Tài liệu Báo cáo thí nghiệm vi sinh

Thực tập vi sinh đại cương BÀI 1:QUY TRÌNH KIỂM TRA TỔNG SỐ VI SINH VẬT HIẾU KHÍ 1.Định nghĩa: Vi sinh vật hiếu khí là vi sinh vật tăng trưởng và hình thành trong điều kiện có oxy phân tử 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí: Tổng số vi sinh vật hiếu khí hiện diện trong mẫu chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm,đánh giá chất lượng của mẫu về vi sinh vật,nguy cơ hư hỏng ,thời hạn bảo quản của sản phẩm,mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm Sự tăng trưởng vi sinh vật trong thực phẩm dẫn đến biến đổi chất lượng : 106 tế bào/g(ml) là ranh giới để phân biệt thực phẩm có dấu hiệu hư hỏng hay không.Một vài trường hợp vsv=10 6 tế bào/g(ml) chưa có dấu hiệu hư hỏng rõ ràng về mặt hóa học.Đặc biệt ở sữa khi có 105 tế bào/g(ml) sữa bị chua: 106-107tế bào/g(ml) sữa có mùi hôi;108 tế bào/g(ml) tất cả thực phẩm có mùi hôi không chấp nhận được;109-1010tế bào/g(ml) thực phẩm thay đổi cấu trúc 3.Quy trình kiểm tra: Trang 1 Thực tập vi sinh đại cương 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trùng 1ml(10-1)+ 9ml nước nước vô trùng Stomacher .10gr thực phẩm 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85% (10-1) Bước 1: đồng nhất mẫu Cho 10 g thực phẩm vào 90 ml NaCl 0.85% vô trùng(hoặc H 20 vô trùng )vào bao PE vô trùng.Tiến hành đồng nhất bằng máy stomacher 30” thu được nồng độ 10-1 Trang 2 Thực tập vi sinh đại cương Bước 2 : pha loãng mẫu Chuẩn bị các ống nghiệm và pipet vô trùng.Dùng pipet 10ml vô trùng lấy 9 ml NaCl vô trùng vào các ống nghiệm .Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml từ nồng độ 10-1 đưa vào ống nghiệm thứ nhất . Tiến hành rung lắc ống nghiệm bằng máy rung ống nghiệm votex, thu được nồng độ 10-2 .Làm tương tự với các nồng độ kế tiếp Lưu ý khi pha loãng mẫu: -Nồng độ pha loãng phụ thuộc vào tình trạng vệ sinh của thực phẩm,thời gian bảo quản, điều kiện bảo quản,kinh nghiệm người kiểm nghiệm…. -Tiến hành thao tác bên ngọn lửa đèn cồn.Các ống nghiệm,pipet phải vô trùng.Sử dụng 1 micropipet 1ml/ 1 nồng độ pha loãng mẫu để tránh hiện tượng sai số -Mỗi lần lấy mẫu phải lắc đều Bước 3: nuôi cấy dịch mẫu Nuôi cấy ít nhất ở 3 nồng độ pha loãng mẫu liên tiếp Dùng micropipet 1ml vô trùng lấy 1ml dịch mẫu cho vào đĩa,ít nhất 2 đĩa/nồng độ Chuẩn bị môi trường đã tiệt trùng,để nguội 450C,đổ môi trường vào các đĩa đã chứa 1ml dịch mẫu .Xoay nhẹ đĩa theo vòng tròn nhằm trộn đều dịch mẫu với môi trường để thu được những khuẩn lạc tách rời.Khi môi trường đông lại,lật ngược đĩa,ủ trong trong tủ ổn nhiệt Memmert Nếu muốn kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu khí,dùng môi trường P.C.A hoặc N.A Trang 3 Thực tập vi sinh đại cương Nếu muốn kiểm tra tổng số men, mốc dùng môi trương P.D.A hoặc Sabouraund Thời gian ủ vi khuẩn hiếu khí 24-48h/30-370C.Thời gian ủ men,mốc 72h/30-370C Bước 4: đếm số khuẩn lạc /đĩa/các nồng độ(25-250 khuẩn lạc/đĩa) Kết quả thí nghiệm Nồng độ Số khuẩn lạc 10-1 Đĩa 1 Đĩa 2 48 10-2 Đĩa 1 Đĩa 2 130 113 125 10-3 Đĩa 1 Đĩa 2 105 Bước 5: tính kết quả theo công thức n = c/(n1+0.1n2)*d n : tổng số tế bào / ml (g) mẫu thực phẩm(cfu/g(ml)) c : tổng số khuẩn lạc đếm được n1 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư nhất n2 : số đĩa đếm được ở nồng độ thư hai d : nồng độ pha loãng thứ nhất