VIỆN
KHOA
HỌC
VÀVÀ
CÔNG
NGHỆ
VIỆT
NAM
VIỆNHÀN
HÀNLÂM
LÂM
KHOA
HỌC
CÔNG
NGHỆ
VIỆT
NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ MINH HỒNG
NGUYỄN THỊ MINH HỒNG
ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ
NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN
ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ
NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NỘI
- 2018
HÀHÀ
NỘI
- 2018
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NGUYỄN THỊ MINH HỒNG
ĐÁNH GIÁ HOẠT ĐỘNG CỦ A MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN
ĐẾN TỔNG HỢP, TÍ CH LŨ Y TINH BỘT VÀ THỬ
NGHIỆM CHUYỂN GEN SSIV VÀO CÂY SẮN
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Bích Ngọc
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS.TS. Chu Hoàng Hà
Viện Công nghệ sinh học
HÀ NỘI - 2018
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng dẫn của
PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS. Chu Hoàng Hà.
Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho phép của
các đồng tác giả; phần còn lại chưa ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về các số liệu, nội dung đã trình bày trong
luận án.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2018
Tác giả
Nguyễn Thị Minh Hồng
i
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Bích Ngọc và PGS.TS.
Chu Hoàng Hà đã hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi
trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Bên cạnh đó, tôi xin
chân thành cảm ơn tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật,
phòng Công nghệ ADN ứng dụng của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Trung tâm tài nguyên thực vật, Trung tâm
nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hưng Lộc, Trại thực nghiệm sinh học Cổ
Nhuế đã tạo điều kiện cho tôi được tiến hành đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự hỗ trợ về tài chính và điều kiện làm việc trong
khuôn khổ đề tài: “Khai thác và phân lập nguồn gen có sẵn của tập đoàn giống
sắn Việt Nam nhằm phát triển các giống sắn có khả năng chống chịu bệnh và
năng suất cao bằng công nghệ gen” thuộc nhiệm vụ hợp tác quốc tế về khoa
học và công nghệ, Bộ Khoa học và Công nghệ; thời gian thực hiện từ 6/2012
đến 6/2015 do PGS.TS. Phạm Bích Ngọc làm chủ nhiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, và
Bộ phận phụ trách đào tạo đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi được học tập, nghiên cứu
và hoàn thiện luận án.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Hồng Đức
Thanh Hóa, Lãnh đạo khoa và cán bộ trong bộ môn Khoa học cây trồng, Bảo vệ
thực vật, khoa Nông Lâm Ngư nghiệp, ĐH Hồng Đức đã tạo điều kiện thuận lợi để
tôi yên tâm công tác, học tập và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2018
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Minh Hồng
ii
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
1
4 4
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................
1.1. Cây sắn và một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn.............
4 4
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại.....................................................................................
4 4
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền ........................................................
5 5
1.1.3. Giá trị của cây sắn .............................................................................................
8 8
1.1.4. Tình hình sản xuất sắn trên thế giới và Việt Nam.............................................
9 9
1.1.5. Một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng tinh bột ở sắn.................................
13 13
1.1.6. Một số hướng cải tạo giống sắn hiện nay .......................................................
15 15
1.2. Quá trình hình thành và tích luỹ tinh bột ở cây sắn .........................................
19
1.2.1. Cấu tạo và vai trò của tinh bột ở thực vật .......................................................
19 19
1.2.2. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan .......................................
20 20
1.3. Ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống sắn biến đổi gen ........
27 27
1.3.1. Hệ thống nuôi cấy in vitro cây sắn ..................................................................
27 27
1.3.2. Một số phương pháp chuyển gen ở sắn...........................................................
32 32
1.3.3. Một số nghiên cứu tạo cây sắn biến đổi gen ...................................................
35 35
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................
43 43
2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................
43 43
2.1.1. Vật liệu thực vật ..............................................................................................
43 43
2.1.2. Chủng vi khuẩn, vector ...................................................................................
43 43
2.1.3. Hoá chất và thiết bị thí nghiệm .......................................................................
43 43
2.1.4. Môi trường nuôi cấy ........................................................................................
44 44
2.1.5. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................
45 45
2.2. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................
45 45
2.2.1. Lựa chọn giống sắn và phân nhóm các giống sắn dựa vào các chỉ tiêu đánh
giá ..............................................................................................................................
45 45
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử .................................................................
