BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
--------------
TRẦN ĐÌNH ĐƯỜNG
KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordycep sp1. VÀ
Isaria javanica TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC
Vinh – 2011
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH
--------------
KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA Cordycep sp1. VÀ
Isaria javanica TRÊN MÔI TRƯỜNG RẮN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KỸ SƯ NGÀNH: NÔNG HỌC
Người thực hiện : Trần Đình Đường
Lớp
: 48K2 – Nông học
Người hướng dẫn : PGS.TS. Trần Ngọc Lân
Vinh – 2011
2
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực, các số liệu được thu thập qua các thí nghiệm do bản thân tiến
hành và chưa từng sử dụng để bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam đoan các thí nghiệm để thu thập số liệu trong luận văn đã được
chính bản thân tôi tiến hành tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học Nông
nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại Học Vinh với sự đồng ý và hướng dẫn của
PGS. TS Trần Ngọc Lân, giáo viên hướng dẫn và các kĩ thuật viên phụ trách phòng
thí nghiệm.
Tôi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Vinh, ngày 20 .tháng 07 năm 2011
Tác giả
Trần Đình Đường
3
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài luận văn tốt nghiệp ngành
kĩ sư Nông học, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý báu từ phía thầy cô, bạn bè,
người thân.
Với tấm lòng chân thành và sự biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm
ơn đặc biệt tới PGS. TS. Trần Ngọc Lân, Th.S Nguyễn Thị Thúy, KS Trần Văn
Cảnh, những người hướng dẫn tôi từ những bước đầu làm nghiên cứu khoa học, đã
rất tận tâm và nhiệt tình hướng dẫn tôi suốt thời gian làm đề tài luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong tổ bộ môn
Bảo vệ thực vật, các giáo viên phụ trách, các kĩ thuật viên phòng thí nghiệm đã tạo
mọi điều kiện về cơ sở vật chất cũng như sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý kiến cho
tôi trong suốt quá trình làm đề tài.
Và tôi xin được chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè
đã động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành
luận văn này.
Vinh, ngày 20 tháng 07 năm 2011
Tác giả
Trần Đình Đường
4
MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các bảng số liệu
Danh mục các hình vẽ
Danh mục chữ cái viết tắt
1.
2.
3.
3.1.
3.2.
3.3.
4.
1.1
MỞ ĐẦU
Lý do chọn đề tài
Mục đích nghiên cứu
Đối tượng, phạm vi và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
Cơ sở khoa học
i
ii
Vi
Vii
ix
1
1
4
4
4
4
4
5
6
6
1.1.1.
1.1.2.
1.1.3.
1.1.3.1.
1.1.3.2.
1.2.
Nấm ký sinh côn trùng
Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng
Giả thuyết khoa học
Câu hỏi nghiên cứu
Giả thuyết khoa học
Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Cordyceps và Isaria
6
7
10
10
10
1.2.1.
1.2.2.
trên thế giới
Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng loài Cordyceps
Các hoạt chất sinh học có trong nấm Cordyceps và nấm Isaria
10
10
11
1.2.2.1.
1.2.2.2.
1.2.3.
1.2.4.
1.3.
Các hoạt chất sinh học có trong nấm Cordyceps
Các hoạt chất sinh học có trong nấm thuộc nhóm Isaria
Tình hình nghiên cứu về công nghệ lên men
Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm từ nấm Cordyceps
Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm ký sinh côn trùng ở
11
13
14
17
19
Việt Nam
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.
Quy trình nghiên cứu
2.2.
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
2.3.
Vật liệu nghiên cứu
2.4.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1.
Phương pháp thu thập nấm ký sinh côn trùng
2.4.1.1. Đặc điểm của nơi thu thập
2.4.1.2. Phương pháp thu thập
5
21
21
22
22
22
22
22
23
2.4.1.3. Thời gian thu thập
2.4.2.
Phương pháp phân lập và bảo quản giống
2.4.2.1. Môi trường nuôi cấy
2.4.2.2. Phương pháp phân lập
2.4.2.3. Phương pháp cấy truyền
2.4.2.4. Phương pháp bảo quản giống
2.4.3.