được đếm   120).100 =>n==2104521000 (113  125  105 (2  0,1.2) cfu/g(ml) 4.Môi trường sử dụng 4.1.Môi trường Nutrient Agar Peptone :5.0g Meat extract :3.0g Agar :12.0g Nước cất :1000ml pH sau thanh trùng : 7.00.2 Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút Trang 4 120 Thực tập vi sinh đại cương 4.2.Môi trường Plate Count agar Peptone :5.0g Meat extract :2.5g D(+) glucose :1.0g Agar :14.0g Nước cất vừa đủ :1000ml 7.00.2 pH sau thanh trùng : Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút 4.3.Môi trường Sabouraund Peptone :20g Glucose :40g Agar :20g Nước :1000ml Hấp thanh trùng ở 1210C/15 phút BÀI 2: KIỂM TRA TỔNG SỐ COLIFORM 1.Những kiến thức chung về COLIFORM Coliform là nhóm trực khuẩn gram- , không bào tử , hiếu khí hoă ăc kị khí tùy ý, có khả năng lên men đường lactose, sinh hơi ở 37oC /24 – 48h. Coliform và Feacal coliform (coliform phân) là nhóm vi sinh vâ tă dùng để chỉ thị khả năng có sự hiê ăn diê ăn của các vi sinh vâ ăt gây bê ănh trong thực phẩm. Nhóm coliform gồm những vi sinh vâ ăt hiếu khí và kị khí tùy ý, gram - , không bào tử , hình que, lên men đường lactose và sinh hơi trong môi trường lỏng, dựa vào nhiê ăt dô ă tăng trưởng, nhóm này được chia thành 2 nhóm nhỏ là coliform và coliform phân có nguồn gốc từ phân các loài đô ăng vâ ăt. Trên thực tế kiểm nghiê ăm coliform phân được quan tâm nhiều hơn coliform. Coliform phân có nguồn gốc từ ruô ăt người và các đô ăng vâ ăt máu nóng bao gồm các giống escherichia, kebsiella, enterobater. Khi coliform Trang 5 Thực tập vi sinh đại cương phân hiê ăn diê ăn ở mô ăt số lượng lớn trong mẫu thì mẫu có khả năng chứa các vi sinh vâ ăt gây bê ănh hiê ăn diê ăn trong phân. Chỉ tiêu tổng coliform không thích hợp để làm chỉ tiêu chỉ thị cho việc nhiễm bẩn nguồn nước bởi phân. Tuy nhiên việc xác định số lượng Feacal coliform có thể sai lệch do có một số vi sinh vật (không có nguồn gốc từ phân) có thể phát triển ở nhiệt độ 44 oC. Do đó số lượng E. coli được coi là một chỉ tiêu thích hợp nhất cho việc quản lý nguồn nước. Trong các thành viên nhóm coliform phân thì E.coli là loài được quan tâm nhiều về vê ă sinh an toàn thực phẩm. Loài vi sinh vâ ăt này phân bố ở mọi nơi, có trong ruô ăt người và các đô ăng vâ ăt máu nóng. *mô ôt số hình ảnh về coliform: Fecal Coliform 375 x 294 ﾧ Chromocult® Coliform Agar ES Trang 6 Thực tập vi sinh đại cương 297 x 300 2.Ý nghĩa của việc kiểm tra chỉ tiêu Coliform được xem là nhóm vi sinh vâ ăt chỉ thị. Số lượng hiê ăn diê ăn của chúng trong thực phẩm, nước được dùng để chỉ thị cho khả năng hiê ăn diê ăn của các vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác. Số lượng coliforms cao thì khả năng hiê ăn diê ăn của vi sinh vâ ăt gây bê ănh khác cao. Colifrorm chịu nhiê ăt( coliform phân):  Là thành phần trong hê ă vi sinh vâ ăt đường ruô ăt ở người và các đô ăng vâ ăt máu nóng.  Được xem là vi sinh vâ ăt chỉ thị mức đô ă vê ă sinh trong quá trình chế biến, bảo quản , vâ ăn chuyển thực phẩm, nước uống cũng như chỉ thị sự ô nhiễm phân trong môi trường.  Lên men đường lactose trong môi trường E.C ở 44.5oC.  Có khả năng sinh indol 24h/44.5oC.  