VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Nguyễn Thị Minh Thanh
(Times New Roman, 15, Bold, Viết chữ thường)
NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH HỆ GEN CÁC DÒNG
TÔM SÚ (Penaeus monodon) VIỆT NAM NHẰM
PHỤC VỤ CÔNG TÁC CHỌN GIỐNG TÔM
(Times N
ew Roma, Bold, Viết chữ in)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 9 42 01 21
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đinh Duy Kháng
Viện Công nghệ sinh học
2. PGS.TS. Nguyễn Hữu Ninh
Viện Nghiên cứu nuôi trồng thủy sản III
Hà Nội, 2019
LỜI CẢM ƠN
Với tất cả tấm lòng, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tới
PGS.TS Đinh Duy Kháng - Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh
học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và PGS.TS Nguyễn Hữu
Ninh - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản III là những người Thầy
đã tận tình hướng dẫn, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi ngay từ những ngày đầu
thực hiện luận án cho đến lúc hoàn thành.
Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Đồng Văn Quyền - Phó Viện trưởng, Trưởng
Phòng Vi sinh vật học phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi thực hiện các nghiên cứu tại
Phòng vi sinh vật học phân tử và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen. Tôi
cũng xin chân thành cảm ơn Tập thể cán bộ nghiên cứu của Phòng Vi sinh vật học
phân tử đã giúp tôi học hỏi thêm những kiến thức và kỹ thuật về sinh học phân tử và
tin sinh học trong quá trình thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hảo và tập thể nghiên cứu tại Viện
Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã giúp đỡ tôi cũng như nhóm thực hiện đề tài
trong việc thu mẫu và thực hiện một phần nội dung nghiên cứu quan trọng của luận
án về di truyền số lượng.
Tôi xin trân trọng cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn và tập thể nghiên cứu tại Viện
nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện kỹ thuật GBS.
Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Viện Công nghệ sinh học - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và
nghiên cứu tại Viện trong suốt những năm qua.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà đã giúp đỡ tôi hoàn thành các
thủ tục cần thiết trong thời gian học tập và bảo vệ luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Biên tập Tạp chí Công nghệ sinh học đã hỗ trợ
tôi và nhóm nghiên cứu đăng tải các công bố liên quan đến luận án.
i
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Công nghệ Đông Á
nơi tôi đang công tác đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi làm nghiên
cứu sinh để tôi có thể vừa công tác vừa học tập và hoàn thành luận án của mình.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn và mong muốn nhận được những ý kiến đóng
góp quý báu đến từ các chuyên gia, các nhà nghiên cứu và các đồng nghiệp để giúp
tôi chỉnh sửa hoàn thiện nội dung luận án.
Cuối cùng, tôi xin được nói lời biết ơn sâu sắc đến những người thân trong gia
đình và những người bạn, những đồng nghiệp thân thiết đã luôn bên cạnh, giúp đỡ,
động viên, hỗ trợ về mọi mặt và khích lệ để tôi có thể vượt qua mọi khó khăn trong
thời gian dài học tập và nghiên cứu để có thể hoàn thành được luận án.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thị Minh Thanh
ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan:
Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các
cộng sự khác.
Các số liệu và kết quả trình bày trong Luận án là trung thực, một phần đã
được công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý của các đồng
tác giả, phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.
Hà Nội, ngày
tháng
năm 2019
Tác giả
Nguyễn Thị Minh Thanh
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...............................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................... vii
DANH MỤC CÁC BẢNG .........................................................................................ix
DANH MỤC CÁC HÌNH ..........................................................................................xi
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................ 5
1.1.
Tôm sú Penaeus monodon ................................................................................ 5
1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý ................................................. 5
1.1.2. Khái quát tình hình nuôi tôm sú trên thế giới và ở Việt Nam ............................. 8
1.2. Các kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử thông dụng ..................................... 14
1.3. Ứng dụng kỹ thuật phân tích chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa hình
hệ gen tôm sú ................................................................................................. 23
1.4.
Phương pháp GBS và ứng dụng trong chọn giống ...................................... 30
1.5. Phương pháp PCR đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) và ứng dụng .......... 37
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 39
2.1.
Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 39
2.1.1. Mẫu tôm sú ....................................................................................................... 39
2.1.2. Hóa chất .......................................................................................................... 40
2.1.3. Thiết bị ............................................................................................................. 43
2.2.
Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 44
2.2.1. Thu mẫu tôm sú tự nhiên phục vụ nghiên cứu đa hình hệ gen ....................... 44
2.2.2. Thu mẫu tôm sú tự nhiên làm tôm giống bố mẹ, sàng lọc mầm bệnh và
chăm sóc tôm bố mẹ ......................................................................................... 45
2.2.3. Thiết lập các gia đình tôm sú tạo thế hệ Go và G1 ........................................... 46
2.2.4. Tách chiết, tinh sạch và xác định nồng độ DNA tổng số từ mô cơ tôm sú ...... 48
iv
2.2.5. Điện di kiểm tra DNA trên gel agarose........................................................... 49
2.2.6. Kỹ thuật AFLP đánh giá đa hình hệ gen ......................................................... 50
2.2.7. Phân tích kết quả AFLP trên máy xác định trình tự tự động sử dụng điện
di mao quản và phần mềm phân tích đoạn ..................................................... 54
2.2.8. Kỹ thuật GBS phân tích hệ gen tôm sú ........................................................... 55
2.2.9. Chú giải các đoạn trình tự và xác định gen liên quan ..................................... 58
2.2.10. Xác định trình tự amino acid của contig và đánh giá mức độ tương đồng
với gen mã hóa protein quan tâm ................................................................... 59
2.2.11. Phương pháp KASP ........................................................................................ 60
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................... 61
3.1.
Đa hình AFLP ở các quần đàn tôm sú Việt Nam ........................................ 61
3.1.1. Kiểm tra hoạt tính cắt DNA của cặp enzyme EcoRI và MseI ......................... 61
3.1.2. Tách DNA tổng số từ tôm sú để thực hiện kỹ thuật AFLP .............................. 62
3.1.3. Kết quả thực hiện phản ứng tiền chọn lọc........................................................ 62
3.1.4. Đa hình AFLP trong các quần đàn và giữa các quần đàn tôm sú .................... 64
3.1.5. Cây phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú Việt Nam ....................... 78
3.2.
Sản xuất tôm sú thế hệ Go, G1 ....................................................................... 79
3.2.1. Sàng lọc nguồn tôm bố mẹ đầu vào ................................................................. 79
3.2.2. Thiết lập các gia đình tôm sú thế hệ Go, G1 ...................................................... 81
3.3.
Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính trạng
tăng trưởng ở tôm sú ...................................................................................... 85
3.3.1. Giải trình tự, kết nối các đoạn trình tự và thiết lập hệ gen tham chiếu tạm
thời................................................................................................................... 85
3.3.2. Sàng lọc SNP.................................................................................................... 88
3.3.3. Chú giải gen chức năng từ dữ liệu giải trình tự tôm sú .................................... 88
3.3.4. Xác định chỉ thị SNP và tương quan giữa các contig chứa SNP với gen
MHC ................................................................................................................. 91
3.3.5. Xác định vùng tương đồng giữa contig chứa SNP so với gen mã hóa
protein MHC, xác định codon chứa SNP và vị trí tương ứng của chỉ thị
v
SNP trên gen MHC .......................................................................................... 94
3.4. Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương
pháp KASP ..................................................................................................... 97
Chương 4. BÀN LUẬN KẾT QUẢ .......................................................................... 99
4.1.
Chọn địa điểm thu mẫu để nghiên cứu đa hình di truyền ................................ 99
4.2.
Tách DNA tổng số từ tôm sú tạo vật liệu nghiên cứu ...................................100
4.3.
Kết quả phản ứng tiền chọn lọc AFLP ........................................................... 102
4.4.
Đa hình AFLP trong các quần đàn tôm sú ..................................................... 104
4.5.
Lựa chọn kỹ thuật chỉ thị AFLP để đánh giá đa hình hệ gen tôm sú ............. 107
4.6.
Quan hệ phát sinh chủng loại giữa các quần đàn tôm sú ............................... 108
4.7.
Tạo vật liệu tôm sú thế hệ Go, G1 ................................................................... 110
4.8.
Ứng dụng kỹ thuật GBS để sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên
quan đến tính trạng tăng trưởng ở tôm sú ...................................................... 112
4.9.
Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng phương pháp
KASP và tiềm năng ứng dụng trong chọn giống ........................................... 121
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................125
CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .................................126
TÓM TẮT LUẬN ÁN BẰNG TIẾNG ANH ........................................................ 127
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................134
PHỤ LỤC
vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
AFLP
bp
Tiếng Anh
Amplified Fragment Length
Đa hình độ dài các đoạn
Polymorphism
khuếch đại
Base pair
Cặp base
Chỉ thị phân tử
CTPT
DNA
Deoxyribonucleic Acid
EDTA
Ethylene-Diamine-TetraAcetic Acid
Đồng tác giả
et al.
GBS
Gb
Tiếng Việt
Genotyping By Sequencing
Xác định kiểu gen bằng
phương pháp giải trình tự
GigaByte
Phản ứng chuỗi trùng hợp
KASP
Kompetitive Allele Specific PCR
LMM
Light meromyosin
MAS
Marker-assisted selection
MHC
Myosin Heavy Chain
Myosin chuỗi nặng
mtDNA
Mitochondrial DNA
DNA ty thể
NGS
Next Generation Sequencing
Giải trình tự thế hệ thứ mới
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng chuỗi trùng hợp
PCI
Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol
CI
Chloroform : Isoamyl alcohol
đặc hiệu alen cạnh tranh
Meromyosin chuỗi nhẹ
Chọn giống dựa trên
chỉ thị phân tử
QTL
Quantitative Trait Loci
Locus tính trạng định lượng
QC
Quality control
Kiểm soát chất lượng
Restriction Fragment Length
Đa hình độ dài đoạn cắt hạn
Polymorphism
chế
RFLP
RAPD
Random Amplify Polymorphism DNA
DNA đa hình được nhân
bản ngẫu nhiên
vii
RNase
Ribonuclease
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
TE
Tris-EDTA
IHHNV
Infectious Hypodermal and
Haematopoietic Necrosis Virus
Đa hình nucleotide đơn
Virus gây bệnh hoại tử cơ
quan tạo máu và cơ quan
tạo biểu mô
Virus gây Hội chứng
LSNV
Laem Singh Virus
YHV
Yellow Head Virus
Virus gây bệnh đầu vàng
White Spot Syndrome Virus
Virus gây bệnh đốm trắng
WSSV
VIE
Visible Implant Elastomer
ĐBSCL
chậm lớn
Chất màu phát xạ
huỳnh quang
Đồng bằng sông Cửu Long
BTB
Bắc Trung Bộ
NTB
Nam Trung Bộ
Nam Bộ
NB
Nuôi trồng thủy sản
NTTS
Dòng tôm sú Ấn Độ Dương
Dòng A
Dòng tôm sú
Dòng T
Thái Bình Dương
Dòng N
Dòng tôm sú Nội địa
Dòng G
Dòng tôm sú Gia hóa
Go
Tôm sú thế hệ Go
G1
Tôm sú thế hệ G1
F
Fast
Tôm sú lớn nhanh
L
Low
Tôm sú lớn chậm
NCBI
National Center for Biotechnology
Information
Trung tâm Thông tin Công
nghệ sinh học Quốc gia
(Hoa Kỳ)
viii
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1.
Số lượng cá thể thu thập được của bốn dòng tôm sú sử dụng
làm vật liệu gốc (tôm bố mẹ) ...................................................... 40
Bảng 2.2.
Các nhóm tôm sú sử dụng cho nghiên cứu sàng lọc SNP ........... 40
Bảng 2.3.
Thành phần các mồi sử dụng trong kỹ thuật AFLP .................... 42
Bảng 2.4.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ……………………….... 44
Bảng 2.5.
Sơ đồ lai tổ hợp toàn phần bốn dòng tôm khác nhau .................. 48
Bảng 2.6.
Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại tiền chọn lọc .............. 52
Bảng 2.7.
Chu trình nhiệt của phản ứng khuếch đại chọn lọc ..................... 53
Bảng 2.8.
Danh sách 22 loại protein liên quan đến tính trạng tăng trưởng
ở họ giáp xác ............................................................................... 59
Bảng 2.9.
Chu trình nhiệt của phản ứng KASP ........................................... 60
Bảng 3.1.
Nồng độ DNA trung bình của các mẫu tôm sú sử dụng trong kỹ
thuật AFLP ........................................................................................... 62
Bảng 3.2.
Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển BTB ...... 65
Bảng 3.3.
Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NTB ...... 69
Bảng 3.4.
Số lượng và vị trí alen của các mẫu tôm sú vùng biển NB ......... 72
Bảng 3.5.
Kết quả xác định số lượng alen trên các quần đàn tôm sú .......... 76
Bảng 3.6.