Phương pháp xác định số lượng bào tử
2.4.4.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.4.4.1. Thí nghiệm nhân nuôi nấm Isaria javanica trên môi trường rắn
2.4.4.2. Thí nghiệm nhân nuôi nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn
2.5.
Phương pháp xử lý số liệu
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1.
Đặc điểm hình thái của nấm ký sinh côn trùng Cordyceps
23
24
24
25
25
27
28
30
3.1.1.
3.1.2.
3.2.
sp1. và Isaria javanica
Đặc điểm hình thái nấm ký sinh côn trùng Cordyceps sp1.
Đặc điểm hình thái của Isaria javanica
Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt đến sự sinh trưởng và
31
31
33
36
3.2.1.
phát triển của Cordyceps sp1. và Isaria javanica
Ảnh hưởng của hàm lượng gạo tới khả năng sinh trưởng và phát
36
3.2.2.
triển của sợi nấm Cordyceps sp1. trên môi trường rắn
Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt tới khả năng sinh trưởng,
3.2.3.
phát triển của sợi nấm Isaria javanica trên môi trường rắn
Khả năng phát sinh bào tử trên môi trường rắn của Cordyceps
40
41
3.2.4.
3.3.
sp1.
Khả năng phát sinh bào tử của nấm Isaria javanica
Ảnh hưởng của hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng sinh
42
42
3.3.1.
3.3.2.
3.3.3.
trưởng và phát triển của nấm C. sp1. và Isaria javanica
Sinh trưởng của Cordyceps sp1. trên môi trường rắn
Sinh trưởng của Isaria javanica trên môi trường rắn
Khả năng phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. khi thay đổi
42
45
47
3.3.4.
lượng bột nhộng tằm
Khả năng phát sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên môi
50
3.4.
trường rắn
Xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1. và
51
nấm Isaria javanica
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Kiến nghị
TÀI LIỆU THAM KHẢO
54
54
55
56
6
30
30
32
PHỤ LỤC
DANH MỤC CẤC BẢNG SỐ LIỆU
Bảng
Bảng 3.1.
Tên bảng
Trang
Khả năng bao phủ bề mặt môi trường rắn của nấm
35
Bảng 3.2.
Cordyceps sp1.
Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường rắn của
nấm Cordyceps sp1. ở các công thức.
Ảnh hưởng của hàm lượng gạo lứt tới khả năng bao
36
Bảng 3.3.
37
Bảng 3.4.
phủ bề mặt môi trường của nấm Isaria javanica.
Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường rắn của
38
Bảng 3.5.
nấm Isaria javanica.
Khả năng phát sinh bào tử của Cordyceps sp1. trên
cơ chất gạo lứt ở môi trường rắn.
Khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên
40
Bảng 3.6.
41
Bảng 3.7.
môi trường rắn.
Khả năng sinh trưởng của nấm Cordyceps sp1. trên
43
Bảng 3.8.
bề mặt môi trường rắn.
Khả năng bao phủ toàn bộ khối môi trường của nấm
Cordyceps sp1. trên môi trường rắn theo lượng bột
43
Bảng 3.9.
nhộng tằm
Khả năng sinh trưởng của nấm trên môi trường rắn
cơ chất thay đổi.
45
Bảng 3.10.
Khả năng bao phủ toàn bộ khối cơ chất của nấm
46
Bảng 3.11.
Isaria javanica.
Ảnh hưởng của hàm lượng bột nhộng tằm đến khả
năng sinh bào tử của nấm C. sp1.
48
7
Bảng 3.12.
Khả năng sinh bào tử của trên môi trường rắn của
49
Isaria javanica.
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Hình
Hình 1.1.
Hình 1.2.
Hình 2.1.
Hình 3.1.
Hình 3.2.
Nội dung
Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng
Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng
Mô tả phương pháp chuẩn bi môi trường rắn
Mẫu nấm Cordyceps sp1.
Mẫu Isaria javanica. trên môi trường PDA và bào tử
Trang
07
09
26
32
Hình 3.3.
quan sát dưới kính hiển vi.
Sự phát triển của sợi nấm Cordyceps sp1. trên bề
34
35
Hình 3.4.
mặt môi trường
Sự phát triển ăn sâu vào môi trường của nấm
36
Hình 3.5.
