng trực tiếp ra vườn ươm trên đối tượng lan hài Hồng. Trong quá trình nghiên cứu, đề tài đã đưa ra thêm một phương pháp nhân giống mới trong nghiên cứu in vitro trên đối tượng lan hài (phương pháp hủy đỉnh). Xây dựng được quy trình nhân giống cho từng phương pháp khác nhau. CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo 11 tài liệu tiếng Việt, 140 tài liệu tiếng Anh với các nội dung liên quan đến: (1) Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và 3 phát triển in vitro của thực vật và ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật; (2) Ánh sáng và sự phát triển của thực vật; (3) Ảnh hưởng của hợp chất hữu cơ lên quá trình sinh trưởng in vitro; (4) Giới thiệu về lan hài và một số nghiên cứu in vitro trên đối tượng lan hài. Một số nghiên cứu in vitro trên đối tượng lan hài. Lan hài là một trong những loài lan khó nhân giống nhất hiện nay trên thế giới và là loài lan có giá trị kinh tế cao. Cho đến nay, đã có nhiều phương pháp được áp dụng nghiên cứu nhân giống vô tính đối với loài lan hài đã được nêu ở trên, nhưng những kết quả đã đạt được còn hết sức khiêm tốn và phụ thuộc rất nhiều vào kiểu di truyền của từng giống. Việc xác định được phương pháp tối ưu nhằm cải thiện hệ số nhân giống in vitro cho từng giống lan hài là một thách thức đáng kể và là vấn đề đặc biệt quan tâm của các nhà nghiên cứu trên thế giới. Trong luận án này, các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trên đối tượng lan hài đã được chia thành các phương pháp nhân giống khác nhau, gồm 9 phương pháp: Phương pháp nhân giống truyền thống. Nhân giống bằng phương pháp gieo hạt. Nhân giống từ chồi đỉnh. Nhân giống thông qua mô sẹo và PLB. Nhân giống thông qua hình thành chồi trực tiếp. Nhân giống thông qua hình thành chồi nách. Nhân giống bằng phương pháp gây vết thương. Nhân giống in vitro bằng phương pháp cắt đốt, cắt theo chiều dọc và ngang thân cây con in vitro. Cảm ứng chồi và nhân nhanh chồi từ phát hoa. Kết quả thu được từ những phương pháp nhân nêu trên đã cho thấy những ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp nhân giống lan hài: Ưu điểm Nhân giống trong ống nghiệm là vật liệu thương mại hóa mà không vấp phải lệnh cấm thương mại của công ước CITES, vi nhân giống thông qua nuôi cấy mô là một yêu cầu bắt buộc cho việc thương mại hóa của các loài lan hài. Khả năng bảo quản các giống bằng nuôi cấy mô cũng sẽ giúp bảo tồn của nhiều loài lan hài hoang dã mà gần tuyệt chủng trong môi trường sống tự nhiên của chúng. Các phương pháp nhân giống ở trên cho hệ số nhân giống tương đối ổn định, góp phần bảo tồn giống in vitro và ex vitro trên các giống lan hài bản địa. Nhược điểm Đa số các công trình nghiên cứu được báo cáo đã nêu trên đều sử dụng cây con có nguồn gốc từ gieo hạt in vitro. Các dòng nuôi cấy mô vô tính có nguồn gốc từ hạt giống thường bị một hạn chế nghiêm trọng vì kiểu gen của chúng là rất đa dạng và chúng biểu hiện kiểu hình là không thể đoán trước và thiếu tính đồng nhất. Hơn nữa, nó thường phải mất 5 năm chăm sóc trong nhà kính cây con mới trưởng thành và biểu hiện về kiểu hình và màu sắc 4 hoa. Thậm chí sau đó, một vài cây trưởng thành được coi là có giá trị cũng không thể được vi nhân giống thành công vì quy trình tạo mẫu ban đầu từ chồi non của cây trưởng thành chưa được hoàn chỉnh. Hai vấn đề chủ yếu sau đây góp phần vào quá trình vi nhân giống không thành công của các loài lan hài: (1) nguồn mẫu cấy từ cây trưởng thành của loài phân họ lan hài thường gặp rất nhiều khó khăn trong cảm ứng và tái sinh cây con in vitro; (2) chúng thường vấp phải những khó khăn nhất định trong công tác vô trùng mẫu cấy từ những cây trưởng thành thông qua khử trùng bề mặt của mẫu cấy để tạo nguồn vật liệu nuôi cấy in vitro, vì thời gian trưởng thành dài và độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho sự nhiễm của nấm và khuẩn. CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Nguồn mẫu từ hạt Cây trưởng thành của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo được trồng tại vườn ươm của Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên. Hoa sau khi nở được 4 - 5 ngày của 3 giống lan Vân hài (P. callosum), lan hài Hồng (P. delenatii) và lan hài Tam Đảo (P. graxtrixianum) được tiến hành thụ phấn và thu trái sau 8 tháng tuổi, tách lấy hạt. 2.1.2. Nguồn mẫu chồi non Chồi non 2 - 3 tháng tuổi, có 3 - 4 lá với chiều dài lá trung bình từ 3 7 cm được tách ra từ những cây mẹ trưởng thành của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo được dùng để nghiên cứu thời gian khử trùng thích hợp lên quá trình tạo mẫu ban đầu. 2.1.3. Nguồn mẫu chồi non ex vitro được kéo dài dưới nguồn sáng khác nhau Chồi non của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 1 tháng tuổi có chiều cao khoảng 1 cm. Những chồi này được đưa vào nuôi trong các buồng chiếu sáng khác nhau (100% LED xanh, 100% LED đỏ, 90% LED đỏ + 10% LED xanh, 50% LED đỏ + 50% LED xanh và trong điều kiện tối) nhằm kéo dài các chồi non trong 4 tháng. Vật liệu nghiên cứu là những chồi non của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 1 tháng tuổi có chiều cao 1 cm được đưa vào trong điều kiện tối 14 ngày sau đó được chuyển ra điều kiện chiếu sáng 1 ngày. Chu kỳ được lặp lại 7 lần liên tục nhằm kéo dài chồi phục vụ cho quá trình cảm ứng tạo callus ban đầu. 2.1.4. Nguồn mẫu in vitro Chồi non in vitro của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo được tạo ra từ các nghiên cứu tái sinh, tiếp tục sử dụng cho các nghiên cứu nhân giống in vitro tiếp theo. 2.1.5. Thiết bị - dụng cụ 5 Thiết bị và dụng cụ trong nuôi cấy mô. 2.1.6. Thiết bị chiếu sáng 2.1.6.1. Đèn huỳnh quang 2.1.6.2. Hệ thống chiếu sáng LED 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp gieo hạt 2.2.2. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ chồi non 2.2.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân 2.2.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt 2.2.5. Phương pháp nhân giống thông qua callus 2.2.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB có nguồn gốc từ hạt 2.2.7. Phương pháp hủy đỉnh 2.2.8. Phương pháp gây vết thương 2.3. Nội dung nghiên cứu: 2.3.1. Phương pháp gieo hạt 2.3.1.1. Thí nghiệm 1. Khả năng nảy mầm của hạt trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo trên các môi trường khoáng khác nhau 2.3.1.2. Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng của chồi 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo nuôi cấy in vitro 2.3.2. Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh Thí nghiệm 3. Thời gian khử trùng của chồi non của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ex vitro 2.3.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân 2.3.3.1. Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng thân của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ex vitro 2.3.3.2. Thí nghiệm 5. Ảnh hưởng của mẫu cấy có nguồn gốc từ các điều kiện chiếu sáng khác nhau đến khả năng tái sinh chồi in vitro của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.3.3. Thí nghiệm 6. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh chồi từ mẫu cấy đốt thân ex vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt 2.3.4.1. Thí nghiệm 7. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.4.2. Thí nghiệm 8. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi in vitro giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.4.3. Thí nghiệm 9. Kéo dài chồi in vitro của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo trong điều kiện che tối hoàn toàn và khả năng sống sót của các đốt thân ngoài vườn ươm 6 2.3.5. Phương pháp nhân giống thông qua callus 2.3.5.1. Thí nghiệm 10. Cảm ứng tạo callus từ lát cắt ngang lóng thân ex vitro được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.5.2. Thí nghiệm 11. Ảnh hưởng của 2,4-D và TDZ đến quá trình nhân nhanh callus trên giống lan Vân hài 2.3.5.3. Thí nghiệm 12. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa NAA với BA và TDZ đến quá trình tái sinh chồi từ callus trên giống lan Vân hài 2.3.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB 2.3.6.1. Thí nghiệm 13. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng tạo PLB trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.6.2. Thí nghiệm 14. Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với TDZ, BA và KIN đến quá trình nhân nhanh PLB trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.6.3. Thí nghiệm 15. Ảnh hưởng của nguồn gốc PLB khác nhau đến khả năng hình thành chồi trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.7. Phương pháp hủy đỉnh Thí nghiệm 16. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo chồi bên của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.8. Phương pháp gây vết thương Thí nghiệm 17. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương đến khả năng kích thích tạo chồi bên của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 2.3.9. Ảnh hưởng của các hợp chất bổ sung lên quá trình sinh trưởng chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.1. Thí nghiệm 18. Ảnh hưởng của nước dừa non đến quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.2. Thí nghiệm 19. Ảnh hưởng của bột khoai tây đến quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.3. Thí nghiệm 20. Ảnh hưởng của peptone đến quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro 2.3.9.4. Thí nghiệm 21. Ảnh hưởng của bột chuối đến quá trình sinh trưởng của chồi lan Vân hài in vitro 2.3.10. Trồng cây con 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng, lan hài Tam Đảo ra điều kiện vườn ươm Thí nghiệm 22. Ảnh hưởng của giá thể đến quá trình sinh trưởng cây con 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ngoài vườn ươm 2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (Completely Randomized Design, CRD) theo phương pháp của Compton và Mize, (1999). Trung bình của các chỉ tiêu theo dõi giữa các nghiệm thức thí nghiệm được xử lý bằng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA), sau đó so sánh với phép thử Ducan ở mức tin cậy P ≤ 0,05 bằng phần mềm SAS 9.1. CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phương pháp gieo hạt 7 3.1.1. Khả năng nảy mầm của hạt trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo trên các môi trường khoáng khác nhau Hình 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo trên 5 môi trường khoáng khác nhau sau 90 ngày nuôi cấy. 3.1.2. Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng và phát triển chồi của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo nuôi cấy in vitro Bảng 3.1. Ảnh hưởng của môi trường khoáng hài sau 90 ngày nuôi cấy. Chiều Môi dài Số Số trường lá/chồi lá/chồi rễ/chồi khoáng (cm) 1,00d 2,25d 1,50c MS(ĐC) khác nhau đến sự sinh trưởng của chồi lan Vân Chiều dài rễ/chồi (cm) 0,25d Khối lượng Hình thái chồi tươi/chồi (g) 0,21d Mẫu hóa nâu đen, chết Mẫu úa vàng, lá non c c c c c 1,75 3,25 2,00 1,00 0,31 bắt đầu chết ½MS Mẫu xanh cứng, rễ 3,00b 4,00b 3,25c 3,25b 0,49b VW ngắn, khằn Mẫu xanh đậm, rễ b a b b b 3,00 5,00 3,25 3,50 0,56 B5 ngắn, khằn Mẫu khỏe, xanh tươi, SH 4,00a 5,00a 4,50a 6,25a 1,44a rễ phát triển 6,94 8,10 9,25 9,17 9,62 CV(%) * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Hình 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng chồi lan Vân hài nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy. 8 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng của chồi lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy. Chiều Chiều Khối Môi dài Số lá Số dài lượng trường Hình thái chồi lá/chồi /chồi rễ/chồi rễ/chồi tươi/chồi khoáng (cm) (cm) (g) MS (ĐC) 1,75d 2,95d 1,47d 0,70d 0,50e ½MS 3,87c 3,66c 2,60c 2,22c 1,07d VW 4,50b 3,95bc 3,42b 3,60b 1,35c B5 5,00a 4,15b 3,37b 3,42b 1,55b SH 5,27a 4,57a 3,95a 5,07a 1,95a Mẫu hóa nâu, chết Mẫu xanh nhạt, lá non bắt đầu úa vàng và hoại tử Mẫu xanh cứng, rễ ngắn, khằn Mẫu xanh đậm, rễ ngắn, khằn Mẫu khỏe, xanh tươi, rễ phát triển mạnh 7,60 7,00 7,45 9,57 8,92 CV(%) F-test * * * * * Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng của chồi lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy. Chiều Chiều Môi Khối lượng dài Số Số dài Hình thái trường tươi lá/chồi lá/chồi rễ/chồi rễ/chồi chồi khoáng (g) (cm) (cm) Lá ngọn trắng, 3,75d 3,10d 2,15d 1,57e 1,12c MS (ĐC) lá già hóa nâu và hoạiyếu, Chồi tử lá non màu xanh 4,17c 3,05d 2,60c 2,25d 1,20c ½MS nhạt và trắng, lá hoại tử Mẫu xanh 4,35c 3,67c 3,30d 3,40c 1,07c VW cứng, rễ ngắn, Mẫu xanh khằn 5,45b 4,52b 3,47b 4,10b 1,37b B5 đậm, rễ ngắn, Mẫu khỏe, khằn SH 5,87a 5,00a 4,22a 5,97a 1,85a xanh tươi, rễ 4,90 4,03 4.95 4,86 9,39 CV(%) phát triển mạnh F-test * * * * * Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Hình 3.3. Ảnh hưởng của môi trường khoáng khác nhau đến sự sinh trưởng chồi trên 2 giống lan hài nuôi cấy in vitro sau 90 ngày nuôi cấy. b. Lan hài Hồng; c. lan hài Tam Đảo. 9 3.2. Phương pháp vào mẫu trực tiếp từ chồi đỉnh Thời gian khử trùng của chồi non của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ex vitro Hình 3.5. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh chồi non lan Vân hài sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 3.6. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh chồi non lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng mẫu cấy đến khả năng tái sinh chồi non lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy. Kết Luận: Tỷ lệ tái sinh chồi của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo thu được cao nhất (22,4%; 24,85%; 17,15%) trên môi trường SH có bổ sung 1,0 mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 9 g/L agar, 30 g/L sucrose, pH = 5,8. 3.3. Phương pháp tạo mẫu ban đầu từ các đốt thân 3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng thân của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo ex vitro Bảng 3.4. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài giống lan Vân hài sau 120 ngày. Chiều Chiều Chiều Chl a Điều kiện chiếu cao Số dài lá rộng lá (mg/g lá sáng chồi lá/chồi (cm) (cm) tươi) (cm)1 lóng thân ex vitro Chl b (mg/g lá tươi) Chl a+b (mg/g lá tươi) ĐC (Vườn ươm) 50% LED đỏ + 50% LED xanh 90% LED đỏ + 10% LED xanh 100% LED đỏ 100% LED xanh Trong tối CV% F-test 2,04d 5,00 14,75bc 4,62a 1,432a 0,987a 2,419a 2,99c 5,00 12,75d 2,85b 0,870bc 0,644b 1,514bc 3,21c 5,00 13,87cd 2,70b 0,849c 0,563c 1,412c 5,00 5,00 5,00 0 NS ab b d d 0,941d 1,644b 0,423e 9,61 * b 4,14 9,11a 9,97a 4,69 * 15,25 16,12a 8,32e 6,25 * 2,62 2,12c 1,72d 6,12 * 0,515 0,999b 0,239e 10,91 * 0,426 0,645b 0,184e 8,66 * 10 Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng thân ex vitro giống lan hài Hồng sau 120 ngày. Chiều Chiều Chiều Chl a Chl b Chl a+b Điều kiện chiếu Số rộng cao chồi dài lá (mg/g (mg/g (mg/g lá sáng lá/chồi lá (cm) (cm) lá tươi) lá tươi) tươi) (cm) f b a a a a ĐC (vườn ươm) 2,25 4,75 9,35 3,72 1,425 0,971 2,397a 50% LED đỏ + 4,37e 4,75b 6,05b 1,62b 1,046b 0,743b 1,790b 50% LED xanh 90% LED đỏ + 7,30c 5,00ab 5,92b 1,60b 0,960b 0,590d 1,550c 10% LED xanh 100% LED đỏ 4,97d 4,75b 5,97b 1,70b 0,734c 0,630cd 1,365d 100% LED xanh 11,00a 5,75a 5,47c 1,35c 0,712c 0,669bc 1,382d Trong tối 8,87b 5,00ab 6,12b 1,60b 0,216d 0,179e 0,396d 3,44 10,54 3,31 5,51 10,05 8,09 6,77 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.6. Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự kéo dài lóng thân ex vitro giống lan hài Tam Đảo sau 120 ngày. Chiều Chiều Chl Chiều Chl a Chl b Điều kiện chiếu cao Số rộng a+b dài lá (mg/g (mg/g lá sáng chồi lá/chồi lá (mg/g (cm) lá tươi) tươi) (cm) (cm) lá tươi) ĐC (Vườn ươm) 3,05cd 5,00a 22,50a 3,05a 1,161a 0,705a 1,867a 50% LED đỏ + ab b b b c c 3,42 4,50 19,50 2,17 0,712 0,491 1,204c 50% LED xanh 90% LED đỏ + 3,82a 4,75a 16,50c 1,90c 0,767bc 0,598b 1,365b 10% LED xanh 100% LED đỏ 3,35b 5,00a 19,50b 1,92bc 0,529d 0,484c 1,014d ab a c bc b b 100% LED xanh 3,40 4,50 16,50 1,95 0,826 0,617 1,444b Trong tối 1,50c 3,50b 4,00d 1,15d 0,111d 0,095d 0,206e 7,63 10,04 9,41 8,27 8,84 7,28 6,82 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Hình 3.8, 3.9: Chồi lan hài ex vitro được nuôi trong các điều kiện sáng khác nhau sau 120 ngày. A. Lan Vân hài; b. lan hài Hồng; c. lan hài Tam Đảo; ĐC. Đối chứng ngoài vườn ươm; R. Ánh sáng đèn LED đỏ; B. Ánh sáng đèn LED xanh; D. Điều kiện tối. 11 Kết Luận: Sự kéo dài chồi thu được tốt nhất trong điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh (9,11 cm) và đặt trong điều kiện tối (9,97 cm) thu được trên giống lan Vân hài. Trên giống lan hài Hồng, chồi kéo dài tốt nhất trong điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh với chiều cao đạt 11,00 cm. Trên giống lan hài Tam Đảo, chồi có sự kéo dài nhưng sự kéo dài các lóng thân là chưa rõ ràng. 3.3.2. Ảnh hưởng của mẫu cấy có nguồn gốc từ các điều kiện chiếu sáng khác nhau lên khả năng tái sinh chồi in vitro của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Hình 3.10. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở giai đoạn ex vitro đến quá trình tái sinh in vitro lan Vân hài sau 45 ngày nuôi cấy. Hình 3.11. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở giai đoạn ex vitro đến quá trình tái sinh in vitro lan hài Hồng sau 45 ngày nuôi cấy. Hình 3.12. Ảnh hưởng của nguồn mẫu trong các điều kiện sáng khác nhau ở giai đoạn ex vitro đến quá trình tái sinh in vitro lan hài Tam Đảo sau 45 ngày nuôi cấy. 3.3.3. Ảnh hưởng của giá thể lên khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân ex vitro của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Hình 3.14. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân ex vitro lan Vân hài sau 45 ngày nuôi cấy. Hình 3.15. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân ex vitro lan hài Hồng sau 45 ngày nuôi cấy. 12 Hình 3.16. Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng tái sinh của mẫu cấy đốt thân ex vitro lan hài Tam Đảo sau 45 ngày nuôi cấy. Hình 3.17. Chồi lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo tái sinh in vitro trên các giá thể khác nhau sau 45 ngày nuôi cấy. a. b. Chồi bên lan hài Tam Đảo tái sinh trên giá thể bông gòn; c. Chồi tái sinh trên giá thể khác nhau: BG. bông gòn, CGL. cầu giấy lọc, Gelrite, Agar; d. e. Chồi bên lan Vân hài tái sinh trên giá thể bông gòn; f. g. Chồi bên lan hài Hồng tái sinh trên giá thể bông gòn. Kết Luận: Tỷ lệ mẫu cấy tái sinh (48,45%; 44,90%; 25,3%) của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo có nguồn gốc từ điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh thu được trên môi trường SH lỏng với giá thể bông gòn, có bổ sung 1 mg/L TDZ, 0,3 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, pH = 5,8. 3.4. Nhân giống bằng phương pháp cắt đốt 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến khả năng kéo dài chồi của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.7. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan Vân hài in vitro. Chiều Chiề Khối Khối Giá Điều kiện chiếu Số lá Chiều cao u dài lượng lượng trị sáng mới rộng lá chồi lá tươi khô SPAD ĐC (Neon) 1,92h 4,00b 5,06cd 1,39abc 4,25cd 0,41bc 46,62a g b bc de def c 50% R + 50% B 2,97 4,00 5,37 1,14 4,02 0,39 41,77b 30% R + 70% B 4,32f 4,00b 6,10a 1,25cde 4,57b 0,44b 39,47c c b ab a a a 70% R + 30% B 6,85 4,00 5,70 1,45 5,20 0,51 38,55c 100% B 5,85d 4,00b 5,15cd 1,36abc 3,75fg 0,36d 36,07d 100% R 5,15e 4,00b 5,15cd 1,42ab 4,37bc 0,42bc 34,52e 100% Gr 6,82c 4,00b 5,82a 1,30abcd 3,90efg 0,32d 32,07f bc b ab bcde g d 100% Y 7,15 4,00 5,75 1,27 3,72 0,33 30,12g 100% Wh 7,37b 4,00b 5,48d 1,23cde 3,27h 0,26f 28,37h a a e e g d Trong tối 8,55 4,75 3,42 1,11 3,45 0,32 4,67i 5,19 3,88 5,43 8,03 4,38 5,22 2,77 CV% * * * * * * F-test * 13 Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Bảng 3.8. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro. Chiều Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu Số lá cao dài lá rộng lượng lượng Giá trị sáng mới 1 chồi mới lá tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh f b a a a a 1,72 4,00 4,80 2,19 4,22 0,40 45,47a quang) 50% R + 50% B 2,72f 4,00b 4,65a 1,72abc 3,37b 0,32b 41,82b 30% R + 70% B 2,62f 4,00b 4,02bc 1,86ab 3,29bc 0,30bc 39,42c f b c bc bcd bc 70% R + 30% B 2,55 4,00 3,85 1,56 3,15 0,30 40,00c 100% B 7,85a 4,75a 4,15b 1,43bc 4,22a 0,40a 39,72c e b bc abc bcd bc 100% R 3,72 4,00 4,00 1,61 3,15 0,30 38,85c 100% Gr 7,10c 4,00b 3,15e 1,35bc 2,97cd 0,28cd 30,07f c ab d c e e 100% Y 6,92 4,50 3,52 1,22 2,30 0,22 34,37d 100% Wh 5,52d 4,00b 3,17e 1,29bc 1,70f 0,15f 32,42e b ab f bc d d Trong tối 7,45 4,50 2,92 1,27 2,85 0,26 6,97g 3,92 7,25 4,14 8,91 6,98 7,49 2,98 CV% * * * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Bảng 3.9. Ảnh hưởng điều kiện chiếu sáng đến khả năng kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro. Chiều Số Chiều Chiều Khối Khối Điều kiện chiếu sáng cao lá dài lá rộng lượng lượng Giá trị 1 1 1 chồi mới (cm) lá tươi khô SPAD ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,72fg 3,00 4,32b 1,26a 1,50a 0,142a 42,00a 50% R + 50% B 1,12d 3,00 4,37b 0,92b 1,32b 0,130ab 