Kết quả sàng lọc tôm sú bố mẹ đầu vào ...................................... 80
Bảng 3.7.
Số lượng gia đình tôm sú thế hệ Go thả nuôi thành công từ 16
phép lai ........................................................................................ 81
Bảng 3.8.
Tỷ lệ góp vật liệu di truyền theo dòng ở thế hệ Go ..................... 83
Bảng 3.9.
Số lượng các nhóm gia đình tôm sú thế hệ G1...........................
Bảng 3.10.
Tóm tắt kết quả xử lý dữ liệu giải trình tự GBS ......................... 87
Bảng 3.11.
Kết quả chú giải các gen liên quan tính trạng tăng trưởng ở tôm
84
sú ................................................................................................. 90
Bảng 3.12.
Kết quả xác định SNP trên contig83953 và contig260347 ......... 91
ix
Bảng 3.13.
Trình tự amino acid tương ứng của contig83953 và
contig260347 ............................................................................... 92
Bảng 3.14.
Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig83953 với protein
MHC ............................................................................................ 93
Bảng 3.15.
Các tỷ lệ tương đồng cao nhất giữa contig260347 với protein
MHC ............................................................................................ 93
x
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1
Tôm sú Penaeus monodon ..........................................................
5
Hình 1.2
Vòng đời của tôm sú ...................................................................
8
Hình 1.3
Cơ sở phân tử của kỹ thuật RAPD .............................................. 15
Hình 1.4
Các bước thực hiện kỹ thuật RFLP.............................................. 16
Hình 1.5
Minh họa đa hình microsatellite .................................................. 17
Hình 1.6
Minh họa SNP trong một đoạn DNA sợi kép ở ba cá thể giả
định .............................................................................................. 19
Hình 1.7
Các bước chính trong kỹ thuật AFLP ......................................... 21
Hình 1.8
Các bước cơ bản của kỹ thuật GBS ............................................ 36
Hình 2.1
Mẫu tôm sú ................................................................................. 45
Hình 2.2
Trình tự các adaptor sử dụng trong xây dựng thư viện GBS ..... 55
Hình 2.3
Các bước xây dựng thư viện GBS .............................................. 57
Hình 3.1
Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng cắt DNA bằng cặp
enzyme EcoRI và MseI trên gel agarose 1,5% để kiểm tra hoạt
tính của enzyme………………………………………………... 61
Hình 3.2
Điện di sản phẩm của phản ứng tiền chọn lọc ............................ 63
Hình 3.3
Cây phát sinh chủng loại các quần đàn tôm sú thu từ 3 vùng
biển Việt Nam ............................................................................. 79
Hình 3.4
Kết quả điện di tự động bằng máy 2100 Bioanalyzer đánh giá
thư viện DNA.............................................................................. 85
Hình 3.5
Phân bố độ dài các contig sau tinh sạch ..................................... 87
Hình 3.6
Số lượng SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và nhóm tôm 88
sú tăng trưởng chậm....................................................................
Hình 3.7
Kết quả chú giải gen chức năng ................................................. 89
Hình 3.8
Vùng tương đồng nucleotide giữa mạch bổ sung của
contig83953 của tôm sú P. monodon so với trình tự gen MHCa
xi
ở tôm he Nhật Bản P. japonicas ................................................. 95
Hình 3.9
Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig83953 của
tôm sú P. monodon với protein MHCa ở tôm he Nhật Bản P.
japonicas ..................................................................................... 95
Hình 3.10
Vùng tương đồng nucleotide giữa contig260347 so với trình tự
gen MHC1 ở tôm sú P. monodon ................................................ 96
Hình 3.11
Vùng tương đồng trình tự amino acid giữa contig260347 với
protein MHC1 ở tôm sú P. monodon ........................................... 96
Hình 3.12
Kết quả phân tích tín hiệu huỳnh quang trong kỹ thuật KASP
đánh giá tương quan giữa SNP G>A thuộc gen MHC1 với tính
trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú ........................................
