BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
-----♦♦♦-----
VŨ ĐỨC NAM
XÁC ĐỊNH BỆNH NHÂN TÁI NHIỄM
VÀ TÁI PHÁT HELICOBACTER PYLORI
SAU QUÁ TRÌNH ĐIỀU TRỊ
Chuyên ngành : Vi sinh
Mã số
: 60 42 01 03
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Giáo viên hƣớng dẫn:
PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh
HÀ NỘI-2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc tới PGS. TS. Nguyễn Thị Hồng Hạnh, nghiên cứu viên phòng Công nghệ
Gen động vật- Viện Công nghệ Sinh học. Người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ
bảo, dìu dắt tôi trong suốt quá trình học tập và làm việc tại phòng.
Tôi xin chân thành cảm ơn các cô chú, anh chị em phòng Công nghệ
Gen Động vật, các anh chị bệnh Viện E đã tận tình chỉ bảo, động viên và cho
tôi những lời khuyên qúi giá trong công việc cũng như trong cuộc sống.
Tiếp đến tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô của
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, trường Đại
học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời
gian tham gia khóa học. Tôi xin cảm ơn cơ sở đào tạo sau đại học Viện Sinh
Thái và Tài nguyên sinh vật đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình
học tập.
Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới người thân, gia đình, bạn
bè và đồng nghiệp đã hết lòng ủng hộ và động viên tôi trong suốt thời gian
học tập và làm việc.
Hà Nội ngày 31 tháng 12 năm 2014
Học viên cao học
KS. Vũ Đức Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. Một số vấn đề về H. pylori ....................................................................... 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện ..................................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học ................................................................................... 3
1.1.3. Dịch tễ học và phương thức lây truyền ................................................... 5
1.1.4. Các phương pháp chẩn đoán H. pylori.................................................... 5
1.1.4.1. Các phương pháp không can thiệp ....................................................... 5
1.1.4.2. Các phương pháp can thiệp .................................................................. 9
1.2. Vấn đề điều trị trừ H. pylori .................................................................. 12
1.2.1. Các thuốc sử dụng để điều trị tiệt trừ H. pylori .................................... 12
1.2.2. Phác đồ kết hợp ba thuốc EAC trong điều trị H. pylori ........................ 13
1.3. Nguyên nhân thất bại điều trị ............................................................... 14
1.3.1. Đề kháng kháng sinh ............................................................................. 14
1.3.2. Tuân thủ điều trị .................................................................................... 16
1.4. Vấn đề chẩn đoán H. pylori kháng thuốc ............................................. 16
1.5. Một số vấn đề về loét dạ dày ................................................................. 17
1.5.1. Khái niệm .............................................................................................. 17
1.5.2. Nguyên nhân, cơ chế bệnh sinh ............................................................ 17
1.5.3. Giải phẫu bệnh lý của loét dạ dày ......................................................... 18
1.5.4. Triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm của bệnh loét dạ dày .................. 19
1.5.4.1. Triệu chứng lâm sàng ......................................................................... 19
1.5.4.2. Triệu chứng cận lâm sàng [18], [19] .................................................. 19
1.5.5. Tiến triển và biến chứng ....................................................................... 20
1.5.6. Điều trị................................................................................................... 20
1.5.6.1. Điều trị nội khoa................................................................................. 20
1.5.6.2. Điều trị ngoại khoa ............................................................................. 22
1.6. Tình hình nghiên cứu H. pylori ở Việt Nam và trên thế giới ............. 23
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG II: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....... 25
2.1. Sơ đồ nghiên cứu .................................................................................... 25
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................. 25
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 26
2.3.1. Hóa chất, thiết bị máy móc ................................................................... 26
2.3.2. Địa điểm thực hiện nghiên cứu ............................................................. 27
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................... 27
2.4.1. Khám lâm sàng ...................................................................................... 27
2.4.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm ...................................................................... 28
2.4.3. Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh .................................................. 28
2.4.3.1 Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của H. pylori ........................ 28
2.4.3.2 Đánh giá độ nhạy cảm với kháng sinh ................................................ 29
2.4.4. Nuôi cấy chủng vi khuẩn ..................................................................... 29