Cordyceps sp1
Khả năng bao phủ bề mặt môi trường của Isaria
37
Hình 3.6.
javanica
Sự phát triển ăn sâu vào môi trường của Isaria
38
Hình 3.7.
Hình 3.8.
javanica
Nhân nuôi Isaria javanica
Sự phát sinh bào tử trên cơ chất gạo lứt của nấm
39
40
Hình 3.9.
Cordyceps sp1.
Nấm Cordyceps sp1 trên môi trường rắn với cơ chất
41
Hình 3.10.
gạo lứt
Khả năng sinh bào tử của nấm Isaria javanica trên
41
Hình 3.11.
Hình 3.12.
môi trường rắn với cơ chất gạo lứt
Khả năng sinh trưởng bề mặt
Sự tăng trưởng về khối lượng và độ dày của
43
44
Hình 3.13.
Hình 3.14
Hình 3.15 .
Cordyceps sp1
Cordyceps sp1. trên bề mặt môi trường.
. Cordyceps sp1 sau 8 ngày nhân nuôi
Ảnh hưởng hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng
44
44
45
Hình 3.16.
bao phủ bề mặt môi trường của nấm Isaria javanica
Isaria javanica trên môi trường rắn thay đổi hàm
45
lượng nhộng tằm
8
Hình 3.17.
Khả năng ăn sâu và phủ kín khối môi trường của
46
Hình 3.18.
nấm I. javanica
Ảnh hưởng hàm lượng bột nhộng tằm đến khả năng
49
phát sinh bào tử của nấm Cordyceps sp1. trên môi
Hình 3.19.
Hình 3.20.
Hình 3.21.
trường rắn
Sự phát sinh bào tử nấm
I. javanica sau 9 ngày.
Sơ đồ quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1.
và I. javanica
DANH MỤC CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT
Chữ viết tắt
BN
Bt
C
Nội dung
Bột gạo nếp
Bào tử
Các bon
9
49
49
52
C.
CT
ĐTHT
CV%
EPF
Lsd0.05
MT
N
PDA
SD
TB
VQG
Cordyceps
Công thức
Dông trùng - Hạ thảo
Độ biến thiên của mẫu
Entomology Pathogenic Fungi – Nấm ký sinh côn trùng
phương sai mẫu
Môi trường
Ni tơ
Potato Dextrose Agar
Độ lệch chuẩn
Trung bình
Vườn Quốc Gia
10
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn dề tài
Nấm ký sinh côn trùng - Entomology pathogenic fungi (EPF) hay nấm côn
trùng (Insect fungi) không chỉ là một nhóm có tính đa dạng sinh học cao, nguồn lợi
tài nguyên quý giá mà còn có vai trò rất quan trọng trong phòng trừ sinh học sâu hại
cây trồng và trong y - dược. Theo đánh giá của David Hawkswrth, trong tự nhiên có
khoảng 1,5 triệu loài EPF đang chờ các nhà khoa học khám phá. Cho đến nay, trên
thế giới có khoảng 700 loài EPF đã được xác định. Trong đó ở Thái Lan đã phát hiện
được hơn 400 loài nấm ký sinh côn trùng (Morakot, 2003) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân,
2007) [11].
Nấm ký sinh côn trùng được sử dụng nhiều để sản xuất các hoạt chất sinh
học, enzim, sản xuất thuốc chữa bệnh cũng như các chất tăng cường sinh lực cho
con người như Cordyceps sinensis “Đông trùng - Hạ thảo” (Nguyễn Lân Dũng và
nnk, 2005) [3].
Nấm ký sinh côn trùng được xem như là nguyên liệu sản xuất thủ công nghiệp
và công nghiệp các chất y - dược chữa nhiều bệnh cho con người, như ở Trung
Quốc hiện có ít nhất 25 sản phẩm của Cordyceps sinensis từ công nghệ sinh học
nấm ký sinh côn trùng (www.made-in-china.com). Các quốc gia phát triển Hoa Kỳ,
Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công và triển khai
nhân nuôi sản xuất nấm ký sinh côn trùng ở quy mô nông hộ, quy mô thủ công
nghiệp và quy mô công nghiệp.