98
xii
1
MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Tôm sú Penaeus monodon Fabricius (1798) là một trong những loài tôm có
kích thước lớn và được coi là loài thủy sản nuôi kinh tế quan trọng ở nhiều nước
trên thế giới. Ở Việt Nam, tôm sú đã và sẽ tiếp tục là một trong những đối tượng
nuôi chủ lực cho xuất khẩu thủy sản đem về ngoại tệ cho đất nước. Diện tích và sản
lượng tôm nước lợ của nước ta ngày càng tăng. Nhu cầu tôm giống hằng năm là 130
tỷ con (trong đó có 30 tỷ con giống tôm sú). Năm 2016, diện tích nuôi tôm là
649.645 ha với sản lượng 657.282 tấn, giá trị xuất khẩu đạt trên 3,15 tỷ USD. Đến
năm 2025, mục tiêu xuất khẩu tôm của Việt Nam đạt 10 tỷ USD; sản lượng 1,1 triệu
tấn trên quy mô 750.000 ha; nhu cầu tôm bố mẹ khoảng 500.000 - 600.000 con,
trong đó nhu cầu tôm sú bố mẹ là 100.000 con/năm (https://laodong.vn).
Chiến lược phát triển ngành nuôi tôm sú ở Việt Nam cũng như ở các quốc gia
nuôi tôm trên thế giới là có được ngành sản xuất tôm sú bền vững, hạn chế tối thiểu
các tác động tiêu cực đến môi trường, sinh thái. Nền tảng cho chiến lược này là chú
trọng phát triển nguồn tôm bản địa với các chương trình nhân giống khoa học để
nâng cao tỷ lệ sống và sự tăng trưởng. Để đạt được mục tiêu này, nghiên cứu cấu
trúc và chức năng của toàn bộ hệ gen tôm sú là vấn đề khoa học cơ bản có định
hướng ứng dụng hết sức quan trọng. Những nghiên cứu chi tiết về genome,
transcriptome, proteome và bản đồ gen tôm sú sẽ cung cấp những thông tin sinh học
quan trọng giúp cho việc xác định các tính trạng cần thiết như tính kháng bệnh, tính
chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, tính trạng quyết định năng suất và
chất lượng của tôm. Các chỉ thị phân tử (CTPT) cũng như các thông tin khác có
được từ việc nghiên cứu về hệ gen và lập bản đồ gen tôm sú có vai trò rất quan
trọng đối với công tác chọn giống và phát triển ngành công nghiệp nuôi tôm thương
phẩm. Trong lĩnh vực nghiên cứu hệ gen tôm sú để phục vụ cho các mục tiêu nói
trên, nghiên cứu đa dạng di truyền là một trong những hướng nghiên cứu được quan
tâm và có ý nghĩa ứng dụng thiết thực đối với thành công của chiến lược quản lý lâu
dài và bền vững nguồn lợi thủy sản.
2
Ngày nay, các CTPT đang ngày càng trở thành công cụ hữu hiệu được ứng
dụng rộng rãi để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, ứng dụng
trong nghiên cứu cải tạo, chọn giống tôm chất lượng tốt, sạch bệnh. Trong số đó,
chỉ thị đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại chọn lọc (AFLP) được xem là
một trong những kỹ thuật hiện đại và hiệu quả cho phép đưa ra nhanh chóng và
chính xác một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể với nhau.
Nhiều kỹ thuật CTPT khác cũng được xây dựng để phát triển các chỉ thị DNA sử
dụng rộng rãi cho nhiều mục đích nghiên cứu. Tùy thuộc vào mục đích cụ thể để lựa
chọn loại CTPT phù hợp. Đối với mục tiêu chọn giống, đa hình nucleotide đơn
(SNP) được xem là một trong những loại CTPT hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay
để chọn được các tính trạng quan trọng liên quan đến năng suất và chất lượng
giống. Với những thế mạnh vượt trội, các CTPT ngày nay được sử dụng như những
công cụ chọn lọc đắc lực đối với các tính trạng quan tâm trong các chương trình
chọn giống ở nhiều loài vật nuôi, cây trồng và các loài thủy sản. Việc ứng dụng các
CTPT giúp cho các nhà chọn giống nhận diện chính xác các gen quan tâm nhằm rút
ngắn thời gian chọn giống. Hiệu quả cải tiến giống sẽ gia tăng gấp nhiều lần so với
các phương pháp chọn giống cổ điển nhờ thực hiện việc chọn lọc không cần trực
tiếp trên tính trạng mong muốn mà thông qua CTPT liên kết với tính trạng đó.