45 45
2.2.3. Phương pháp phân lập gen và promoter .........................................................
51 51
2.2.4. Các phương pháp thiết kế vector chuyển gen .................................................
52 52
2.2.5. Kỹ thuật canh tác, chăm sóc các giố ng sắ n phu ̣c vu ̣ cho nghiên cứu .............
54 54
iii
2.2.6. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................................
54 54
2.2.7. Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens ........................
55 55
2.2.8. Phương pháp phân tích sự có mặt của gen chuyển .........................................
56 56
2.2.9. Phương pháp phân tích sự biểu hiện của cây chuyển gen...............................
57 57
2.2.10. Phương pháp phân tích và xử lí số liệu .........................................................
60 60
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..................................................................
61 61
3.1. Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên quan
đến trao đổi chất tinh bột .......................................................................................
61 61
3.1.1. Lựa chọn các giống sắn sử dụng .....................................................................
61 61
3.1.2. Thu mẫu và xử lý mẫu sắn ..............................................................................
62 62
3.1.3. Tách chiết ARN tổng số ..................................................................................
63 62
3.1.4. Tổng hợp cDNA từ ARN tổng số của lá, củ sắn trong các giai đoạn
phát triển khác nhau và đánh giá chất lượng cDNA .................................................
64 64
3.1.5. Thu thập thông tin, thiết kế các cặp mồi thích hợp để phân tích sự biểu
hiện của một số gen liên quan tới sinh tổng hợp và tích lũy tinh bột .......................
65 65
3.1.6. Phân tích cơ sở dữ liệu về biểu hiện của các gen liên quan đến quá
trình sinh tổng hợp đường và các tiền chất cho tổng hợp tinh bột trên lá và
củ sắn .........................................................................................................................
66 66
3.2. Phân lập gen SSIV liên quan đến khả năng tổng hợp tinh bột và
thiết kế vector chuyển gen ..........................................................................................
75
3.2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu ...............................................................................
75 75
3.2.2. Phân lập gen SSIV ở sắn .................................................................................
76 76
3.2.3. Thiết kế vector chuyển gen .............................................................................
82 82
3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường sinh
tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ............................................................................
87 87
3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen
chuyển .......................................................................................................................
87 87
3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................
91 92
3.3. Đánh giá hoạt động của các vector chuyển gen SSIV tăng cường
sinh tổng hợp tinh bột trên cây thuốc lá ...................................................................
87
3.3.1. Chuyển gen SSIV vào cây thuốc lá và đánh giá hoạt động của gen 87
chuyển .......................................................................................................................87
3.3.2. Đánh giá hoạt động các gen chuyển................................................................
92 92
iv
3.4. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn ..............
99 99
3.4.1. Xây dựng hệ thống tái sinh in vitro cây sắn ....................................................
99 99
3.4.2. Xây dựng và tối ưu quy trình chuyển gen vào cây sắn thông qua gen
GUS .........................................................................................................................
106
106
3.4.3. Tạo dòng sắn chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột .............
113
113
Chương 4. BÀ N LUẬN KẾT QUẢ ......................................................................
118
118
4.1. Sự biểu hiện của các gen quan trọng liên quan đến trao đổi chất
tinh bột............................................................................................................. 118
4.2. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây thuốc
lá ..............................................................................................................................
122
122
4.3. Chuyển gen SSIV tăng cường sinh tổng hợp tinh bột vào cây sắn ............
124
124
4.3.1. Hệ thống tái sinh cây sắn ..............................................................................
124
124
4.3.2. Chuyển gen SSIV vào sắn thông qua A. tumefaciens ...................................
126
126
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................................
130
130
TÓM TẮT TIẾNG ANH…………………………………………………… 131
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ…………………………………………...…….. 136
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................
137
137
v
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1
Giá trị dinh dưỡng của sắn
9
Bảng 1.2
Diện tích, năng suất, sản lượng sắn của các vùng trên thế giới
trong năm 2014 – 2015
10
Diện tích, năng suất và sản lượng sắn của Việt Nam từ năm
2010 – 2014
12
Bảng 1.4
Một số công trình nghiên cứu tái sinh invitro ở cây sắn
29
Bảng 1.5
Tổng kết một số công trình công bố về chuyển gen vào cây sắn
36
Bảng 3.1
Đặc điểm của một số giống sắn sử dụng trong phân tích biểu
hiện gen
62
Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu RNA tổng số tách chiết
từ lá và củ các giống sắn
63
Cơ sở dữ liê ̣u các gen liên quan đế n quá trình sinh tổ ng hơ ̣p
tinh bô ̣t ở sắ n
66
Bảng 3.4
Trình tự các cặp mồi để khuếch đại các gen quan tâm
75
Bảng 3.5
Trình tự các cặp mồi nhân dòng gen liên quan đến sinh tổng
hợp tinh bột và thiết kế vector chuyển gen
76
Vị trí sai khác trong trình tự nucleotide của gen SSIV ở giống
KM140 so với gen tham chiếu
78
Vị trí sai khác trong trình tự axit amin suy diễn của protein
SSIV của gen phân lập
79
Chuyển cấu trúc gen pK7WG2D-35S: SSIV:T35S và pBI121C54: SSIV:NOST vào thuốc lá………………………………...
