Tài liệu Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn streptomyces natalensis vtcc a 3245 nhằm tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ó C G IA H À N Ộ I ùHOanH BÁO CÁO TỎNG KẾT K É T Q U Ả T H Ụ C H IỆ N Đ Ề T À I K H & C N CÁP ĐẬI h ọ c QUÓC g i a T ên đê tài: C ả i b iê n di tru y ề n c h ủ n g x ạ k h u ấ n S tr e p to m y c e s n a ta le n sis V T C C -A -3 2 4 5 n h ăm tă n g k h ả n ă n g sin h c h ấ t k h á n g sin h n a ta m y c in để ứ n g d ụ n g tro n g b ả o q u ả n th ự c p h ẩm Mă số đề tài: QG. 14.62 C h ủ nhiệm đề tài: T S . N g u y ễ n K im N ữ T h ả o ĐAI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI ĨRUNG TẦM THÔNG TIN THƯ VIỄN .. ũ ũ ũ á ũ n a u M PHẢN I. THÔiNG TIN CHUNG 1.1. lên đê tài: Cải biến di truyền chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs VTCC-A-3245 nhằm tăng khả năng sinh chất kháng sinh natamycin để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm 1.2. Mã số: QG. 14.62 1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài TT Chức danh, học vị, họ và tên Đon vị công tác Vai trò thực hiện đề tài 1 TS. Nguyễn Kim Nữ Thảo Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Chủ nhiệm đề tài 2 TS. Nguyễn Quỳnh Uyển Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Thành viên 3 ThS. Nguyễn Thị Vân Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Thành viên 4 ThS. Phạm Thị Thu Hướng Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học Thành viên 1.4. Đo'n vị chủ trì: Viện Vi sinh vật và Công nehệ Sinh học 1.5. Thòi gian thực hiện: 1.5.1. Theo hợp đồng: 1.5.2. Gia hạn (nếu có): từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016 đến tháng......năm 1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 04 năm 2014 đến tháng 03 năm 2016 1.6. N h ữ n g th a y đ ổ i so v ó i th u y ế t m inh ban đ ầu (nếu có): (Vệ mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ kiên của Cơ quan quản lý) 1.7. Tông kinh phí đưọc phê duyệt của đề tài: 150 triệu đồng. PHÀN II. TỎNG QUAN KỂT QUẢ NGHIÊN c ử u 1. Đặi vấn đề Striptomyces, chi lớn nhất của nhóm xạ khuẩn được biết đến với khả năng tổng họp một lượng lớn cá; chât trao đôi thứ câp bao gôm các chât kháng vi sinh vật. Trong số đó, natamycin, một họp chât thuộc nhóm polyene đã và đang thu hút được nhiều sự quan tâm. Natamycin được sản xuất từ quá tình lên men một sô chủng xạ khuân như Streptomyces nơtalensis, Streptomyces chattcnoogensịs và Strepiomyces gilvosporeus [8 ]. Đặc điểm nồi bật của natamycin là chúng có khả năng tháng nâm mạnh, ức chê sinh trưởng của nâm men, nấm mốc và ngăn ngừa sự hình thành aílatoiin từ nâm sợi. So với các chât kháng nấm khác thì natamycin có độc tính rất thấp với tế bào động /ật có vú nên chúng được ứng dụng nhiêu trong y học để điều trị hiệu quả các bệnh nhiễm trùng ịiảc mạc do Aspergillus và Fusarỉum gây ra [6 ]. Thêm vào đó, natamycin còn được sử dụns rộng ríi trong công nghiệp thực phâm đê kéo dài thòi gian bảo quản của nhiều loại thực phẩm khác nhau ihư pho mát, xúc xích, hoa quả và đô uống. Natamycin là một trong số rất ít các chất kháng nâm clrợc khuyên cáo sử dụng trong thực phâm bởi cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA . ơ Việt Nam, natamycin năm trong danh mục phụ gia thực phâm được phép sử dụng trong sản Xiất, chế biến và kinh doanh thực phẩm theo thông tư số 27/2012/TT-BYT của Bộ Y Tế. IV natamycin có vai trò phổ biến như vậy nhưng hiện nay ờ Việt Nam. toàn bộ lưọng natanvcin được sử dụng đêu phải nhập khẩu. Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học hiện đang bảo quản chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 có khả năng ánh nataniycin. Chủng Streptomyces natalensis VTCC- A-3245 chính là chùng chuẩn được 1 Struyk và cộng sự phân lập từ mẫu đất ở Nam Phi [11] và đang được lưu giữ ở bảo tàng giống Nhật Bản với ký hiệu JCM 4693. Tuy nhiên để tạo được chủng sản xuất, các nghiên cứu cải biến di truyén cần được thực hiện để tăng khả năng sinh natamycin. Đối với chủng s. natalensis, chưa có một nghiên cứu nào ở Việt Nam thực hiện cải biến di truyền bằng cách tác động trực tiếp vào cụm gen sinh tông hợp natamycin. Trong khi đó, trên thế giới, trình tự cụm gen mã hóa cho quá trình sinh tông họp natamycin đã