37,40b 30% R + 70% B 0,85ef 3,00 4,10c 0,70c 1,12c 0,112bc 36,57bc 70% R + 30% B 0,67fg 2,50 3,60de 0,67c 0,92de 0,087d 35,57c g de de de de 100% B 0,60 2,50 3,60 0,55 0,85 0,082 34,35d de d b d cd 100% R 1,02 3,00 3,70 0,90 0,95 0,095 29,22e b bc cd d de 100% Gr 1,75 2,50 4,22 0,62 0,95 0,082 26,70f a a ef e ef 100% Y 2,02 2,75 4,57 0,50 0,77 0,065 24,70g c de ef f fg 100% Wh 1,35 2,50 3,60 0,50 0,60 0,052 19,17h a e f g g Trong tối 2,10 2,50 3,42 0,40 0,40 0,035 3,55i 4,35 7,08 2,98 3,64 10,63 1,11 2,70 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo in vitro Bảng 3.10. Ảnh hưởng của GA3 lên khả năng kéo dài chồi lan Vân hài in vitro. 14 Chiều Khối Khối Giá trị Số lá Chiều Chiều cao lượng lượng SPAD mới dài lá rộng lá chồi tươi khô d f a d d 0 mg/L (ĐC) 0,50 3,02 3,55 1,20 1,27 0,130 30,45d c e ab d d 1 mg/L 2,65 2,95 6,15 1,05 1,35 0,132 32,85c 2 mg/L 3,95b 2,87 8,65c 1,12ab 1,75c 0,160c 36,67b 3 mg/L 4,65a 2,85 9,65a 1,12ab 2,50a 0,235a 40,82a 4 mg/L 3,85b 3,05 9,20b 1,07ab 2,00b 0,195b 40,30a 5 mg/L 3,97b 3,00 7,45d 0,97b 1,70c 0,160c 38,05b 3,59 5,54 1,81 9,16 6,91 8,23 3,82 CV% * NS * * * * * F-test Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.11. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan hài Hồng in vitro. Chiều cao Chiều Chiều Khối Khối Giá trị Số lá Nồng độ GA3 chồi dài lá rộng lá lượng lượng SPAD mới (cm) mới mới tươi khô 0 mg/L (ĐC) 1,65e 4,00b 3,55c 2,00a 3,60ab 0,342ab 36,53b 1 mg/L 3,00d 4,25ab 3,67c 1,40b 3,10c 0,297b 36,92ab 2 mg/L 7,00c 4,17b 4,00b 1,25c 3,37b 0,235ab 37,00ab 3 mg/L 7,50c 4,25ab 4,25a 1,22c 3,42b 0,297ab 37,27ab b ab a c ab ab 4 mg/L 10,00 4,32 4,42 1,22 3,55 0,312 37,35ab 5 mg/L 13,25a 4,75a 4,45a 1,05c 3,72a 0,352a 37,55a 7,69 9,85 4,88 5,88 4,37 8,94 1,58 CV% * * * * * * F-test * Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi lan hài Tam Đảo in vitro. Số Khối Khối Chiều Chiều Giá trị Nồng độ GA3 Chiều lá lượng lượng cao chồi dài lá rộng lá SPAD mới tươi khô e d a a 0 mg/L (ĐC) 0,45 2,37 1,95 1,17 0,61 0,057 34,30 1 mg/L 0,55d 2,50 2,90c 0,85b 0,58 0,050ab 33,85 2 mg/L 0,75d 2,47 3,15b 0,87b 0,58 0,056ab 33,72 3 mg/L 1,02c 2,32 3,07bc 0,87b 0,60 0,045b 33,40 4 mg/L 1,37b 2,37 3,47a 0,97b 0,61 0,056ab 33,25 5 mg/L 1,55a 2,57 3,57a 1,00b 0,62 0,052ab 33,12 9,76 6,68 3,99 9,99 8,72 12,57 2,11 CV% * NS * * NS * NS F-test Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Nồng độ GA3 Kết Luận: Phương pháp cắt đốt in vitro chỉ thực hiện được trên 2 đối tượng lan Vân hài, lan hài Hồng. Để dễ dàng thực hiện và giảm chi phí cho quá trình nhân giống, thực hiện kéo dài chồi lan Vân hài và lan hài Hồng trong điều kiện che tối sau 120 ngày nuôi cấy với số đốt trung bình (4,75 đốt/chồi). 3.4.3. Sự kéo dài chồi in vitro trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo trong điều kiện che tối hoàn toàn và khả năng sống sót của các vị trí đốt thân ngoài vườn ươm 15 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của điều kiện tối lên sự kéo dài chồi in vitro lan Vân hài. Thời gian che tối Chiều cao Số lá Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi mới dài lá rộng lá thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 2,05e 4,02b 4,93a 1,40a 0,00 d d b b 30 2,55 1,18 4,02 1,16 0,00 60 4,50c 2,47c 3,25c 1,10b 0,00 90 7,00b 3,71b 2,60d 0,87c 0,00 a a d c 120 8,58 5,06 2,40 0,75 0,00 3,38 7,21 5,97 8,00 0 CV% * * * * NS F-test Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.14. Ảnh hưởng của điều kiện tối lên sự kéo dài chồi in vitro lan hài Hồng. Thời gian che tối Chiều Số lá Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) cao chồi mới dài lá rộng lá thành1 d c a a ĐC (Đèn huỳnh quang) 4,25 3,00 4,95 3,37 0,01c d e b b 30 4,37 1,00 3,80 1,65 0,01c 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,01c 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,36a 5,54 7,18 8,15 11,84 5,73 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Bảng 3.15. Ảnh hưởng của điều kiện tối lên sự kéo dài chồi lan hài Tam Đảo. Thời gian che tối Chiều cao Số lá Chiều Chiều Số rễ hình (ngày) chồi mới dài lá rộng lá thành ĐC (Đèn huỳnh quang) 0,80d 3,05a 4,32a 1,36a 0,00 30 2,55c 1,00d 3,82b 0,95b 0,00 b c b c 60 2,75 