Kết quả sinh hóa nghiê ăm pháp imvic là + + - - 3.Quy trình kiểm tra Phương pháp MPN : Nguyên tắc: Mẫu được pha loãng thành mô ăt dãy thâ ăp phân , 2 nồng đô ă kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng đô ă pha loãng được lă ăp lại 3 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiê ăm. Xác định ống dương tính ở mỗi nồng đô ă pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vâ ăt tương ứng hiê ăn diê ăn trong 1g hoă ăc 1ml mẫu ban đầu Trang 7 Thực tập vi sinh đại cương Sơ đồ quy trình kiểm tra : 1ml(10-1)+ 9ml nước 1ml(10-2)+ 9ml nước vô trùng nước vô trùng Stomacher 10gr thực phẩm 10-2 10-3 + 90ml NaCl 0.85%( 10-1 ) hình 1.1 Bước 1: 10gr thực phẩm + 90ml NaCl 0.85% hoă ăc là nước vô trùng, stomacher thu được nồng đô ă 10-1. mục đích đồng nhất là để phân bố đều vi sinh vâ ăt. Bước 2: Pha loãng mẫu để giảm số lượng vi sinh vâ ăt có trong mẫu ban dầu. Lấy 1ml mẫu ở nồng đô ă 10-1 cho vào ống nghiê ăm thứ nhất, sau đó cho 9ml nước vô trùng. Ta được ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-2. Sau đó lấy 1ml mẫu ở nồng 10-2 cho vào ống nghiê ăm thứ hai + 9ml nước vô trùng thu được ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-3 . tương tự như trên ta thu được các ống nghiê ăm có nồng đô ă 10-4, 10-5….. Trang 8 Thực tập vi sinh đại cương Bước 3: Nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Tryptose (LT) ở 3 nồng đô ă liên tiếp(10-1,10-2,10-3) như sau : Mỗi nồng đô ă lấy 3 ống nghiê ăm. Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ống durham, cho môi trường LT vào 9 ống nghiê ăm sao cho ngâ ăp ống durham. Ghi 3 nồng đô ă liên tiếp bên ngoài ống nghiê ăm(mỗi nồng đô ă 3 ống nghiê ăm). Tiếp đến cho 1ml dung dịch mẫu ở nồng đô ă 10-1 vào 3 ống nghiê ăm có ghi nồng đô ă 10-1(chứa môi trường LT),tương tự cho các ống nghiê ăm ở những nồng đô ă tiếp theo. (hình 1.1) ủ ở 37oC/24h Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): -Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. - Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. - Không lắc những ống có ống durham Bước 4: Đọc kết quả các ống Laury Tryptose . Có 3 trường hợp xảy ra: + ống durham không thay đổi + ống durham nổi lên trên + ống durham sinh hơi. Đọc kết quả các ống LT dương tính, sau đó cấy chuyền các ống LT dương tính này vào các ống môi trường BGBL 2% bằng cách lấy que cấy vòng nhúng vào môi trường LT dương tính ở trên,rồi cho vào ống có môi trường BGBL. Ghi nồng đô ă trên sản phẩm. Ủ 37oC /24h. Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích ống chuông). Trang 9 Thực tập vi sinh đại cương Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra Bước 5: Đọc kết quả ống BGBL dương tính. Lâ ăp tỷ lê ă các ống BGBL dương tính ở 3 nồng đô ă liên tiếp. Tra bảng Mac Crady tìm số MPN tương ứng + ống BGBL dương tính: môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc có bọt khí trong ống chuông( thể tích bọt khí =1/10 thể tích ống chuông). + ống BGBL âm tính: không có hiê ăn tượng gì xảy ra. Bước 6: Tính kết quả: Tổng số coliform (cfu/g hoă ăccfu/ml)= số MPN 10n n là số nguyên dương của nồng đô ă pha loãng đầu tiên được nuôi cấy. Bước 7: Từ kết quả tính được, so sánh với tiêu chuẩn về an toàn vê ă sinh thực phẩm. 4. Môi trường sử dụng: Môi trường BGBL 2% : là môi trường dùng để phát hiê ăn và đếm coliforms, coliforms phân, E.coli trong sữa, thực phẩm, nước. Nguyên tắc: Mâ ăt bò ( bile) và brilliant green ức chế hầu hết các vi khuẩn gram + và vi khuẩn gram – không phải coliform. Brilliant green có nồng đô ă đă ăc hiê ău nhằm ngăn vi khuẩn kị khí lên men lactose sinh trưởng ở 44 0C , Tránh được hiê ăn tượng dương giả, lúc này coliform phát triển làm đục môi trường và sinh khí trong ống durham do lên men lactose. 