Hiện nay, các nghiên cứu về di truyền phân tử trên đối tượng tôm sú vẫn còn ít
và chưa tương xứng với vai trò của một đối tượng nuôi kinh tế quan trọng. Thông
tin về các locus tính trạng định lượng (QTLs) liên quan đến tính trạng tăng trưởng
hầu như rất hiếm. Vì vậy, việc nghiên cứu xác định mối tương quan giữa các SNP loại biến dị phổ biến nhất trong hệ gen - với tính trạng tăng trưởng ở tôm sú để tạo
cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu về chọn giống dựa trên CTPT là hướng nghiên
cứu hết sức quan trọng và thiết thực đối với ngành công nghiệp nuôi tôm sú.
Trong khuôn khổ của Đề tài “Lập bản đồ bộ gen tôm sú (Penaeus monodon)”
thuộc Nhiệm vụ đánh giá di truyền nguồn gen cấp Nhà nước, chúng tôi đã thực hiện
đề tài “Nghiên cứu đa hình hệ gen các dòng tôm sú (Penaeus monodon) Việt
Nam nhằm phục vụ công tác chọn giống tôm”.
3
Mục tiêu nghiên cứu
Đánh giá đa hình hệ gen các quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển Việt Nam;
Sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) có tiềm năng liên kết với tính trạng tăng
trưởng bằng cách áp dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới (phương pháp
GBS) trên hai nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm.
Nội dung nghiên cứu
(1) Đánh giá đa hình hệ gen ba quần đàn tôm sú thu từ các vùng biển khác
nhau của Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP;
(2) Lai hỗn hợp 4 dòng tôm sú bố mẹ khác nhau về nguồn gốc địa lý để tạo vật
liệu nghiên cứu thế hệ Go và G1;
(3) Áp dụng kỹ thuật xác định kiểu gen bằng phương pháp giải trình tự (GBS)
để phân tích hệ gen tôm sú thuộc hai nhóm tăng trưởng nhanh và tăng trưởng chậm
thế hệ Go và G1 nhằm sàng lọc các đa hình nucleotide đơn (SNP) liên quan đến tính
trạng tăng trưởng;
(4) Sàng lọc chỉ thị SNP G>A ở tôm sú tăng trưởng nhanh bằng kỹ thuật PCR
đặc hiệu alen cạnh tranh (KASP) để đánh giá tiềm năng ứng dụng của SNP này đối
với việc đánh giá nhanh chóng và chính xác các cá thể tôm nhằm hỗ trợ trong công
tác chọn giống tôm sú.
Những đóng góp mới của luận án về mặt khoa học và thực tiễn
(1) Luận án là nghiên cứu đầu tiên đưa ra đánh giá về đa dạng di truyền của ba
quần đàn tôm sú tự nhiên từ các vùng biển Việt Nam bằng kỹ thuật AFLP.
(2) Sàng lọc được bộ chỉ thị SNP ở nhóm tôm sú tăng trưởng nhanh làm cơ sở
cho việc tìm kiếm chỉ thị SNP liên kết với tính trạng tăng trưởng nhanh ở tôm sú.
Hai chỉ thị SNP được xác định trong nghiên cứu của luận án là phát hiện đầu tiên về
chỉ thị SNP nằm trong exon của gen MHC ở họ giáp xác. Những kết quả này cung
cấp dẫn liệu khoa học hữu ích cho việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống
tôm sú.
4
Tóm tắt sơ đồ nghiên cứu
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
Đánh giá đa hình
hệ gen các quần
đàn tôm sú bằng
kỹ thuật AFLP.
1. Thu mẫu tôm sú từ 3
quần đàn BTB, NTB, NB
1. DNA tổng số từ các
mẫu tôm sú
2. Kỹ thuật AFLP đánh giá
đa hình hệ gen.
2. Đa hình AFLP trong các
quần đàn và giữa các
quần đàn tôm sú.
Tạo
vật
liệu
nghiên cứu: tôm
sú thế hệ Go và
G1
Sàng lọc SNPs
liên quan đến
tính trạng tăng
trưởng ở tôm sú
bằng kỹ thuật
GBS.
Kỹ thuật
dựa trên
SNP kiểm
G1 tăng
nhanh.
KASP
chỉ thị
tra tôm
trưởng
1. Thu mẫu 4 dòng tôm
sú: A, T, G, N
2. Thiết lập các gia đình
tạo thế hệ Go, G1
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3. Cây phát sinh chủng
loại.
1. Tôm sú bố mẹ sạch
bệnh.
2. Tôm sú thế hệ Go, G1
.
1. Tách chiết DNA tôm sú
Go, G1.