2.4.5. Tách chiết DNA từ sinh thiết bệnh nhân............................................... 30
2.4.6. Định lượng DNA bằng quang phổ kế ................................................... 30
2.4.7. Phương pháp điện di trên gel Agarose .................................................. 31
2.4.8 Phương Pháp PCR ................................................................................. 32
2.4.9. Phân tích trình tự đoạn gen 23S rARN ................................................. 33
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................. 34
3.1. Đặc điểm chung của các bệnh nhân ..................................................... 34
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới ....................................................................... 34
3.1.2. Hình ảnh chụp nội soi dạ dày của các bệnh nhân ................................. 34
3.2. Tách chiết DNA sinh thiết ..................................................................... 35
3.3. Khuếch đại đoạn gen 23S rARN của H. pylori bằng PCR ............... 36
3.4. Xác định tái phát và tái nhiễm H. pylori ở các bệnh nhân ................. 38
3.5. Xác định tình trạng nhiễm H.pylori của các bệnh nhân trƣớc và
sau điều trị kháng sinh .................................................................................. 39
3.5.1. Đặt kháng sinh đồ.................................................................................. 39
3.5.1.1 Kháng sinh đồ sử dụng thanh E-test trên đĩa thạch nuôi vi khuẩn .... 39
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
3.5.1.2. Xác định khả năng kháng Amoxicilin và Clarithromycin .................. 39
3.5.1.3 Xác định tái phát và tái nhiễm của các chủng H.pylori sau điều trị
kháng sinh ....................................................................................................... 40
KẾT LUẬN .................................................................................................... 45
KIẾN NGHỊ ................................................................................................... 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
(Chữ viết tắt, kí hiệu chuyên ngành)
Từ viết tắt
Tiếng Anh
Tiếng Việt
Deoxyribonucleic acid
Axit đeoxyribonucleic
Kb
Kilo base
1000 cặp bazơ
OD
Optical Density
Giá trị mật độ quang
PCR
Polymerase Chain Reaction
Phản ứng tổng hợp dây
chuyền nhờ polymerase
RNA
Ribonucleic acid
Axit ribonucleic
DNA
Phần mềm cho sinh học
phân tử
DNASTAR
TAE
Tris - Acetic acid - Ethylen
Diamin Tetra Acetic
TBE
Tris - Borate - Ethylen Diamin Tetra Acetic
TE
Tris - Ethylen Diamin Tetra
Acetic
Tm
Temperature melt
Nhiệt độ biến tính
R
Resistant
Kháng
S
Susceptible
Nhạy cảm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PHỤ LỤC BẢNG
Bảng 2.1. Hóa chất sử dụng cho thí nghiệm ................................................... 26
Bảng 2.2. Trình tự mồi 23S rARN .................................................................. 26
Bảng 2.3. Máy móc thiết bị sử dụng cho thí nghiệm ...................................... 27
Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR ................................................. 33
Bảng 3.1. Độ sạch và nồng độ DNA của một số mẫu ................................... 36
Bảng 3.2. Kết quả khuếch đại gen 23S rARN từ DNA sinh thiết bệnh của các
bệnh nhân trước nhiễm H. pylori và sau khi điều trị kháng sinh
Cla & Amo .................................................................................... 37
Bảng 3.3. Các chủng H.pylori sau điều trị kháng sinh Cla và Amox ............. 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
PHỤ LỤC HÌNH
Hình 1.1 : Hình ảnh điển hình của Helicobacter pylori. .................................. 3
Hình 2. Vị trí tác dụng của một số thuốc ........................................................ 21
Hình 2.1. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí ......................................................... 29
Hình 3.1. Ảnh chụp nội soi dạ dày xuất huyết của 17 bệnh nhân ................... 35
Hình 3.2. Ảnh điện di DNA tổng số .............................................................. 35
Hình 3.3. Ảnh điện di sản phẩm PCR ............................................................. 37
Hình 3.4. Đột biến A2143G trong các chủng H. pylori trước điều trị kháng
sinh ................................................................................................ 39
Hình 3.5: Đặt E-Test kháng sinh Clarithromycin và Amoxicilin .................... 40
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN
http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, Helicobacter pylori (H. pylori) đã được khẳng định là một
trong những tác nhân chủ yếu gây các bệnh viêm loét dạ dày, hành tá tràng và
ung thư dạ dày ở người. Theo ý kiến của một số nhà khoa học, nhiễm H. pylori ở đường tiêu hóa có thể được xem là bình thường, vì hơn một nửa nhân loại
nhiễm H. pylori. Tại các nước nghèo tỉ lệ người dân bị nhiễm trùng còn cao
hơn. Ví dụ, tại Việt Nam và Trung Quốc. con số này lên đến 75%. Về mặt
bệnh học, khoảng 80% số người bị nhiễm H. pylori không thể hiện triệu
chứng hoặc biến chứng, khoảng 10 - 15% người phát triển loét dạ dày tá tràng
và chỉ 1 - 3% bệnh nhân bị ung thư dạ dày sau nhiều năm nhiễm khuẩn Về
mặt dịch tễ học. H. pylori lây truyền chủ yếu qua đường ăn uống, nước bọt,
dịch tiêu hóa, phân… nên nguy cơ lây giữa các thành viên trong gia đình rất
cao. Vì thế, cần chú ý sử dụng nguồn nước sạch, tuân theo những nguyên tắc
vệ sinh như ăn chín, uống sôi, rửa tay sạch sẽ trước khi ăn để phòng ngừa các
bệnh do nhiễm khuẩn dạ dày.