5.Các thiết bị ,dụng cụ sử cho thí nghiệm Bình erlen, đèn cồn, que cấy vòng, ống nghiê ăm ,nồi autoclave, tủ sấy, ống durham , micropipet, mẫu là tương ớt. Trang 10 Thực tập vi sinh đại cương 6.Kết quả thí nghiệm _ _ _ 10-1 Trang 11 Thực tập vi sinh đại cương + + _ 10-2 Trang 12 Thực tập vi sinh đại cương _ _ _ 10-3 Tỷ lê ă của BGBL dương tính ở 3 nồng đô ă (10-1:10-2:10-3) = (0,2,0) Tra bảng Mac Crady ta được số MPN =6.2N/g = 6.2 101=62 (cfu/ml)   coliform BÀI 3: KIỂM TRA TỔNG SỐ E.COLI Escherichia coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44ºC, sinh indol (phản ứng ind+), sinh acid (phản ứng MR+), không sinh aceton (phản ứng V.P-) và không sử dụng citrate làm nguồn cacbon (phản ứng cit-).Là trực khuẩn gram-, có khả năng gây bệnh tiêu chảy và sinh nội độc tố.Được coi là vi sinh vật chỉ thị cho sự nhiễm phân và chất lượng vệ sinh thực phẩm. Trang 13 Thực tập vi sinh đại cương Các chủng E.coli có khả năng gây bệnh ở người : - Các chủng truyền thống gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ em. - Các chủng yếm khí không bắt buộc gây tiêu chảy không thường xuyên có quan hệ gần gũi với hệ vi sinh vật bình thường ở đường ruột. - Các chủng sinh độc tố bền hoặc không bền với nhiệt hoặc cả hai. - Các chủng gây lây nhiễm đường ruột. 1.Mục đích thí nghiệm: Xác định E.coli trong mẫu thực phẩm. Ở đây, nhóm tiến hành kiểm tra tổng số E.coli trên mẫu tương ớt. 2. Nguyên tắc: mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân, hai nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần. Mẫu được ủ trong môi trường thích hợp có ống durham. Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3-5 ống. Theo dõi sự sinh hơi trong từng ống nghiệm. Xác định các ống dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy ra số lượng nhóm vi sinh vật tương ứng hiện diện trong 1g hoặc 1ml mẫu ban đầu. 3.Dụng cụ và hóa chất: 3.1.Thiết bị và vật liệu: - Tủ ấm - Bể điều nhiệt - Máy lắc - Cân - Pipet tiệt trùng Trang 14 Thực tập vi sinh đại cương - Các bình chứa mẫu vô khuẩn - Các lọ phục vụ cho mực đích pha loãng, có nút đậy - Mẫu thực phẩm kiểm tra - Ống durham 3.2.Môi trường và hóa chất: - Môi trường E.C broth - Môi trường Lauryl tryptose( LT) - Môi trường endo agar - Môi trường E.M.B agar (eosin methylene – blue lactose sucrose agar). - Môi trường N.A (nutrient agar) 4.Tiến hành thí nghiệm: Bước 1: Lấy mẫu Tùy loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu với số lượng và khối lượng khác nhau cho phù hợp. Khi lấy mẫu cần đảm bảo : - Mẫu phải có tính đại diện. - Lượng mẫu vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý hóa,sinh học. - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô khuẩn. - Mẫu lấy xong phải phân tích ngay không để quá 24 giờ. - Mẫu phải có nhãn ghi kí hiệu, ghi lại những đặc điểm của mẫu và nơi thu mẫu. Trang 15 Thực tập vi sinh đại cương Lấy 10g tương ớt + 90ml NaCl 0.85%, stomacher thu được nồng độ 10-1 Bước 2: Pha loãng mẫu Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu lỏng: 10ml 1ml Mẫu 1ml 90ml NaCl vô trùng 10-3 1ml 10-2 10-4 10-1 NaCl 9ml NaCl (nước vô trùng) 9ml