2. Giải trình tự bằng GBS
3. Sàng lọc SNPs
4. Chú giải gen chức
năng
5. Xác định tương quan
giữa các contig chứa
SNP so với gen MHC
6. Xác định: vùng tương
đồng giữa contig chứa
SNP so với gen mã hóa
protein MHC, codon chứa
SNP, vị trí tương ứng của
chỉ thị SNP trên gen MHC
1. Thiết kế mồi đặc hiệu
dựa trên trình tự chứa
SNP G>A của gen MHC.
2. Kiểm tra trên 40 cá thể
tôm sú tăng trưởng nhanh
thuộc thế hệ G1.
1. Bộ dữ liệu SNP của 2
nhóm tôm sú tăng trưởng
nhanh và tăng trưởng chậm.
2. Hai chỉ thị SNP nằm trong
vùng exon của gen MHC:
SNP
Contig83953:g.20T>C trên
gen MHCa biến đổi codon
AAAAAG, không làm
thay đổi acid amin Lysine;
SNP
Contig260347:g.19G>A
trên gen MHC1 biến đổi
codon GGA (mã hóa acid
amin Glycine) GAA (mã
hóa acid amin Glutamic).
28 mẫu đồng hợp tử A:A;
2 mẫu đồng hợp tử G:G;
10 mẫu dị hợp tử G:A.
5
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TÔM SÚ Penaeus monodon
1.1.1. Đặc điểm sinh học, phân loại và phân bố địa lý
Tôm sú có tên khoa học là Penaeus monodon do Fabricius mô tả và đặt tên
năm 1798. Tôm sú là một trong số các loài tôm nuôi quan trọng và được phân loại
như sau (Brusca et al., 1990):
Giới: Animalia
Ngành: Arthropoda
Ngành phụ: Crustatacea
Lớp: Malacostraca
Bộ: Decapoda
Bộ phụ: Natantia
Siêu họ: Penaeoidea
Họ: Penaeidae
Giống: Penaeus
Loài: monodon
Hình 1.1. Tôm sú Penaeus monodon
(Nguồn: Nguyễn Hữu Ninh, 2012)
Cơ thể tôm sú có màu xanh đậm, có những vân sắc tố trắng đen ở các đốt
bụng. Phần còn lại của thân biến đổi từ màu nâu sang màu xanh hoặc đỏ (Hình 1.1).
6
Trong các loài tôm nuôi, tôm sú là loài có kích thước lớn (có thể dài đến 270 mm,
nặng 260g hoặc lớn hơn) và là loài tôm thương mại quan trọng (Motoh, 1985).
Tôm có các bộ phận: chủy (cứng, có răng cưa, phía trên chủy có 7-8 răng,
dưới chủy có 3 răng); mũi khứu giác và râu (cơ quan nhận biết và giữ thăng bằng
cho tôm); 3 cặp chân hàm (lấy thức ăn và bơi lội); 5 cặp chân ngực (lấy thức ăn và
bò); cặp chân bụng (rf); đuôi (nhảy xa, điều chỉnh bơi lên cao, xuống thấp); bộ
phận sinh dục (Motoh, 1985).
Tôm sú là loài giáp xác có vỏ kitin bao bọc bên ngoài cơ thể nên sự phát triển
của chúng mang tính gián đoạn và đặc trưng bởi sự gia tăng về kích thước và khối
lượng. Sau mỗi lần lột xác, cơ thể tôm sú tăng nhanh về kích thước. Quá trình này
phụ thuộc vào môi trường nước, điều kiện dinh dưỡng và giai đoạn phát triển của cá
thể. Tôm sú thuộc loại dị hình phái tính, con cái có kích thước lớn hơn con đực ở
cùng độ tuổi. Khi tôm trưởng thành phân biệt rõ đực cái thông qua cơ quan sinh dục
phụ bên ngoài. Cơ quan sinh dục chính của con đực nằm ở phía trong phần đầu
ngực, bên ngoài có cơ quan giao phối phụ nằm ở nhánh ngoài đôi chân ngực thứ 2,
lỗ sinh dục đực mở ra hốc háng đôi chân ngực thứ 5. Tinh trùng thuộc dạng chứa
trong túi. Con cái có buồng trứng nằm dọc theo mặt lưng phía trên, hai ống dẫn
trứng mở ra ở khớp háng đôi chân ngực thứ 3. Bộ phận chứa túi tinh gồm 2 tấm
phồng lên ở đôi chân ngực thứ 4 và thứ 5 dưới bụng tôm. Tuổi thành thục sinh dục
của tôm đực và tôm cái trong tự nhiên là từ tháng thứ tám trở đi (Nguyễn Văn
Thường và Trương Quốc Phú, 2009).