Hiện nay, liệu pháp kháng sinh được sử dụng rộng rãi để điều trị các
bệnh tiêu hóa liên quan đến nhiễm H. pylori- loài vi sinh vật gây bệnh đa
dạng về mặt di truyền. Ở các nước đang phát triển, việc điều trị bệnh bằng
liệu pháp càng ngày càng khó khăn, phần do vi khuẩn trở nên kháng thuốc,
phần do điều kiện sống và vệ sinh cộng đồng. Hiện tượng tái nhiễm do các
chủng vi khuẩn H. pylori mới và tái phát do các chủng H. pylori tương tự
như chủng H. pylori trước khi điều trị là nguyên nhân thất bại của điều trị, Ở
các nước phát triển, sự có mặt của của H. pylori sau điều trị kháng sinh
thường gắn liền với tái phát, trong khi đó ở các nước đang pháp triển, tình
hình có thể khác hơn, phụ thuộc nhiều vào điều kiên kinh tế và xã hội. Ở Peru, nước có hoàn cảnh kinh tế và xã hội thấp, tỷ lệ tái nhiễm được xác định là
cao. Ở Việt Nam, chưa có công trình nghiên cứu nào đề cặp đến vấn đề tái
nhiễm và tái phát HP ở các bệnh nhân sau điều trị kháng sinh.Xuất phát từ
1
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
thực tế đó, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu“Xác định bệnh nhân tái
nhiễm và tái phát Helicobacter pylori sau quá trình điều trị” kháng sinh
Clarithromycin (Cla) và Amoxicillin (Amo) với mục đích tìm hiểu nguyên
nhân tái phát và tái nhiễm H.pylori ở các bệnh nhân Tính kháng thuốc Cla của
các chủng H. pylori được xác định bằng phân tích đoạn gen 23S rARN không
qua giai đoạn nuôi cấy vi khuẩn mà sử dụng DNA bệnh phẩm.
2
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
CHƢƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Một số vấn đề về H. pylori
1.1.1. Lịch sử phát hiện
Helicobacter pylori được phát hiện bởi John Robin Warren và Barry
Marshall vào năm 1982. Lúc đầu vi khuẩn này được đặt tên là Campylobacter
pylori, sau các nghiên cứu tiếp theo đến năm 1989, H. pylori trở thành tên gọi
chính thức được thế giới công nhận [1], [15].
1.1.2. Đặc điểm sinh học
H. pylori là một vi khuẩn Gram âm hình cong hoặc xoắn có lông roi và
chỉ cư trú ở biểu mô kiểu dạ dày. Vi khuẩn này có thể nuôi cấy được trên
thạch sô cô la hoặc thạch máu cừu trong môi trường vi ái khí (5-10% O2) [1],
[15]. Các lông của H. pylori ở một đầu tận cùng có dạng hình đĩa, cấu trúc
này không gặp ở bất kỳ loại Campylobacter khác. Nhờ vào các lông này mà
H. pylori có thể di chuyển nhanh chóng trong lớp chất nhầy đặc. Phần còn lại
của bề mặt H. pylori nhẵn
Hình 1.1 : Hình ảnh điển hình của Helicobacter pylori.
3
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
H. pylori có thể có dạng hình cầu với nhiều kích thước khác nhau. Các
tác giả cho đó là thể thoái hóa coccoid, một số lại cho rằng đó là thể đề
kháng thường thấy sau khi vi khuẩn được điều trị bằng một số kháng sinh.
Ở dạng hình cầu, H. pylori có thể tồn tại lâu hơn trong các môi trường không
thuận lợi.
Vi khuẩn sống được trong môi trường acid của dạ dày nhờ sự hoạt động
của men urease phân huỷ ure tạo amoniac và bicarbonate cũng nhưc một vi
môi trường kiềm bao quanh vi khuẩn trong lớp chất nhầy niêm mạc. Từ vị trí
cư trú này H. pylori gây phản ứng viêm niêm mạc, khởi đầu là tổn thương
cấp tính thâm nhiễm bạch cầu trung tính, trong một vài tuần tiếp theo phản
ứng viêm sẽ dần trở thành mạn tính với sự thâm nhiễm chiếm ưu thế của lympho bào, tế bào đơn nhân lớn, tương bào.