90
Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong lá và trong rễ cây thuốc lá
chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S ở các dòng
chuyển gen
97
Hàm lượng tinh bột tích luỹ trong rễ cây thuốc lá chuyển gen
pBI121 – C54: SSIV: NOST ở các dòng chuyển gen
98
Ảnh hưởng của nguồn nguyên liệu và môi trường đến khả năng
tạo mô sẹo (sau 3 tuần)
100
Bảng 3.12
Tỷ lệ mô sẹo phát sinh phôi trên môi trường CI
102
Bảng 3.13
Tỷ lệ phôi soma tạo cây con
104
Bảng 3.14
Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ mô sẹo phôi hóa
105
Bảng 1.3
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9
Bảng 3.10
Bảng 3.11
vi
Bảng 3.15
Bảng 3.16
Bảng 3.17
Bảng 3.18
Bảng 3.19
Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn đến hiệu quả chuyển
gen giống sắn KM140
108
Ảnh hưởng của Kanamycin đến khả năng sống sót của mô sẹo
chuyển gen GUS ở giống sắn HB80 và KM140
109
Ảnh hưởng của Kanamycin đến tỷ lệ ra rễ của chồi giống sắn
HB80 và KM140
110
Tạo cây sắn HB80 và KM140 chuyển gen GUS thông qua
A.tumefaciens
111
Chuyển gen pBI121- C54:SSIV:NOST vào giống sắn KM140
114
vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1
Hình 1.2
Hình 1.3
Hình 1.4
Hình 1.5
Hình 1.6
Hình 2.1
Hình 2.2
Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz)
Một số phương pháp phổ biến tạo cây sắn biến đổi gen
Công thức hóa học của tinh bột
Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan
Quy trình tái sinh in vitro thông qua phôi soma ở cây sắn
Kết quả tạo mô sẹo phôi hoá ở giống sắn TME 14
Trình tự đoạn cmyc và vị trí của các mồi PCR
Quá trình canh tác và thu hoa ̣ch các giố ng sắ n quan tâm ta ̣i Tra ̣i
thực nghiê ̣m sinh học Cổ Nhuế phu ̣c vu ̣ nghiên cứu
Hình 2.3
Quy trình kiểm tra hàm lượng tinh bột trong lá bằng phương
pháp nhuộm iodine
Hình 2.4
Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ lá
cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S
Đồ thị xây dựng đường chuẩn đánh giá hàm lượng tinh bột từ rễ
cây thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121 – C54:SSIV: NOST
Hình ảnh minh họa vị trí lá và củ sắn
Hình 2.5
Hình 3.1
Hình 3.2
Hình 3.3
Hình 3.4
Hình 3.5
Hình 3.6
Hình 3.7
Hình 3.8
Hình 3.9
Hình 3.10
Hình 3.11
Hình 3.12
Hình 3.13
Hình 3.14
RNA tổng số tách chiết từ các mẫu củ (A) và lá các giống sắn (B)
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen actin từ cDNA sắn
Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPS qua các giai đoạn
phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
6
18
20
21
31
32
53
54
58
59
60
62
63
64
67
Phân tích mức độ biểu hiện của gen AGPL qua các giai đoạn
phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
68
Phân tích mức độ biểu hiện gen GBSS qua các giai đoạn phát
triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
69
Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSI, SSIII, SSIV qua các
giai đoạn phát triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
71
Phân tích mức độ biểu hiện của gen SSII qua các giai đoạn phát
triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
72
Phân tích mức độ biểu hiện của gen SBE qua các giai đoạn phát
triển ở 4 giống sắn bằng real-time PCR
Tách dòng đoạn gen SSIV từ củ sắn
Tách dòng promoter C54 ở sắn
Thiết kế vector pK7WG2D-35S:SSIV:T35S
Thiết kế vector pBI121/cmyc
Thiết kế vector pBI121-C54:SSIV-cmyc:NOST
74
77
81
83
84
85
viii
Hình 3.15
Hình 3.16
Hình 3.17
Hình 3.18
Hình 3.19
Hình 3.20
Hình 3.21
Hình 3.22
Hình 3.23
Hình 3.24
Hình 3.25
Hình 3.26
Hình 3.27
Hình 3.28
Hình 3.29
Hình 3.30
Hình 3.31
Hình 3.32
Hình 3.33
Hình 3.34
Quy trình chuyển gen vào thuốc lá thông qua vi khuẩn A.