Cordyceps là một giống nấm côn trùng thuộc giống nấm túi (Ascomycetes),
bộ Clavicipitales, họ Clavicipitaceae. Tất cả các loài Cordyceps ký sinh chủ yếu trên
côn trùng và động vật chân khớp, một số ít ký sinh trên các loài nấm khác. Loài
được biết đến nhiều nhất của giống là Cordyceps sinenesis - nấm phát triển trên sâu
bướm thực vật, một thành phần quý giá trong các vị thuốc cổ truyền của Trung Hoa
[12].
Trên thế giới hiện có hơn 400 loài của giống Cordyceps đã được mô tả, trong
khi đó ở Trung Quốc đã tìm thấy hơn 60 loài, nhưng cho đến nay mới chỉ tập trung
11
nghiên cứu trên 2 loài chủ yếu (Cordyceps sinensis (Beck.) Sacc. - Đông trùng Hạ
thảo và Cordyceps militaris (L. Ex Fr.) Link - Nhộng trùng thảo)
(http://www.sgtt.com.vn) [13].
Cùng nằm trong họ Cordycipitaceae với loài Cordyceps nhưng sinh sản ở
dạng vô tính, loài Isaria javanica và một số loài khác (Sung et al, 2007) qua phân
tích hóa sinh cho thấy những hoạt chất sinh học độc đáo tiềm ẩn.
Giống nấm Cordyceps và loài Isaria là giống nấm đặc biệt, có nhiều ứng dụng
để sản xuất ra các hoạt chất sinh học, sản xuất thuốc chữa bệnh và các sản phẩm
chức năng nhằm tăng cường sinh lực của con người.
Chính vì những tính chất độc đáo về dược liệu đã tạo nên giá trị hàng hóa khá
cao và được sử dụng ngày càng rộng rãi, tăng liều lượng dẫn đến thu hoạch quá
mức làm giảm nguồn tài nguyên hoang dã, mặt khác đề phục vụ cho những nghiên
cứu sâu hơn về nấm ký sinh côn trùng và nấm dược liệu nên người ta cần một số
lượng lớn. Để bù đắp cho sự thiếu hụt đó các nhà khoa học đã tiến hành mở rộng
nghiên cứu nhân nuôi nhân tạo trên các chất nền như các loại hạt ngũ cốc, sâu non,
tằm, nhộng tằm và một số nguyên liệu khác bằng việc mô tả các đặc điểm tự nhiên
của chúng. Đặc biệt là sự thành công về nhân nuôi Cordyceps trên môi trường rắn
nhân tạo, tạo ra các hoạt chất sinh học, các thực phẩm chức năng có giá trị dinh
dưỡng cao.
Các nước Tây Âu gọi thực phẩm chức năng (functional) là dược phẩm dinh
dưỡng (nutraceutics) hay thực phẩm bổ sung dinh dưỡng (food suplement), còn ở
Trung Quốc gọi là thực phẩm bổ dưỡng bảo vệ sức khỏe. Loại thực phẩm này nằm
giữa ranh giới giữa thức ăn và thuốc chữa bệnh. Các loại hoạt chất mà thực phẩm
chức năng mang lại cho con người chính là những vị thuốc quý giúp con người
phòng và chữa bệnh, kể cả những bệnh hiểm nghèo. Theo dự báo của các chuyên
gia, thì “thức ăn của con người trong thế kỷ XXI là thực phẩm chức năng” (Nguyễn
Tài Lương, 2008) [7]
Các nghiên cứu trong y học và dược hoc đã chứng minh nấm thuộc loài
Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) có tới 25 tác dụng về các chức năng và
12
bệnh thuộc thận, huyết áp, tim mạch, nội tiết tố, miễn dịch, ung thư, an thần, ...
(Nguyễn Lân Dũng, 2005) [2].