Nhiễm H. pylori cấp tính gây tổn thương tế bào bìa và giảm acid dịch
vị với triệu chứng buồn nôn,, tiếp sau đó là tình trạng nhiễm mạn tính không
có triệu chứng. Bài tiết acid dịch vị tiếp tục duy trì ở mức thấp kéo dài hàng
tháng cho tới khi cơ thể người bệnh loại trừ được phần lớn vi khuẩn ở vùng
thân dạ dày. Tình trạng tiến triển của nhiễm khuẩn xuất hiện khi H. pylori gây
ra tổn thương viêm mạn tính khu trú ở phần xa của dạ dày (hang vị) và tá
tràng. Giai đoạn này chức năng tế bào bìa ở vùng thân vị đã được phục hồi do
đó bài tiết acid trở về bình thường hoặc thậm chí ở mức cao nên người bệnh
rất dễ bị loét dạ dày - tá tràng. Tuy nhiên, thực tế cho thấy tất cả những bệnh
nhân nhiễm khuẩn có bằng chứng MBH của viêm loét dạ dày - tá tràng mạn
tính đều có thể hồi phục tổn thương sau khi tiệt trừ vi khuẩn. Một số bệnh
nhân viêm dạ dày mạn tính do H. pylori lan dần từ hang vị lên thân vị dẫn đến
viêm dạ dày toàn bộ. Viêm dạ dày toàn bộ, viêm teo niêm mạc và dị sản ruột
dẫn đến giảm acid dịch vị. Tình trạng này làm giảm nguy cơ loét dạ dày
nhưng nguy cơ ung thư dạ dày tăng cao.
4
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
1.1.3. Dịch tễ học và phƣơng thức lây truyền
Nhiễm khuẩn H. pylori xuất hiện phổ biến trên thế giới, nhưng tần suất
nhiễm rất khác nhau giữa các quốc gia và giữa các bộ phận dân cư trong cùng
một quốc gia. Tần suất nhiễm H. pylori liên quan chặt chẽ với điều kiện kinh
tế xã hội với tỷ lệ nhiễm cao ở các nước kém phát triển [43]. Ở Việt Nam tỷ lệ
nhiễm khoảng 65,6% trong đó nhóm tuổi trên 40 nhiễm cao hơn một cách có
ý nghĩa so với nhóm tuổi dưới 40 [56]. Vi khuẩn nhiễm vào cơ thể qua đường
miệng và lan truyền chủ yếu giữa các thành viên gia đình từ khi còn nhỏ.
Sự lan truyền vi khuẩn từ người sang người ở các nước công nghiệp
phát triển thường là do tiếp xúc với chất nôn, nước bọt hoặc phân của người
nhiễm, ngoài ra nhiễm khuẩn qua nguồn nước cũng là một con đường truyền
bệnh khác mà chủ yếu gặp ở các nước đang phát triển. Cho đến nay vẫn chưa
có bằng chứng cho việc nhiễm khuẩn từ động vật, mặc dù H. pylori đã được
tìm thấy ở một số loại linh trưởng và cả ở những động vật khác nhưng rất
hiếm. Nhiễm H. pylori ở người trưởng thành luôn luôn là tình trạng mạn tính
và sẽ không bị loại bỏ nếu không được điều trị đặc hiệu. Trái lại, quá trình đào
thải tự nhiên vi khuẩn rất thường gặp ở trẻ nhỏ và được trợ giúp thêm bởi việc
sử dụng kháng sinh trong điều trị các bệnh lý khác trong thời kỳ niên thiếu.
Ở các nước phát triển, tỷ lệ nhiễm mới H. pylori đã giảm đáng kể trong
vài thập niên gần đây. Do đó có thể thấy tần suất nhiễm H. pylori tăng theo
tuổi chủ yếu là do tác động của quần thể, phản ánh sự lây truyền tập trung vào
thời kỳ niên thiếu của các cá thể trong quần thể.
1.1.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán H. pylori
1.1.4.1. Các phƣơng pháp không can thiệp
* Nghiệm pháp thở C13 hoặc C14
Nghiệm pháp thở, cũng giống như phương pháp Urease, dựa vào đặc
tính của H. pylori tiết men urease. Có hai loại nghiệm pháp thở: C14 phóng xạ
và C13 không phóng xạ. Khi có sự hiện diện men urease của H. pylori trong dạ
dày, viên thuốc có chứa ure được đánh dấu bằng các đồng vị cácbon (C13
5
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
hoặcC14) sẽ được thủy phân giải phóng ra khí CO2 và thở ra ngoài. Khí CO2
được đánh dấu này sẽ được phát hiện trong các mẫu thở bằng dò xạ lấp lánh
(scintillation) ở máy nghiệm pháp thở C14 và bằng phổ kế khối (mass spectrometer) ở máy nghiệm pháp thở C13 [27]. Nghiệm pháp thở C13 ngày nay
được coi là phương pháp chẩn đoán H. pylori tiêu chuẩn vàng cả trước và sau
điều trị diệt trừ H. pylori [42]. Phương pháp chẩn đoán này đã được đánh giá,
được chuẩn hoá quốc tế và độ chính xác của nghiệm pháp này cao hơn các
phương pháp chẩn đoán khác. Nhiều trung tâm trên thế giới đã báo cáo
nghiệm pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trên 95% [4], [34], [52]. C13
là một dạng tự nhiên ổn định của nguyên tố cácbon, vì vậy nghiệm pháp thở
C13 không liên quan đến phóng xạ. Đây là một yếu tố quan trọng để bệnh
nhân lựa chọn và phương pháp chẩn đoán này đặc biệt thích hợp cho trẻ em
và phụ nữ đang độ tuổi sinh đẻ. Hơn thế nữa, phương pháp này an toàn,
không phải lo đến vấn đề vận chuyển, loại bỏ các mẫu bệnh phẩm có nhiễm
phóng xạ. Phương pháp lấy mẫu thở đơn giản và có thể thực hiện từ xa, sau
đó vận chuyển đến nơi có máy để phân tích.