tumefaciens
88
Một số hình ảnh chuyển các gen quan tâm vào thuốc lá thông
qua vi khuẩn A.tumefaciens
89
Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pK7WG2D35S:SSIV:T35S bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu
SSIV-Frag_F/R
91
Kiểm tra các dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI121C54:SSIV:NOST
Kết quả Southern blot các mẫu thuốc lá chuyển gen SSIV
Ảnh điện di RNA tổng số được tách từ các mẫu thuốc lá chuyển gen
Kết quả PCR nhân gen actin từ cDNA của lá từ một số dòng
thuốc lá chuyển gen
91
92
93
94
Điê ̣n di sản phẩ m RT-PCR của các gen SSIV ở các dòng thuốc
lá chuyển gen tương ứng
95
Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc
pK7WG2D-35S:SSIV:T35S
96
Nhuộm iodine lá một số dòng thuốc lá chuyển gen cấu trúc pBI
121 – C54:SSIV: NOST
Mô sẹo từ các nguồn nguyên liệu khác nhau
Các khối mô sẹo phân hóa các giai đoạn mô phôi khác nhau ở 5
giống sắn thí nghiệm
Chồi và cây sắn tái sinh từ mô sẹo phôi hóa
Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn đến khả năng biến nạp gen
GUS ở giống sắn HB80 và KM140
Một số hình ảnh chuyển gen GUS vào giống sắn HB80 và KM140
Một số hình ảnh chuyển gen pBI121-C54:SSIV:NOST vào
giống sắn KM140
Cây sắn giống KM140 chuyển gen SSIV được trồng ở nhà lưới
Điện di DNA tổng số các dòng sắn chuyển gen mang cấu trúc
pBI121-C54:SSIV:NOST
98
101
103
106
107
112
115
115
116
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với
cặp mồi promoter C54F/SSIV-R
116
Điện di kiểm tra sản phẩm PCR các dòng sắn chuyển gen với
cặp mồi virF/R
117
ix
DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Nghĩa tiếng Anh
Ký hiệu
µl
Microliter
µM
Micromolar
2.4D
axit 2,4-diclophenoxiaxetic
Nghĩa tiếng Việt
A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
AGPase
ADP-glucose pyrophosphorylase
AS
Acetosyringone
BAP
6 – Benzyl amino purine
bp
Base pair
cDNA
Complementary DNA
CG
cặp bazơ nitơ
Chuyển gen
CIAT
International Center for Tropical
Agriculture
CTAB
Cetyltrimethylammonium bromide
Trung tâm nông nghiệp
nhiệt đới quốc tế
Cộng sự, đồng tác giả
Cs, et al.,
DBE
Debranching enzyme
DNA
Deoxiribonucleic Acid
Đỏ ĐF
enzyme phân rã tinh bột
Đỏ địa phương
E.coli
Escherichia coli
EDTA
Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
EtBr
Ethidium Bromid
FEC
Friable embryo callus
Mô sẹo phôi hóa
GBSS
granule-bound synthetase
enzyme tổng hợp amylose
GUS
β –Glucuronidase gene
Gen GUS
HSPs
Heat shock proteins
IBA
Indol -3- butyric acid
Kb
Kilo base
Kinetin
6 – fufuryl amino purine
Km
Kanamycin
x
KM140
KM140 (KM98-1 x
KM36)
LB
Luria –Bertani
Môi trường LB
M
Marker
Thang chuẩn
mRNA
messenger RNA
RNA thông tin
MS
Murashige and Skoog
Môi trường MS
MTCL
Mg
Miligam
mg/L;
mg/mL; ng/g
Miligam/lit; miligam/mililit;
nanogam/gam
NAA
α – Napthyl acetic acid
nptII
Neomycin photphotranspherase gene
OD
Optical density
Mật độ quang học
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
Picloram
4-amino-3,4,5 tricloro pyridine - 2cacboxylic acid
RM
Rooted Medium
RT-PCR
Realtime polymerase chain reaction
SBE
Starch branching enzyme
enzyme phân nhánh tinh
bột
SS
Starch synthase
Enzyme sinh tổng hợp tinh
bột
SSIV
Starch synthase IV
Enzyme sinh tổng hợp tinh
bột nhóm IV
T-DNA
Transfer-DNA
DNA vận chuyển
Môi trường ra rễ
Trắng HB
Trắng Hòa Bình
Trắng NA
Trắng Nghệ An
WP
Working package
Dòng không chuyển gen
WT
X-gluc
Nội dung
5-bromo-4-chloro-3-indolyl
glucuronide
xi
1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây sắn (Manihot esculenta Crantz) là một trong những loại cây lương thực
chủ lực quan trọng nhất đối với nhiều nước trên thế giới do chúng khả năng cung
cấp carbonhydrate cao, thậm chí trong các điều kiện ngoại cảnh bất lợi như lượng
mưa thấp, hạn hán hoặc đất nghèo dinh dưỡng.