Các nghiên cứu phân tích hóa sinh cho thấy trong sinh khối (biomas) của nấm
ký sinh côn trùng, như Cordyceps sinensis và Cordyceps militaris có tới 17 axit
amin khác nhau, có chứa nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si, K, Na, ...), các loại
vitamin (như A, B12, B2, C, ...) và quan trọng nhất là có nhiều hoạt chất sinh học có
giá trị dược liệu thần kỳ (như HEAA - Hydroxy ethyl adenosine analogs,
cordyceptic acid, cordycepin, adenosine, ...) [6]. Loài nấm ký sinh côn trùng
Cordyceps unilateralis có các dẫn xuất của napthoquinone có hoạt chất sinh học cao
như eythrostominone, deoxyrythostominone, 4- O - methyl erythrostominone,
epierythrostominol, deoxyerythrosstominol và đặc biệt là 3,5 - β - trihydrooxy - 6 methoxy - 2 - (5 - oxyohexa - 1,3 - dienyl) - 1,4 - naphthoquinone được xem như là
chất có khả năng chống lại bệnh sốt rét (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11, tr. 1 2 ], và qua nghiên cứu, hóa phân tích sơ bộ cho thấy loài một số loài như Isaria
javanica, Cordyceps sp1. (VN1331), có một số thành phần hóa học đặc biệt mới, đã
mang đến nhiều hy vọng về tính chất dược lý quan cũng như dạng thực phẩm chức
năng quan trọng từ các loài này.
Đối với Việt Nam, công nghệ nấm ký sinh côn trùng là một lĩnh vực mới, đặc
biệt là đối với các loài nấm ký sinh côn trùng có các hoạt chất sinh học cao và dùng
làm dược liệu. Cho đến nay nước ta chỉ mới có một số công trình nghiên cứu ứng
dụng nấm ký sinh côn trùng như Beauveria và Metarhizium, trong tự nhiên còn rất
nhiều loài nấm ký sinh côn trùng mà ta chưa biết đến.
Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng công nghệ sinh học Nông nghiệp, Trường
Đại học Vinh (CRABTA - VU) đã thu thập được trên lớp dất mặt của rừng nguyên
sinh thuộc vườn quốc gia Pù Mát - Nghệ An mẫu nấm ký sinh côn trùng Cordyceps
sp1. (ở độ cao 800 - 1000 m so với mực nước biển), Isaria javanica và nhiều mẫu
nấm ký sinh côn trùng khác. Qua nghiên cứu cho thấy rằng, loài Cordyceps sp1. có
những điểm giống và có những điểm không giống với loài Cordyceps sinensis của
Trung Quốc (Trần Ngọc Lân và cs., 2008).
13
Việc tiến hành thu thập và tìm ra được mâu nấm Cordyceps sp1. và Isaria
javanica đã mang đến triển vọng lớn, hứa hẹn các nghiên cứu về Đông trùng - Hạ
thảo ở Việt Nam. Tuy nhiên việc chứng minh được tác dụng của nấm ký sinh côn
trùng thông qua các chất có hoạt tính sinh học cao và nghiên cứu các thực phẩm
chức năng đòi hỏi phải tiến hành nhiều nghiên cứu, nhiều phân tích tỉ mỉ. Trong khi
đó, qua nhiều đợt thu thập thì mẫu vật Cordyceps sp1. có được chỉ dừng lại ở một
vài mẫu. Chính vì vậy, cần tiến hành các nghiên cứu để tìm ra phương pháp nhân
nhanh sinh khối nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica. Trên cơ sở đó, chúng tôi
tiến hành đề tài:
“Quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1., Isaria javanica trên môi
trường rắn”.
2. Mục đích nghiên cứu
Đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. và Isaria
javanica trên môi trường rắn với các hàm lượng cơ chất khác nhau và phương pháp
nhân nhanh sinh khối thích hợp. Từ đó xây dựng quy trình nhân nhanh sinh khối
nấm, phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng trong phòng trừ sinh học và y - dược.
3. Đối tượng, phạm vi và nội dung nghiên cứu
3.1. Đối tượng nghiên cứu
Loài nấm Cordyceps sp1. và Isaria javanica được nhóm nghiên cứu của
Trung tâm Nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ sinh học Nông nghiệp, trường Đại
học Vinh (CRABTA - VU) thu thập trên đất mặt của rừng nguyên sinh thuộc Vườn
Quốc gia Pù Mát - Nghệ An vào tháng 1 năm 2008.