1,77 3,77 0,70 0,00 90 2,90ab 2,62b 3,72b 0,55d 0,00 120 3,05a 3,07a 3,65b 0,43e 0,00 4,66 8,21 3,78 7,48 0 CV% * * * * NS F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Bảng 3.16. Ảnh hưởng của vị trí đốt thân lên khả năng sống sót và phát triển ngoài vườn ươm sau 12 tháng trên giống lan hài Hồng. Vị trí Tỷ lệ mẫu Tỷ lệ Số chồi mới hình Chiều rộng Số lá mới đốt thân sống mẫu chết thành lá 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a 1 23,75d 76,25a 0,00d 0,00d 0,00d 2 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c 3 c b b b 32,50 67,50 0,72 3,12 1,45c 4 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b 5 8,79 8,53 6,69 13,60 8,64 CV% * * * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. 16 Kết luận: Chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót 100%, từ 1 chồi non ban đầu sau khi được kéo dài lóng thân đã tạo được (1 + 0,75 + 0,72 + 0,53 chồi/mẫu) 3 cây hoàn chỉnh từ 5 đốt thân trên giống lan hài Hồng. 3.5. Phương pháp nhân giống thông qua callus 3.5.1. Khả năng cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Bảng 3.17. Ảnh hưởng của cảm ứng tạo callus từ mẫu chồi non ex vitro được kéo dài trong điều kiện tối ngắt quãng trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo. Chất điều hòa sinh trưởng Lan Vân hài Lan hài Lan hài Tam Hồng Đảo 2,4-D TDZ (mg/L) Tỷ lệ tạo callus Tỷ lệ tạo Tỷ lệ tạo (mg/L) (%)1 callus (%) callus (%) 0,00f 0,00 0,00 0,0 (ĐC) 0,00f 0,00 0,00 0,3 f 0,00 0,00 0,00 0,6 6,03de 0,00 0,00 1,0 0,00f 0,00 0,00 0,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,3 0,5 e 5,00 0,00 0,00 0,6 0,5 14,68c 0,00 0,00 1,0 0,5 0,00f 0,00 0,00 0,0 1,0 d 7,19 0,00 0,00 0,3 1,0 19,76b 0,00 0,00 0,6 1,0 31,03a 0,00 0,00 1,0 1,0 6,01 CV% * NS NS F-test Chú thích: NS: sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê; *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. 3.5.2. Ảnh hưởng của TDZ và 2,4-D đến quá trình nhân nhanh callus trên giống lan Vân hài Hình 3.22. Ảnh hưởng của TDZ và 2,4-D đến quá trình quá trình nhân nhanh callus sau 75 ngày nuôi cấy trên giống lan Vân hài. 3.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự kết hợp giữa auxin và cytokinin lên quá trình tái sinh chồi từ callus lan Vân hài 17 Bảng 3.18. Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa auxin và cytokinin lên quá trình tái sinh chồi từ callus trên giống lan Vân hài. Chất điều hòa sinh trưởng Tỷ lệ callus tái sinh Số chồi trung chồi (%) bình/mẫu1 NAA BA TDZ 0,00f 0,00d 0,5 (ĐC) 0,0 0,0 11,25e 3,23c 0,5 0,5 0,0 43,75c 3,23c 0,5 1,0 0,0 51,25b 4,74b 0,5 2,0 0,0 0,5 0,0 0,3 60,00a 7,98a 43,75c 4,74b 0,5 0,0 0,6 30,00d 3,20c 0,5 0,0 1,0 10,55 7,13 CV% * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,5 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. Kết Luận: Tỷ lệ cảm ứng tạo mô sẹo từ lát cắt ngang của lóng thân trên giống lan Vân hài cao nhất (31,25%) thu được trên môi trường SH lỏng có bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D, 1,0 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose với giá thể bông gòn sau 75 ngày nuôi cấy. Trên môi trường có bổ sung 0,3 mg/L TDZ, 0,5 mg/L NAA cho tỷ lệ tái sinh cụm chồi từ callus thu được cao nhất 60% và số chồi hình thành trung bình trên mỗi cụm là cao nhất 7,98 chồi/mẫu. 3.6. Phương pháp nhân giống thông qua PLB 3.6.1. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng PLB trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Hình 3.24. Ảnh hưởng của 2,4-D đến quá trình cảm ứng PLB trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo. 3.6.2. Ảnh hưởng của sự kết hợp của 2,4-D với TDZ, BA, KIN đến quá trình nhân nhanh PLB trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo 18 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của sự kết hợp của 1 mg/L 2,4-D với TDZ, BA, KIN lên quá trình nhân nhanh PLB 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo. Lan hài Lan hài Lan Vân hài Chất điều hòa sinh trưởng Hồng Tam Đảo (mg/L) Số PLB/mẫu PLB/mẫu PLB/mẫu1 2,4-D TDZ BA KIN 4,35f 3,65f 3,47f 1,0 (ĐC) 0,0 4,12fg 5,57de 4,21ef 1,0 0,5 3,75g 5,06e 3,23fg 1,0 1,0 3,12h 3,62f 2,47gh 1,0 2,0 2,25i 3,06f 1,94hi 1,0 3,0 1,70j 2,17g 1,46i 1,0 4,0 3,75g 3,06f 