Hiện nay, trong bối cảnh biến đổi khí hậu làm trái đất nóng lên, nước biển
dâng cao, đe dọa an ninh lương thực thế giới và sự cạn kiệt của nguồn nguyên liệu
hóa thạch thì cây sắn được coi là cây trồng đem lại giải pháp kép nhằm đạt cả hai
mục tiêu: góp phần đảm bảo an ninh lương thực và cung cấp nguyên liệu cho công
nghiệp sản xuất nhiên liệu sinh học, từng bước thay thế nhiên liệu hóa thạch.
Trong kế hoạch 5 năm 2015 - 2020, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn
đưa ra chủ trương giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế
hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha vào năm 2015
và ổn định diện tích 450.000 ha vào năm 2020, năng suất đạt khoảng 21 tấn/ha. Nếu
đạt được theo kế hoạch với mức sản lượng 11 triệu tấn thì vẫn sẽ xảy ra tình trạng
tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản xuất ethanol với các nhà máy thức ăn
chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn và lượng sắn dùng cho xuất khẩu.
Tinh bột là thành phần quan trọng đối với thực vật cũng như là nguồn lương
thực và nguyên liệu công nghiệp. Hiện nay, việc cải tiến cây trồng theo hướng tăng
hàm lượng tinh bột là một trong những hướng nghiên cứu quan trọng và luôn được
các nhà khoa học quan tâm hàng đầu. Do vậy, các nghiên cứu tìm hiểu về con
đường tổng hợp và phân hủy tinh bột ở cây trồng nói chung và đối với sắn nói riêng
sẽ góp phần thúc đẩy mục tiêu cải tạo hàm lượng tinh bột.
Như vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm xây dựng hệ thống tái sinh in
vitro và chuyển gen tạo cây sắn có hàm lượng tinh bột cao, phù hợp với mục đích
sử dụng phục vụ cho công nghiệp và xuất khẩu là một vấn đề cấp thiết ở nước ta.
Ngoài ra, các hướng nghiên cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử và di truyền học ở
cây sắn chưa được quan tâm và phát triển nhiều. Đặc biệt, chưa có những nghiên
2
cứu sâu ở mức độ sinh học phân tử nhằm khai thác nguồn gen quý sẵn có từ các
giống sắn tại Việt Nam, phục vụ cho công tác cải tạo giống sắn bằng công nghệ gen.
Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi đề xuất nhiệm vụ nghiên cứu “Đánh giá
hoa ̣t đô ̣ng của mô ̣t số gen liên quan đến tổ ng hơ ̣p, tích lũy tinh bô ̣t và thử
nghiệm chuyển gen SSIV vào cây sắn”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Bước đầu đã chuyển được gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột SSIV dưới
sự điều khiển của promotor đặc hiệu C54 vào giống sắn KM140 nhờ A.tumefaciens
thông qua FEC.
3. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Lựa chọn giống sắn và phân tích sự biểu hiện của các gen liên
quan đến trao đổi chất tinh bột.
Nội dung 2: Phân lập gen SSIV liên quan đế n khả năng tổ ng hơ ̣p tinh bô ̣t, thiết
kế vector chuyển gen.