3.2. Phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bảo vệ thực vật và phòng
thí nghiệm Công nghệ sinh học Nông nghiệp, khoa Nông Lâm Ngư, trường Đại học
Vinh trong thời gian từ tháng 01 năm 2010 đến tháng 07 năm 2010.
3.3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được tiến hành nghiên cứu với các nội dung sau:
14
- Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của nấm Cordyceps sp1. trên môi
trường rắn.
- Đánh giá sự sinh trưởng, phát triển của nấm Isaria javnica trên môi trường
rắn.
- Hoàn thiện và xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm Cordyceps sp1 và
Isaria javnica trên môi trường rắn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
Đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cho những nghiên cứu sâu hơn trong
nghiên cứu nhân nuôi nấm ký sinh côn trùng. Kết quả của đề tài sẽ bổ sung cho
những nghiên cứu trước đó về nấm Cordyceps sp1 và Isaria javanica, đồng thời làm
cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về nấm ký sinh côn trùng.
15
Chương 1.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Cơ sở khoa học
1.1.1. Nấm ký sinh côn trùng
“Nấm ký sinh côn trùng – Entomology pathogenic fungi (EPF)” hay “nấm
côn trùng – Insect fungi” là khái niệm được các nhà khoa học sử dụng như là một
thuật ngữ đồng nghĩa, đề cập về nhóm sinh vật (nấm) ký sinh gây bệnh cho côn
trùng.
Nấm ký sinh côn trùng vừa là nhóm có tính đa dạng sinh học cao: trên thế
giới có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó ở Thái Lan có khoảng 70000 – 150000
loài nấm và hơn 2000 loài nấm ký sinh côn trùng. Vừa có vai trò quan tronhj trong
phòng trừ sinh học sâu hại cây trồng và trong y dược [11,tr.1].
Nấm ký sinh côn trùng được chia thành 4 nhóm (Evan, 1988) (Dẫn theo Trần
Ngọc Lân, 2008) [11]
- Ký sinh trong tức là nấm ký sinh trong các nội quan, xoang cơ thể của côn
trùng ký chủ.
- Ký sinh ngoài tức là nấm phát triển trên lớp vỏ cuticun của cơ thể côn trùng
và gây nên bẹnh hại cho ký chủ côn trùng.
- Nấm mọc trên côn trùng tức là những nấm đã trực tiếp hoặc gián tiếp chứng
minh chúng ký sinh trên côn trùng (Samson et al., 1988).
- Cộng sinh, tức là nấm và côn trùng cùng nhau mang lại những lợi ích cho
nhau trong mối quan hệ cùng nhau chung sống.
Nấm còn được chia ra thành ký sinh sơ cấp (primery pathogen) và ký sinh thứ
cấp (secondary pathogen) (Pu và Li, 1996). Nấm ký sinh sơ cấp thường nhiễm vào ký
chủ côn trùng khỏe mạnh, gây bệnh và sau đó giết chết côn trùng. Trong khi đó, nấm
ký sinh thứ cấp chỉ có thể ký sinh trên những côn trùng bị yếu hoặc côn trùng bị
thương. Các mầm bệnh ký sinh trên côn trùng trưởng thành hoặc côn trùng bị bệnh
được gọi là ký sinh cơ hội hoặc ký sinh không chuyên tính, loại ký sinh này có thể
nhiễm vào ký chủ thông qua sự xâm nhập qua lớp cuticun vỏ cơ thể của côn trùng.
16
Các nấm ký sinh trên côn trùng bị thương gọi là bệnh lây qua vết thương. Sự khác
nhau của ký sinh cơ hội và ký sinh qua vết thương đó là ký sinh qua vết thương chỉ
có thể xâm nhập vào côn trùng qua vết thương.
Như vậy, nấm ký sinh côn trùng (EPF) được dùng để mô tả hiện tượng nấm
ký sinh trên hoặc trong ký chủ côn trùng. Theo Tzean và cs (1997), khái niệm này
cũng được dùng cho nấm ký sinh trên nhện bởi vì nhện và côn trùng là 2 nhóm
(lớp) trong một ngành (phyllum) Động vật chân khớp (Arthropoda) và chúng có
cùng kiểu sinh thái ăn thực vật hoặc ăn thịt và sinh sống chủ yếu trên cây (Dẫn theo
Trần Ngọc Lân, 2008) [11, tr. 5].