Vùng phân bố: Tôm sú thuộc loài rộng muối nên chúng có mặt rộng từ Ấn Ðộ
Dương sang hướng Nhật Bản, Ðài Loan, phía Ðông Tahiti, phía Tây Châu Phi và
phía Nam Châu Úc. Ở nước ta, tôm sú xuất hiện dọc theo bờ biển Ðông và vùng
đảo Phú Quốc. Nhìn chung, loài này phân bố từ kinh độ 30oE đến 155oE và từ vĩ độ
35oN đến 35oS xung quanh các vùng xích đạo như: Philipines, Malaysia, Indonesia
và Việt Nam. Tôm bột (Postlarve), tôm giống (Juvenile) và tôm gần trưởng thành có
tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng thành di
chuyển xa bờ (Motoh, 1985).
7
Vòng đời của tôm sú: Tôm sú từ 8 - 10 tháng tuổi đã có thể tham gia sinh sản.
Chúng đẻ quanh năm nhưng chủ yếu tập trung ở 2 thời kỳ chính là tháng 3 - 4 và
tháng 7 - 10 hàng năm. Tôm cái đẻ trứng nhiều hay ít là phụ thuộc vào chất lượng
của buồng trứng và trọng lượng của cơ thể (Phạm Văn Tình, 2004). Vòng đời của
tôm sú được chia ra làm các giai đoạn: phôi, ấu trùng, hậu ấu trùng, tôm giống, tôm
tiền trưởng thành và trưởng thành (Hình 1.2).
- Giai đoạn phôi: giai đoạn này bắt đầu từ khi trứng thụ tinh và phân cắt thành
2, 4, 8, 16, 32, 64 tế bào, phôi dâu, phôi nang, phôi vị đến khi nở. Thời gian hoàn tất
giai đoạn này khoảng 12 đến 15 giờ tùy thuộc điều kiện nhiệt độ nước.
- Nauplius: chia làm 6 giai đoạn phụ (N1- N6) kéo dài 2 đến 3 ngày, dinh
dưỡng bằng noãn hoàng.
- Zoae: chia làm 3 giai đoạn phụ (Z1-Z3) kéo dài 4 - 5 ngày, dinh dưỡng chủ
yếu bằng tảo khuê.
- Mysis: chia làm 3 giai đoạn phụ (M1-M3) kéo dài 3 - 4 ngày, tôm ăn chủ yếu
là phiêu sinh động vật như ấu trùng Artemia, Branchionus plicatilis...
Hầu hết giai đoạn ấu trùng mất khoảng 9 - 10 ngày, sau đó biến thái sang giai
đoạn hậu ấu trùng (Postlarvae). Giai đoạn này tôm bám thành bể, sống đáy, có hình
dạng giống như tôm trưởng thành. Ngoài động vật phù du tôm ăn cả mùn bã hữu cơ,
sinh vật đáy, 5 - 6 tuần sau trở thành tôm giống. Tôm giống 6 - 8 tháng sau đạt tiêu
chuẩn tôm trưởng thành và có thể tham gia sinh sản (Nguyễn Thanh Phương et al.,
1999). Tôm đẻ trứng vào ban đêm từ 22 giờ đến 3 giờ sáng ngày hôm sau. Trong tự
nhiên tôm thường đẻ một lần trong mỗi chu kỳ lột xác, trong điều kiện nuôi vỗ tôm
có thể đẻ nhiều lần (có thể đến 6 lần) (Thạch Thanh et al., 2005). Trong nghề nuôi
tôm, mùa vụ nuôi và thời gian thu hoạch tôm sú thương phẩm trong năm tùy thuộc
vào điều kiện khí hậu thời tiết của từng vùng (Bộ Thủy sản, 2000).
Trong chu kỳ sống, tôm sú có khả năng thích ứng với độ mặn từ 2‰ - 40‰
tùy thuộc vào giai đoạn phát triển. Giai đoạn ấu trùng và thời kỳ đầu của tôm giống,
chúng thích nghi độ mặn từ 28 - 32‰. Lớn lên, tôm sú thích ứng với độ mặn giảm
dần từ 10 - 15‰, đến cỡ tôm 50 - 70 gam, chúng có thể sống và sinh trưởng nhanh
- Xem thêm -