Khác với nghiệm pháp thở C13, nghiệm pháp thở C14 không có các quy
trình chuẩn và không phải tất cả các quy trình đều được đánh giá chất lượng.
Phương pháp chẩn đoán này thay đổi theo liều và công thức của đồng vị
phóng xạ, phương pháp lấy mẫu thở, sử dụng thức ăn hoặc dung dịch có chứa
urê phóng xạ, sử dụng mẫu baseline, thời gian đo lượng
14
CO2 cao nhất và
mức chuẩn để cho là kết quả dương tính. Trên thực tế lâm sàng, cần phải đánh
giá độ chính xác của phương pháp này trước khi đưa vào sử dụng. Phương
pháp lấy mẫu thở này hơi phức tạp và nghiệm pháp thở C14 có liên quan đến
lượng nhỏ chất phóng xạ nên chống chỉ định với trẻ em và phụ nữ đang tuổi
sinh đẻ. Nếu bệnh nhân được lựa chọn thì nghiệm pháp thở C13 không phóng
xạ vẫn là phương pháp tốt hơn.
Nghiệm pháp thở, khác với các phương pháp chẩn đoán H. pylori dựa
vào sinh thiết, không bị ảnh hưởng của vấn đề sai số do lấy mẫu bởi vì đồng
6
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
vị cácbon phân bổ đều trên toàn bộ bề mặt của niêm mạc dạ dày. Ở các nước
châu Âu, do giá thành nội soi đắt (100 USD ở Úc và 500 USD ở Mỹ), nên
nghiệm pháp thở rẻ tiền hơn nhiều so với nội soi (chỉ mất 3 đến 5 USD cho
một lần thử nghiệm). Ở Việt Nam, nghiệm pháp thở chưa được áp dụng có thể
vì tiền đầu tư vào máy thở cao và giá thành của nghiệm pháp thở cũng cao
tương đương như nội soi, trong khi đó nội soi không chỉ giúp chẩn đoán H.
pylori mà còn chẩn đoán chính xác bệnh lý dạ dày tá tràng, có thể phát hiện
ung thư dạ dày, một bệnh khá phổ biến ở nước ta.
* Phƣơng pháp huyết thanh học:
- Phƣơng pháp ELISA
Các phương pháp huyết thanh học đều dựa vào các kháng thể kháng H.
pylori, phần lớn xác định bằng kỹ thuật ELISA. Vấn đề nhiễm H. pylori trên
lâm sàng chủ yếu là nhiễm mạn tính bởi nhiễm cấp tính có thể xảy ra ở thời
niên thiếu và rất ít khi gặp ở người trưởng thành. Các kháng thể IgM, IgA,
IgG được sử dụng trong các phương pháp huyết thanh học. Độ nhạy và độ đặc
hiệu của phương pháp này thay đổi tùy thuộc vào kháng nguyên được sử dụng
và mức độ có phản ứng chéo. Phát hiện kháng thể IgM chỉ được 8-10% số
người bị nhiễm, chủ yếu ở trẻ em. Độ nhạy của phương pháp ELISA dựa trên
phát hiện kháng thể IgA dao động từ 65% đến 85% []. Phương pháp ELISA
dựa trên cả hai kháng thể IgA và IgG cũng không cho độ nhạy và độ đặc hiệu
cao hơn khi dựa vào kháng thể IgG đơn độc [57]. Độ nhạy trung bình khoảng
80% [57]. Trên thị trường có nhiều bộ Kits khác nhau (khoảng trên 20 bộ) ví
dụ như Helisal, Pyloriset, FlexureHP, PlexPackHP. Các bộ Kits này cho phép
làm các xét nghiệm đơn giản từ máu toàn phần và có thể sử dụng ngay trên
bàn của bác sỹ phòng khám. Phương pháp huyết thanh học có giá thành thấp
và là phương pháp lý tưởng cho các nghiên cứu điều tra dịch tễ [4], [46]. Tuy
việc sử dụng phương pháp chẩn đoán này ở những bệnh nhân trẻ tuổi (< 45
tuổi) có hội chứng dạ dày, có thể giảm bớt gánh nặng cho nội soi, nhưng vì độ
chính xác của phương pháp này có hạn nên có thể có khó khăn khi quyết định
7
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
điều trị hay không ở từng trường hợp cụ thể. Phương pháp này cũng không có
giá trị để theo dõi kết quả tiệt trừ H. pylori vì nồng độ kháng thể giảm xuống
chậm sau điều trị (ít nhất là 6 tháng)
- Phƣơng pháp thấm miễn dịch (immunoblot):
Là phương pháp nghiên cứu đáp ứng miễn dịch chống lại những kháng
nguyên khác nhau của H. pylori. Kháng nguyên của vi khuẩn được phân tích
bằng phương pháp điện di và được chuyển đến một màng nitrocellulose, sau đó
được tiếp xúc với huyết thanh thử nghiệm mang kháng thể đặc hiệu. Căn cứ
vào những vị trí kết hợp kháng nguyên - kháng thể này có thể chẩn đoán những
trường hợp dương tính với H. pylori. Phương pháp này có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao hơn phương pháp ELISA nên có thể sử dụng khi kết quả ELISA nghi
ngờ. Tuy vậy phương pháp này phức tạp nên chưa được áp dụng rộng [15].