Nội dung 3: Đánh giá khả năng tổng hợp tinh bô ̣t của gen SSIV trên cây thuốc
lá mô hình.
Nội dung 4: Chuyể n gen SSIV vào cây sắ n.
4. Những đóng góp mới của luận án
+ Đã phân lập và đánh giá được hoạt động của gen SSIV liên quan đến quá
khả năng tổng hợp tinh bột từ lá và củ sắn.
+ Đã thu được những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pB121C54:SSIV-cmyc:NOST với mức độ tích lũy hàm lượng tinh bột cao hơn so với
những dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc pK7WG2D-35S:SSIV:T35S từ 19,7
– 48,1% và cao hơn 15,6 – 65,7% so với cây đối chứng.
+ Đây là công trình đầu tiên chuyển gen tăng cường sinh tổng hợp tinh bột
SSIV dưới sự điều khiển promoter đặc hiệu ở củ C54 vào mô sẹo phôi hóa (FEC)
của giống sắn KM140 thông qua A. tumefaciens. Kết quả bước đầu thu được 7 dòng
sắn chuyển gen dương tính khi kiểm tra với PCR.
3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án
5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu thu được trong luận án này bao gồm các gen và hệ thống
các vector chuyển gen thực vật mang gen liên quan tới quá trình sinh tổng hợp tinh
bột, được phân lập từ các giống sắn quan trọng đã được đánh giá chỉ tiêu nông sinh
học tại Việt Nam; cấu trúc vector mang gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector mang
gen đích, chủng vi khuẩn chứa vector chuyển gen và các quy trình đánh giá hoạt
động gen chuyển ở mức độ sinh học phân tử. Hơn nữa, hoạt động của các cấu trúc
vector chuyển gen SSIV có tăng khả năng tích lũy tinh bột còn được đánh giá, kiểm
tra thông qua biến nạp vào cây mô hình thuốc lá, cây sắn giống KM140. Đây chính
là tiền đề để phát triển các nghiên cứu ứng dụng tạo nên cây sắn chuyển gen mang
tính trạng có lợi.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đây là đề tài nghiên cứu đầu tiên áp dụng công nghệ gen, công nghệ sinh học
hiện đại nhằm tạo giống sắn năng suất cao tại Việt Nam dựa trên cơ sở khảo sát,
nghiên cứu hệ gen của chính các giống sắn thu thập tại Việt Nam. Do vậy, phạm vi
ứng dụng của đề tài không chỉ ở chuyển gen tăng cường khả năng tổng hợp tinh bột
vào sắn mà còn có thể ứng dụng ở các cây lương thực dự trữ tinh bột khác như
khoai tây, khoai lang.
4
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY SẮN VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HÀM LƯỢNG
TINH BỘT Ở SẮN
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
1.1.1.1. Nguồn gốc
Với những bằng chứng khảo cổ, có thể khẳng định cây sắn có nguồn gốc ở
vùng nhiệt đới của châu Mỹ Latinh, thuộc khu vực sông Amazon, được loài
người trồng cách đây 5000 năm. Nghiên cứu khảo cổ học cho thấy, một số di vật
củ sắn đã được tìm thấy có niên đại khoảng 2700 năm trước công nguyên ở
Venezuela và khoảng 2000 năm trước công nguyên ở vùng ven biển Peru. Trong
khi đó, những lò nướng bánh sắn phức hệ Ualabo có niên đại 1200 năm trước
công nguyên đã được tìm thấy ở phía Bắc Colombia và những hạt tinh bột có tuổi
khoảng năm 900 - 200 trước công nguyên trong những phần hóa thạch được phát
hiện tại Mexico cùng một số di tích khảo cổ học khác chứng tỏ cây sắn đã xuất
hiện và được trồng như một loại cây nông nghiệp từ rất lâu đời (Rogers, 1965). Ở
Châu Á, sắn được du nhập vào Ấn Độ khoảng thế kỷ XVII, Việt Nam và một số
nước khác trong khu vực Đông Nam Á vào thế kỷ XVIII. Tuy nhiên, đến thế kỷ
XIX, nghề trồng sắn và tiêu thụ sắn mới thực sự phát triển với sự du nhập các kỹ
thuật chế biến ở Brazin bởi các nô lệ. Từ đó đến nay, diện tích, năng suất và sản
lượng sắn ngày một tăng (Trần Ngọc Ngoạn, 2007).