NaCl vô trùng vô trùng Trang 16 vô trùng 9ml Thực tập vi sinh đại cương Sơ đồ tiến hành pha loãng mẫu rắn: 10ml 1ml 1ml 1ml 10g mẫu Stomacher 90ml NaCl vô trùng 10-3 10 -2 10-4 10-1 (nước vô trùng) 9ml NaCl vô trùng 9ml NaCl vô trùng 9ml NaCl vô trùng Tiến hành tương tự cho các mẫu pha loãng khác Những điều lưu ý khi pha loãng mẫu: - Khi pha loãng mẫu nên dùng nước muối vô trùng nhằm tạo môi trường dinh dưỡng cho vi sinh vật, nếu chỉ dùng nước cất vô trùng Trang 17 Thực tập vi sinh đại cương vi sinh vậy sẽ chết khi để lâu bên ngoài mà không có môi trường dinh dưỡng. - Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. Các dụng cụ phải được vô trùng. - Khuấy trộn đều dung dịch mẫu trước khi pha loãng để vi sinh vật phân tán đều trong mẫu. - Tế bào ở các độ pha loãng khác nhau cần được lấy với các pipet khác nhau nhằm tránh các tế bào ở độ pha loãng trước lẫn với các tế bào ở độ pha loãng sau. - Nồng độ pha loãng còn phụ thuộc:  Đặc điểm của thực phẩm(thời hạn sử dụng, điều kiện bảo quản, quy trình chế biến...).  Người kiểm phẩm ( kinh nghiệm, thao tác....). Bước 3 : Nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose ( LT) Tiến hành nuôi cấy dịch mẫu trong môi trường Laury Trytose ở 3 nồng độ liên tiếp, 3 ống/ nồng độ, 1ml dịch pha loãng/ ống LT. Ủ 37ºC/24h. Trang 18 Thực tập vi sinh đại cương 10-2 10-3 10-4 Môi trường Laury Trytose( LT) Rồi để yên cho thạch đông lại, đem đĩa ủ trong tủ ấm. Ủ ở 37 oC trong 24h Sau khoảng thời gian trên lấy đĩa đã ủ ra và đếm khuẩn lạc, tính kết quả. Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường Laury Trytose (LT): - Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn. - Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Laury Trytose. - Không lắc những ống có ống durham Bước 4 : Đọc kết quả các ống Laury Tryptose dương tính( +), cấy chuyền các ống LT(+) vào các ống môi trường E.C. Ủ 44ºC/24h. E.coli phát triển ở 44ºC,ở nhiệt độ này một số vi khuẩn khác đã bị hạn chế khả năng sinh trưởng .Hơn nữa môi trường E.C muối mật ức chế cá vi khuẩn Gr + và các vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột Ống LT + : môi trường đục và ống durham ( ống chuông) nổi hoă ăc có bọt khí trong ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích ống chuông). Trang 19 Thực tập vi sinh đại cương Ống LT - : không có hiê ăn tượng gì xảy ra Từ các ống E.C (+), cấy phân lập trên môi trường endo agar và E.M.B agar. Ủ 37ºC/24h Những lưu ý khi tiến hành nuôi cấy vi khuẩn lên môi trường endo agar và E.M.B agar:  Tiến hành gần ngọn lửa đèn cồn để tránh nhiểm khuẩn.  Nhớ lắc mẫu trước khi tiến hành phân lập vi khuẩn trên môi trường endo agar và E.M.B agar Sau khoảng thời gian trên lấy ra đem nhận diện khuẩn lạc điển hình: - Môi trường endo agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có ánh kim loại - Môi trường E.M.B agar: khuẩn lạc tròn, bóng, có tâm đen, có ánh kim. Bước 5 : Từ các khuẩn lạc nghi ngờ, cấy truyền sang môi trường N.A. Ủ 37ºC/24h. Buớc 6 : làm nghiệm pháp imvic với vi khuẩn đã cấy ở bước 5 I : indol M :methyl red V : V.P C : simon citrat Phản ứng sinh hóa kiểm tra sự có mặt của trực khuẩn đường ruột Gr– có khả năng sử dụng simon citrat Kết quả : + + - - : E.coli type I - + - - : E.coli type II BÀI:4 KIỂM TRA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS Trang 20