* Phƣơng pháp phát hiện kháng nguyên trong phân
Phương pháp miễn dịch enzym phát hiện kháng nguyên H. pylori trong
phân (EIA: Antigen Enzyme Immunoassay) được nghiên cứu và đưa vào ứng
dụng trên lâm sàng từ những năm cuối của thập kỷ 90 [38], Phương pháp này
rất thuận lợi cho các nghiên cứu dịch tễ học, nhất là ở trẻ em khi mà các
phương pháp chẩn đoán thông qua nội soi và lấy máu gặp khó khăn [51].
Phương pháp này đặc biệt có giá trị khi cần nghiên cứu H. pylori ở trẻ em mới
sinh và những năm đầu đời, khi chẩn đoán huyết thanh khó có thể phân biệt
các kháng thể là của con hay từ mẹ sang con vẫn còn tồn tại. Độ chính xác
của phương pháp này đạt trên 90% cả trước và sau điều trị [4], [38], [46],
[47],. Những số liệu gần đây nhất cho thấy HpSA (H. pylori Stool Antogen) là
phương pháp chẩn đoán H. pylori không can thiệp, chính xác, đơn giản, rẻ
tiền, có thể sử dụng tốt cả trước và sau điều trị diệt trừ H. pylori. Phương
pháp này có thể trở thành phương pháp chẩn đoán H. pylori lựa chọn trên lâm
sàng cho nhiều mục đích nghiên cứu, từ các nghiên cứu dịch tễ đến các
nghiên cứu nhi khoa, từ chiến lược sàng lọc trước nội soi đến việc theo dõi
kết quả sau điều trị diệt trừ H. pylori [51].
8
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
1.1.4.2. Các phƣơng pháp can thiệp
* Nghiệm pháp Urease test nhanh
Nguyên tắc cơ bản của urease test nhanh dựa vào đặc tính tiết men
urease của H. pylori. Men này phân hủy urê, giải phóng hai phân tử amoniac
và một phân tử carbondioxid. Mảnh sinh thiết được đặt vào lớp thạch có chứa
urê và chất chỉ thị màu ở nhiệt độ phòng. Amoniac tự do được giải phóng sẽ
làm tăng pH của môi trường và làm đổi màu của môi trường từ vàng sang đỏ
trong vòng 1 giờ đầu. Độ đặc hiệu của test này cao và độ nhạy dao động từ 80
đến 95% [4], Một số yếu tố như mật độ vi khuẩn thấp, niêm mạc loạn sản
ruột, sử dụng kháng sinh và PPIs trong thời gian gần ngày soi có thể gây ra
phản ứng âm tính giả. Nếu đọc kết quả của test này chậm hơn 24 giờ cũng có
thể có kết quả âm tính giả do một số loại khuẩn ở miệng hoặc ở ruột non cũng
có thể sản xuất ra urê. Một số test urease nhanh sản xuất theo công nghệ sẵn
có trên thị trường như CLO test ở Úc [40] hoặc Pyloritek sản xuất tại Hoa kỳ.
Pyloritek cho kết quả nhanh hơn CLO test nhưng lại có nhược điểm bảo quản
khó hơn do rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. Test urease nhanh là test rất tiện lợi
bởi nó cho kết quả chẩn đoán H. pylori nhanh ngay sau khi soi và là phương
pháp có giá thành thấp.