3,73f 1,0 0,5 5,31e 5,01e 5,24de 1,0 1,0 8,55b 8,06b 7,98b 1,0 2,0 d c 6,62 6,75 5,98cd 1,0 3,0 5,62e 5,68d 4,97de 1,0 4,0 6,20d 6,40c 6,24cd 1,0 0,5 c c 7,47 6,95 7,22bc 1,0 1,0 11,00a 9,62a 10,98a 1,0 2,0 8,25b 8,20b 7,98b 1,0 3,0 d de cd 6,37 5,37 6,22 1,0 4,0 6,22 7,29 7,10 CV% * * * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. (1): các giá trị đã được biến đổi dưới dạng (x+0,5)0,25 để xử lý thống kê, các giá trị trên bảng là giá trị trung bình gốc. 3.6.3. Ảnh hưởng của nguồn gốc PLB khác nhau đến khả năng hình thành chồi trên 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Hình 3.25. Ảnh hưởng của nguồn mẫu được cảm ứng từ 3 phức hợp chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng hình thành chồi từ các cụm PLB của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo. Kết Luận: Quá trình cảm ứng PLB tốt nhất thu được trên môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D sau 60 ngày nuôi cấy, quá trình nhân nhanh PLB thu được trên môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 2 mg/L KIN, quá trình tái sinh chồi thu được là tốt nhất khi PLB nuôi cấy có nguồn gốc từ môi trường SH có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 2 mg/L KIN. 19 3.7. Nhân giống bằng phương pháp hủy đỉnh Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo chồi bên của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Hình 3.27. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo chồi bên của giống lan Vân hài sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 3.28. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo chồi bên của giống lan hài Hồng sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 3.29. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp hủy đỉnh đến khả năng tạo chồi bên của giống lan hài Tam Đảo sau 90 ngày nuôi cấy. Hình 3.30. Nhân giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo bằng phương pháp hủy đỉnh sau 90 ngày nuôi cấy. 20 a. Lan Vân hài được cấy trên môi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; b. Lan hài Hồng được cấy trên môi trường SH có bổ sung 0,4 mg/L TDZ; c. Lan hài Tam Đảo được cấy trên môi trường SH có bổ sung 0,6 mg/L TDZ. Kết Luận: Phương pháp hủy đỉnh kích thích tạo chồi bên cho hệ số nhân giống cao thu được trên cả 3 giống lan Vân hài và lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo tương ứng với tỷ lệ (5,61; 5,48; 6,00 chồi/mẫu) trên môi trường SH lỏng với giá thể bông gòn có bổ sung 0,4 - 0,6 mg/L TDZ, 30 g/L sucrose. 3.8. Phương pháp gây vết thương Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương lên khả năng kích thích tạo chồi bên của 3 giống lan Vân hài, lan hài Hồng và lan hài Tam Đảo Bảng 3.20. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích sự tạo chồi bên lan Vân hài trên môi trường lỏng với giá thể bông gòn. Chất điều hòa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) d 1,22 Chồi nhỏ, xanh nhạt 0 (ĐC) 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,2 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,4 4,48a Chồi to, xanh nhạt 0,6 ab 4,24 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 3,97ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 2,47c Chồi to, xanh nhạt 0,5 bc 3,23 Chồi to, xanh nhạt 1,0 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 1,5 3,71ab Chồi to, xanh nhạt 2,0 3,48ab Chồi to, xanh nhạt 2,5 8,59 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test. Bảng 3.21. Ảnh hưởng của TDZ và BA kết hợp với phương pháp gây vết thương kích thích sự tạo chồi bên lan hài Hồng trên môi trường lỏng với giá thể bông gòn. Chất điều hòa sinh trưởng Số chồi/mẫu Hình thái chồi TDZ (mg/L) BA (mg/L) e 1,75 Chồi nhỏ, xanh nhạt 0 (ĐC) 3,00d Chồi to, xanh nhạt 0,2 ab 5,00 Chồi to, xanh nhạt 0,4 5,37a Chồi to, xanh nhạt 0,6 4,81ab Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 0,8 b 4,62 Chồi nhỏ, xanh nhạt, dị dạng 1,0 3,25d Chồi to, xanh nhạt 0,5 3,87c Chồi to, xanh nhạt 1,0 4,37bc Chồi to, xanh nhạt 1,5 4,43bc Chồi to, xanh nhạt 2,0 4,50b Chồi to, xanh nhạt 2,5 9,48 CV% * F-test Chú thích: *: Những mẫu tự khác nhau (a, b, c…) được nêu trong các cột biểu diễn sự khác nhau có ý nghĩa với P ≤ 0,05 trong Duncan’s test.