1.1.1.2. Phân loại
Chi Manihot bao gồm những cây có hoa, hạt kín, có hai lá mầm, họ thầu
dầu. Vào năm 1651 Bauhin là người đầu tiên đã dùng danh từ Manihot để chỉ
chi này khi ông mô tả một mẫu cây đã được một thày tu Pháp A. Thevet mang từ
Brazin về, ông đặt tên loài là Manihot theveti. Có thể cho rằng loài cây đó hiện
nay người ta gọi tên là Manihot esculenta Crantz (Rogers, 1965).
Năm 1776, Crantz công bố sự mô tả loài với tên Manihot esculenta, căn cứ
5
vào một mẫu cây Merian mang về từ Surinam năm 1726. Sau đó nhiều tác giả
đã nghiên cứu về chi Manihot với các cách phân nhóm khác nhau. Đến năm 1938,
Cifferi trở lại cách gọi tên của Crantz, ông dùng lại tên loài M.esculenta và
không còn phân biệt giữa sắn đắng và sắn ngọt, ông cung cấp một quan niệm về
các giống trồng phổ biến (cultivar). Bảng phân loại cuối cùng của Rogers và
Appan (1973) là kết quả của một công trình nghiên cứu rất đầy đủ về chi
Manihot, tiến hành trong 20 năm với phương pháp phân loại số lượng.
1.1.2. Đặc điểm hình thái, sinh thái và di truyền
1.1.2.1. Đặc điểm hình thái
* Thân cây
Cây sắn thuộc loại thân gỗ, cao từ 1 - 3 m. Chiều cao của cây phụ thuộc vào
giống, điều kiện chiếu sáng, mức độ thâm canh, mật độ và thời vụ trồng. Thân sắn có
khả năng phân cành, tuy sự phân cành có ảnh hưởng đến khả năng ra hoa của cây.
Thân và cành già đã hoá gỗ có màu trắng bạc, xám, nâu hoặc hơi vàng. Số lượng thân
phụ thuộc vào cách đặt hom và số mắt trên hom. Về mặt cấu tạo, lớp cắt ngang thân
sắn có bốn lớp: trong cùng là lõi xốp, tế bào rất lớn; tiếp đến là tầng gỗ; mô mềm của
vỏ và ngoài cùng là lớp biểu bì rất mỏng. Khi nhân vô tính sắn người ta sử dụng các
đoạn hom lấy từ thân cây, vì vậy ngoài việc lựa chọn các đoạn hom đẹp, sạch bệnh,
phải giữ cho lớp biểu bì không bị sây sát vì lớp này có chức năng bảo vệ cho hom
không bị mất nước (Tribadi và cs., 2010; Ceballos & Cruz, 2012).
* Lá sắn
Lá sắn là loại lá đơn mọc xen kẽ trên thân, gồm hai phần cuống lá và phiến lá.
Cuống lá dài từ 3 - 30 cm với nhiều màu sắc khác nhau tuỳ theo giống (màu vàng,
xanh vàng, hồng, đỏ tươi). Phiến lá thường chia 5 - 7 thuỳ nhưng cũng có khi không
chia thuỳ. Lá của cây sắn mọc từ hạt thì phiến lá thường nguyên vẹn hoặc chí thuỳ
không đều. Các cây mọc từ hom, từ chỗ phân cành số thuỳ của phiến lá thường
giảm. Cấu tạo phiến lá gồm một lớp biểu bì phía trên có tầng cutin dày, tầng mô
dậu, tầng mô hổng và biểu bì. Mặt dưới có rất nhiều khí khổng đường kính khoảng
30 µm và có khoảng 700 lỗ/mm (Trần Ngọc Ngoạn, 2007; Tribadi và cs., 2010).
6
Hình 1.1: Đặc điểm cây sắn (Manihot esculenta Crantz)
(Nguồ n: Liu và cs., 2011)
Chú thích: A. Cây sắn khi trồng ở ruộng; B. Củ sắn khi thu hoạch; C. Cụm hoa; D. Quả
sắn; E. Hạt sắn; F. Cây con nảy mầm từ hạt; G. Thân sắn dùng để trồng cây.
* Hoa sắn
Hoa sắn là hoa đơn tính cùng gốc, mọc thành cụm, có cuống mọc ra từ chỗ
phân cành, ngọn thân. Một số giống sắn không có hoa do không có sự phân hoá
hoa hoặc do mầm hoa rụng đi. Những cụm hoa sinh ra từ những cành thấp thường
rụng sớm. Cụm hoa gồm một trục dài 2 - 10 cm và các trục bên hợp lại thành chuỳ
(Trần Ngọc Ngoạn, 2007).