* Phƣơng pháp mô bệnh học
Chẩn đoán mô bệnh học mảnh sinh thiết niêm mạc dạ dày là một trong
những phương pháp chẩn đoán H. pylori thông dụng và đáng tin cậy nhất.
Mảnh sinh thiết thường được lấy ở vùng hang vị, cách ống môn vị 1 đến 2 cm
hoặc ở thân vị phía bờ cong lớn. Thường lấy ít nhất 2 mảnh sinh thiết vì H.
pylori nằm rải rác ở hang vị dạ dày. Một số tác giả lấy sinh thiết cả ở hang vị
và thân vị bởi vì đôi khi bệnh nhân sau dùng PPIs H. pylori có xu hướng
chuyển đến định cư tại thân vị mà không còn tồn tại ở hang vị nữa. H. pylori
được xác định qua cách nhuộm tiêu bản bằng Hematoxilin và Eosin [36]. Khi
chẩn đoán bằng phương pháp nhuộm chuẩn này gặp khó khăn, nhất là khi mật
độ vi khuẩn thấp, có thể sử dụng thêm phương pháp nhuộm Giemsa cải tiến,
9
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
Cresyl tím violet nhanh hoặc nhuộm Warthin Starry, cho phép nhìn thấy vi
khuẩn rõ hơn [24]. Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này khoảng 9095% đối với người nhiều kinh nghiệm [4], [24], [36], Tuy nhiên kết quả của
phương pháp chẩn đoán này có thể dao động đáng kể phụ thuộc vào kinh
nghiệm của các nhà GPBL [36]. Phương pháp mô miễn dịch dựa vào các
kháng thể đơn dòng, đa dòng hoặc phương pháp lai (hybridization) có thể
được sử dụng để phân biệt H. pylori với các loại xoắn khuẩn khác như H.
heilmannii, tuy các phương pháp này ít được sử dụng. Tính ưu việt chính của
phương pháp mô bệnh học là nó luôn có sẵn ở các bệnh viện và cùng một lúc
có thể chẩn đoán H. pylori và các tổn thương niêm mạc. Nhìn chung, phương
pháp chẩn đoán này đáng tin cậy, sẵn có ở nhiều cơ sở y tế, nhưng tương đối
đắt tiền, mất nhiều công sức và thời gian, đồng thời phụ thuộc vào người đọc
kết quả.
* Phƣơng pháp tế bào - nhuộm gram và soi kính hiển vi
Đây là phương pháp chẩn đoán nhanh, đơn giản, giá thành thấp, có thể
thực hiện ở tất cả các phòng thí nghiệm. Mảnh sinh thiết được quệt trực tiếp
lên lam kính, cố định và nhuộm gram. H. pylori được xác định là loại khuẩn
gram âm, hình gậy cong hoặc chữ S đặc trưng. Phương pháp này có độ nhạy
và độ đặc hiệu thấp hơn các phương pháp khác nên thường được sử dụng như
một phương pháp bổ trợ cho phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn.
* Phƣơng pháp nuôi cấy
H. pylori là một trong những vi khuẩn khó nuôi cấy do mọc chậm và có
đặc tính kị khí. H. pylori mọc ở điều kiện vi hiếu khí với tỷ lệ O2 là 5% và khí
CO2 là 5-10%, trên môi trường thạch máu. Nuôi cấy H. pylori kéo dài 3 đến 5
ngày, nuôi cấy tốt nhất ở nhiệt độ 370C. Tất cả các chủng H. pylori mọc ở
điều kiện nhiệt độ từ 33-400C và ở môi trường nuôi cấy có pH dao động 5,58,5 [24], [26]. Khuẩn lạc H. pylori có hình dạng hạt đầu đinh nhỏ, màu xám,
trong suốt. Phân loại H. pylori dựa vào các đặc tính hình thái và sinh hoá như
có các men urease, oxidase, catalase và glutamyl transpeptidase. Mục đích
10
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
chính của việc nuôi cấy H. pylori trên thực tế lâm sàng là để xác định độ nhạy
cảm của H. pylori đối với thuốc kháng sinh. Độ đặc hiệu của phương pháp
này rất cao 100%, tuy nhiên độ nhạy thấp hơn dao động từ 60% đến 90% phụ
thuộc vào kinh nghiệm từng nơi [36]. Phương pháp này mất nhiều công sức
nhưng là phương pháp thiết yếu để nghiên cứu loại khuẩn này và để làm
kháng sinh đồ phục vụ cho vấn đề điều trị. Chủng H. pylori có thể bảo quản ở
điều kiện 10% glycerol canh thang nuôi dưỡng (Nutrient Broth N2, Oxoid
CM 67) ở nhiệt độ -700C hoặc trong nitơ lỏng (-1960C). Với phương pháp bảo
quản này H. pylori có thể tồn tại sau 5 năm với tính ổn định và hoạt động
sống hoàn hảo.