1.1.2. Cơ chế tác động của nấm lên cơ thể côn trùng
Nấm ký sinh côn trùng có thể xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng qua con
đường hô hấp, tiêu hóa hoặc qua cơ quan sinh dục, nhưng phần lớn là qua lớp vỏ
cuticun của chúng. Tức là phải có sự tiếp xúc của bào tử nấm và bề mặt cơ thể
vật chủ. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, khi đủ điều kiện ẩm độ bào
tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp cuticu n.
Hình 1.1. Chu trình xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng
(Nguồn: Cheah, C., M. E. Montgomery, S, Salom, B. L. Parker, S. Costa, and M.
Skinner, 2004).
Nấm xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng gồm 3 giai đoạn chính:
(i) Giai đoạn xâm nhập
Tính từ khi bào tử nấm mọc mầm đến lúc hoàn thành việc xâm nhập vào trong
xoang cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm phát sinh mầm bệnh, nó giải
17
phóng các enzym ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ cuticun
của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như Protease, chitinase, lipase, aminopeptidase,
carboxypeptidase A, esterase, N - axetylglucosaminidase, cenlulase. Các enzym này
được tạo ra một cách nhanh chóng, liên tục và với mức độ khác nhau giữa các loài và
thậm chí ngay trong một loài.
Enzym protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân
hủy lớp da côn trùng (cuticula) và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Lipase,
cenlulase và các enzym khác cũng là những enzym có vai trò không kém phần quan
trọng. Nhưng quan trọng hơn nhất là enzym phân hủy protein (protease) và enzym
phân huỷ kitin (chitinase) của côn trùng. Hai enzym này có liên quan trực tiếp đến
hiệu lực diệt côn trùng của nấm ký sinh côn trùng (Lerger R. J. et al., 1986; Charley
A. K. et al., 1991; Eguchi M., 1992; Tạ Kim Chỉnh và cs., 2005; Hà Thị Quyến và
cs., 2005; Janet Jennifer et al., 2006) [1, 10, 14, 15, 21].
(ii) Giai đoạn phát triển của nấm trong cơ thể côn trùng cho đến khi côn trùng chết
Đây là giai đoạn sống ký sinh của nấm. Trong xoang cơ thể côn trùng nấm tiếp
tục phát triển, hình thành rất nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi nấm được hình thành
trong cơ thể, nó phân tán khắp cơ thể theo dịch máu, phá hủy các tế bào máu và làm
giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ phận nội quan bị xâm nhập. Nấm
thường xâm nhập vào khí quản làm suy yếu hô hấp. Hoạt động của côn trùng trở
nên chậm chạp và phản ứng kém với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả là
vật chủ mất khả năng kiểm soát hoạt động sống và dẫn đến chết (David Pramer,
1965; Phạm Văn Lầm, 2000) [9 ].
(iii) Giai đoạn sinh trưởng của nấm sau khi vật chủ chết
Ở bên trong cơ thể côn trùng, sợi nấm sinh trưởng và nhân lên nhanh chóng.
Một số loài nấm tiếp tục sinh trưởng ở dạng sợi nấm. Tuy nhiên, hầu hết các loài nấm
ký sinh côn trùng nhân lên giống như pha lên men tạo blastospore và phát triển mạnh
trong toàn bộ cơ thể côn trùng. Hệ thống miễn dịch của ký chủ côn trùng sử dụng cơ
chế thực bào và tiết ra các hợp chất đối kháng (như quinine và melanine).
18
Đầu tiên, cơ thể côn trùng phải xác định cơ thể ngoại lai và tạo ra phản ứng
miễn dịch (Latge et al., 1984). Tuy nhiên, nấm ký sinh côn trùng phát triển rất nhanh
thông qua việc tái sản xuất nhanh chóng sợi nấm làm áp đảo hệ thống miễn dịch của
côn trùng. Hơn thế nữa nấm còn tạo ra các dạng độc tố và một số công cụ tấn công khác
để giết chết côn trùng (Gillespie & Claydon, 1989; Butt & Goettel, 2000), chính những
độc tố và công cụ tấn công này đã phá hủy cơ chế kháng của ký chủ. Hầu hết các nấm
bất toàn (inperfect fungi) thường tạo ra độc tố và giết chết côn trùng trong một thời
gian ngắn hơn là nấm có giai đoạn sinh sản hữu tính. Trong giai đoạn đầu độc ký chủ,
một số loài nấm bất toàn giết chết ký chủ trước khi gây hại ra toàn bộ cơ thể côn
trùng và trên cơ thể côn trùng quan sát thấy rất ít sợi nấm.