Hoa cái có năm lá đài và có màu sắc sặc sỡ, ngoài rìa có lông. Giữa hoa cái có
một bầu hoa 6 cánh, chứa 3 lá noãn nằm ở trên đài. Trên bầu có 3 vòi nhuỵ ngắn với
đầu nhuỵ uốn cong. Hoa đực có 5 lá đài dính với nhau trên một nửa chiều dài, nhẵn
ở bên trong và có lông ở phía ngoài. Có khoảng 8 - 10 nhị đực xếp thành hai vòng
và mọc lên từ các thuỳ của mỗi đĩa phía dưới. Bao phấm mềm, hạt phấn 3 ngăn, dày
dính, màng ngoài hạt phấn có gai nhỏ (Ceballos and Cruz, 2012).
Số lượng hoa của mỗi giống sắn không giống nhau, thường hoa đực sẽ nhiều
hơn hoa cái nhưng hoa cái lại thường nở trước hoa đực để tránh hiện tượng tự thụ
phấn. Hoa cái nở cuối cùng thường nở cùng với hoa đực nở đầu tiên trên cây. Hoa
7
đực thường nở vào giữa trưa còn hoa cái thường khép lại vào cuối buổi chiều. Bao
phấn bắt đầu mở trước khi hoa nở khoảng 2 giờ và mở hoàn toàn trước khi hoa nở 1
giờ, sau đó phát tán nhờ gió hoặc côn trùng với phạm vi thụ phấn trong khoảng 30
cm. Tuổi thọ của hạt phấn là 1 tuần còn thời gian tiếp nhận hạt phấn của đầu nhuỵ
trong vòng 24 giờ. Sau 24 giờ, đầu nhụy bắt đầu héo, chuyển sang màu nâu, khô đi
và rụng chậm nhất sau 1 ngày. Thời gian từ lúc thụ phấn đến thụ tinh kéo dài từ 8 19 giờ (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos and Cruz, 2012).
* Quả và hạt
Quả sắn thuộc loại quả nang, mở khi chín, đường kính 1 - 1,5 cm. Quả có 3 ngăn
được tạo thành từ 6 cánh của bầu hoa, mỗi ngăn chứa 1 hạt. Màu sắc quả thường biến
đổi từ lục nhạt, hơi vàng dến lục hay đỏ tía. Cuống quả phình lên ở chỗ tiếp xúc với
quả. Sau khi chín, quả tự mở chỉ còn lại trục giữa của quả. Hạt sắn hình trứng, tiết diện
hơi giống hình tam giác. Hạt có vân hoặc những vết màu đỏ nâu trên nền kem hoặc
xám nhạt (Trần Ngọc Ngoạn 2007; Ceballos & Cruz, 2012).
* Rễ sắn
Rễ sắn có thể mọc ra từ hạt hoặc từ hom (đoạn thân cây được lựa chọn giữ lại làm
giống cho vụ kế tiếp). Rễ mọc từ hạt bắt đầu là một rễ mọc thẳng cắm xuống đất sau đó
các rễ phụ mọc ra, cả rễ cọc và rễ phụ đều có khả năng phát triển thành củ. Rễ mọc ra
từ hom đầu tiên thì mọc ngang sau đó cũng cắm thẳng xuống đất, rễ sắn có hai chức
năng chính là đồng hoá và dự trữ. Rễ đồng hoá thường cắm sâu trong lòng đất có thể
dài tới 30 cm để hút nước, chất dinh dưỡng và giúp cho cây vững chắc. Rễ dự trữ (rễ
củ) do các rễ con tập trung dinh dưỡng mà thành. Khi cây mới ra rễ thì có rất nhiều rễ
con nhưng sau đó chỉ có một số rễ con được tập trung dinh dưỡng phát triển thành củ.
Củ sắn thường có dạng hình trụ có thể dài tới 30 cm, có thể có hoặc không có cuống củ
(Ceballos & Cruz, 2012).
1.1.2.2. Đặc điểm sinh thái
Cây Sắn (Manihot esculenta Crantz) thuộc chi Manihot, họ Euphorbiaceae
sống ở vùng nhiệt đới và đã được di canh đến nhiều khu vực khác nhau trên thế
giới (Allem., 2002). Sắn được phân bố phổ biến từ 33 o vĩ Bắc đến 33o vĩ Nam.
- Xem thêm -