* Phƣơng pháp khuếch đại gen (PCR)
Đây là phương pháp khuếch đại chọn lọc một đoạn gen đích thành vô
vàn bản sao để sau đó có thể phát hiện được. Đoạn gen đích này còn gọi là
cặp mồi phải đặc trưng cho vi khuẩn. Việc chọn cặp mồi là hết sức quan trọng
cho phương pháp chẩn đoán này. Một số gen đặc hiệu của H. pylori đã được
lựa chọn khuyếch đại trong các phản ứng PCR như ureA, ureC, 16S rARN
[15]. Ở Việt Nam các biến thể của gen HP1125 mang các trình tự gen khác
nhau do đột biến trên các chủng H. pylori [10]. Phương pháp chẩn đoán này
có thể thực hiện với mẫu bệnh phẩm là chủng H. pylori phân lập được hoặc
trực tiếp từ mảnh sinh thiết. Mẫu bệnh phẩm được phân tích, giải phóng ra
đoạn DNA đích. Sau đó quá trình khuếch đại gen được thực hiện nhờ cặp mồi
gồm hai đoạn DNA đơn trái chiều nhau cùng với các chất xúc tác phản ứng
tổng hợp của men Tag polymerase. Quá trình khuếch đại gen được thực hiện
bằng 30-40 chu kỳ nhiệt và qua 3 giai đoạn khác nhau: giai đoạn tách các nucleotide (denaturation), giai đoạn bắt cặp (annealing) và giai đoạn kéo dài
(elongation). Sau khi đã thu được sản phẩm khuếch đại khoảng trên 109 bản
sao từ đoạn DNA đích ban đầu, gen này sẽ được phát hiện bằng phương pháp
điện di trên thạch agarose 0,8%. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy
phương pháp này có độ nhạy cao từ 91-97% [38], [49], [50]. Kỹ thuật này
11
Luận văn thạc sỹ
Vũ Đức Nam – K16
cũng rất hữu ích trong việc phát hiện các chủng H. pylori kháng thuốc thông
qua việc xác định gen kháng thuốc [15], [37], [39]. So với phương pháp cấy
khuẩn để xác định tính nhạy cảm của kháng sinh thì PCR cho kết quả nhanh
và chính xác, dễ áp dụng trong thực hành lâm sàng hơn so với phương pháp
nuôi cấy do nó có thể xác định gen kháng thuốc trực tiếp trên mảnh sinh thiết
từ dạ dày [45], [54].
1.2. Vấn đề điều trị trừH. pylori
Gần 20 năm sau khi hình thành phác đồ chuẩn 3 thuốc dựa trên Clarithromycin để điều trị tiệt trừ H. pylori nhưng hiệu quả điều trị vẫn đang còn là
một thách thức lớn ở nhiều quốc gia trên thế giới [28], [30],.
1.2.1. Các thuốc sử dụng để điều trị tiệt trừ H. pylori
* Cở sở điều trị
H. pylori là vi khuẩn gram âm tồn tại ở môi trường có nồng độ axit cao
của dạ dày, do vậy việc lựa chọn kháng sinh thích hợp là quan trọng nhất để
tiêu diệt loại vi khuẩn này. Chỉ có một số kháng sinh nhất định có thể hoạt
động ở điều kiện pH thấp như ở dạ dày. Trong số các thuốc đạt hiệu quả diệt
H. pylori tốt phải kể đến Amoxicillin, Clarithromycin, Metronidazole, Tetracyclin (có tác dụng toàn thân) và muối Bismuth và Furazolidone (có tác dụng
tại chỗ trong lòng dạ dày). Ngoài kháng sinh ra, một số thuốc giảm tiết axit
cũng được sử dụng kết hợp với để điều trị diệt H. pylori.
* Tác động hiệp đồng của các thuốc trong các phác đồ diệt H. pylori
Trên thực tế lâm sàng, người ta thấy rằng kết hợp kháng sinh với một
thuốc ức chế tiết axit cho tỷ lệ diệt H. pylori rất cao. Một số kháng sinh không
có tác dụng diệt khuẩn ở môi trường có pH thấp, mà chỉ phát huy tác dụng ở
điều kiện pH gần bằng 5. Vì vậy muốn cho kháng sinh hoạt động tối ưu thì
phải dùng kết hợp với một thuốc giảm tiết axit mạnh như PPIs để nâng pH dạ
dày lên cao và kéo dài. Có rất nhiều nghiên cứu về tác động hiệp đồng giữa
các kháng sinh và PPIs. Omeprazole với liều 20mg/ngày trong vòng 16-18
giờ có thể tăng pH lên 3, với liều 40mg/ngày chia 2 lần cách nhau 12 giờ sẽ
12
- Xem thêm -