Điều đó chứng tỏ côn trùng bị chết vì chất độc được tiết ra từ nấm ký sinh (Li &
Fan, 1998). Một số loài nấm ký sinh đáh lừa hệ thống miễn dịch của ký chủ, làm cho
chúng không nhận biết được cơ thể ngoại lai và làm cho hệ thống miễn dịch của côn
trùng mất tác dụng (Evan, 1988) (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2007) [11].
Hình 1.2. Cơ chế xâm nhiễm của nấm ký sinh côn trùng
(Nguồn: Thomas M.B. & Read A.F., 2007)
Sau khi giết chết côn trùng, nấm ký sinh tạo ra các hợp chất có hoạt tính sinh
học cao để nấm có thể tiếp tục sinh trưởng hoại sinh. Cuối cùng , bên trong cơ thể
côn trùng được thay thế bởi sợi nấm. Trong điều kiện môi trường thích hợp sợi nấm
19
sinh trưởng ra ngoài tạo ra các cấu trúc sinh sản và phát tán bào tử sang các ký chủ
khác. Trong điều kiện không thích hợp, hầu hết các loài nấm ký sinh côn trùng có
thể tạo ra dạng bào tử nghỉ (như chlamydospore, zygospore và oospore) hoặc tạo ra
dang bào tư hữu tính (ascospore). Những dạng bào tử này cho phép nấm qua đông
hoặc chống chịu với các điều kiện bất thuận (Latge et al., 1978; McCoy, 1981 và
Pendland, 1982).
1.1.3. Giả thuyết khoa học
1.1.3.1. Câu hỏi nghiên cứu
- Nấm Cordyceps và Isaria javanica sinh trưởng, phát triển trên cơ thể côn trùng
vậy nó có thể sinh trưởng và phát triển tốt trên môi trường nhân tạo được không ?
- Nguồn dinh dưỡng nào phù hợp cho nấm sinh trưởng và phát triển ?
1.1.3.2. Giả thuyết khoa học
- Nấm ký sinh côn trùng có khả năng mọc trên nhiều loại môi trường khác nhau.
- Hầu hết các nguồn dinh dưỡng mà con người sử dụng được thì nấm ký sinh
côn trùng cũng sử dụng được và các loại môi trường khác nhau thì khả năng sinh
trưởng, phát triển của nó cũng khác nhau.
1.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng nấm Cordyceps và Isaria trên thế giới
1.2.1 Nghiên cứu về đa dạng nấm ký sinh côn trùng loài Cordyceps
Theo Steinhaus (1956, 1975), bức tranh minh họa về nấm ký sinh côn trùng
được xuất bản năm 1726 và có thể bức tranh đó mô tả loài Cordyceps sinensis (Berk.)
Sacc. ký sinh trên ấu trùng bộ Lepidoptera. Theo Pu & Li trong cuốn “Shennong ben
cao jing” ứng dụng nấm ký sinh côn trùng (Beuaveria sp.) như một loại thuốc được mô
tả gần khoảng 200 năm trước công nguyên ở Trung Quốc. Đến Triều đại Nhà Minh
(1578), loài Cordyceps sinensis (Đông trùng - Hạ thảo) được xác định bởi Li Shin Zhen là có giá trị trong y dược và được mô tả trong cuốn “Compendium of Chinese
Materia Medica” (Dẫn theo Trần Ngọc Lân, 2008) [11].
Các nhà khoa học BIOTEC đã phân loại về hình thái, sinh học các loài
Cordyceps bằng sinh học phân tử DNA (Gi - Ho Sung, Nigel L. Hywel - Jones et
20
- Xem thêm -