được công bô; cụm gen này có kích thước khoảng 85 kb bao gôm 13 gen mã hóa cho polyketide synthase, 12 gen mã hóa cho protein biến đổi sau dịch mã, protein vận chuyến và protein điều hòa, trong đó có pim M [1,2]. Gen pim M có kích thước 579 bp, được tìm thây như một gen mã hóa cho protein điêu hòa dương của quá trình sinh tổng hợp natamycin [ 1]. Khi xóa bỏ pimM, khả năng sinh natamycin biến mất. Vì vậy, tác động vào gen pim M chính là một chìa khóa quan trọng có khả năng cho phép tạo ra chủng sản xuất sinh natamycin với hiệu suất cao hơn. Trong nghiên cứu này, gen điều hòa dương p im M được tách dòng và chèn thêm một phiên bản vào hệ gen của chủng xạ khuẩn s. natalensis, tạo nên chủng cải biến với hai phiên bản của gen điều hòa dương pim M và hiệu suất sinh tổng họp natamycin cao hơn chủng tự nhiên. Đồng thời, điều kiện nuôi cấy và tách chiết, tinh sạch natamycin cũng được nghiên cứu. Ngoài ra, chủng s. natalensis cải biến cũng được sàng lọc trên môi trường chứa kháng sinh rifamycin và streptomycin, hai loại kháng sinh được biết đến có khá năng gây đột biến ở các gen liên quan đến quá trình phiên mã và dịch mã ở vi khuẩn nhằm mục đích chọn lọc được các chủng đột biến với hiệu suất sinh natamycin cao hơn chủng ban đầu [ 1 0 ]. 2 . Mục tiêu Mục tiêu của đề tài là cải biến dược chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis có khả năng sinh chât kháng nấm natamycin cao hơn chủng tự nhiên 2-4 lần, xây dụng được quy trình nuôi cấy tối ưu cho chủng Streptomyces natalensis đã được cải biến và quy trình tách chiết, tinh sạch và phân tích chât kháng nấm natamycin. Ngoài mục tiêu đã được đặt ra trong thuyết minh, chúng tôi còn thử nghiệm nâng cao khả năng sinh natamycin của chủng xạ khuẩn s. natalensis cải biến bàng cách chọn lọc các chủng đột biến kháng rifamycin và streptomycin. 3. Phưong pháp nghiên cứu Chủng giong Chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis JCM 4693 = VTCC-A-3245, chủng vi sinh vật kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62 được bảo quản tại Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật VTCC - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. Chùng E. coli DH5a và E. coli E T 12567 [pUZ8002] là quà tặng của giáo sư Takuya Nihira (Đại học Osaka, Nhật Bản) Tách chiết DNA tong so từ chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensỉs Chúng xạ khuân Streptomyces natalensis được nuôi trên môi trường “seed medium” (g/1: glucose- 20; malt extract- 6 ; peptone - 6 ; NaCl-0,2 g/L và pH 7.0-7.2), lắc trong 3 ngày ở 30°c. Ly tâm thu tế bào từ 3 mỉ dịch nuôi cấy. Tế bào được nghiền nát bằng que nghiền tế bào và rửa lại với 1 ml nước khử trùng. Thêm 0,2 ml đệm ly giải (100 mM Tris HC1, 100 mM Na 2EDTA, 1,5 M NaCl, 1% cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB), pH 8,0), 50 Ịil lysozyme (30 mg/ml) và 50 jil SDS 20%. Vortex trộn đều mẫu rồi ủ ở 65°c trong 2 giờ, sau 25 phút lắc mẫu một lần. Ly tâm mâu à 8000 g trong 10 phút, thu dịch trong sang ông eppendorí' mới.Thêm một thê tích C:I (Chloroíorm: Isoamylalcohol 24:1) bằng thể tích mẫu trong ống. Ly tâm 16000 g trong 5 phút. Thu dịch nôi, thêm một lưọnơ isopropanol bằng thể tích dịch trong ổng. ủ tại nhiệt độ - 2 0 ° c trong 1 giờ, 1} tâm 16000 g trong 5 phút. Bỏ dịch nổi, rửa cặn bằng 70% ethanol lạnh. Ly tâm 16000 g trong 5 phút. Bỏ dịch nổi, cô chân không cặn ở nhiệt độ phòng tới khô. Thêm 50 |il nước để hòa DNA, giữ DNA ở -20°c. Phản ừng PCR khuếch đại gen điều hòa dương pim M Gen điều hòa dương pim M được khuếch đại từ mẫu DNA tổng số bằng phản ứng PCR sử dụng cặp mồi PMD (5'-TCCTGGATCCGCCCTGTGCCCGCTCACTTCACGAAG-TCG-3’ì. PMR (5 GGTTGGATCCTTGCGGTCGGTGGTGC-GGGCATTACGG- ỹ ) , trong đó vị trí được gạch chân là vị trí căt của enzyme giới hạn Bamtìỉ. Thành phần cho 10 Ị-il hỗn họp phản ứng 2 ồm: 5 jL.ll Go Taq Colorless Master (Promega, Madision, WI USA), 0,5 |iỉ mồi xuôi PMD; 0,5 (.li mồi ngược PMR; 3,5 Ịil H 20 ; 0,5 Ịil DNA. Phản ứng khuếch đại gồm 30 chu kì, với 5 phút biến tính ở 95°c, 15 giây bắt cặp mồi ở 62°c, 1 phút 30 giây ở 72°c để kéo dài mạch, bước cuối cùng là 72°c trong 7 phút và giữ lạnh ở 4°c. Sản phẩm PCR được điện di và kiểm tra trên gel agarose 1%. Tạo vector tái to hợp pSE T pim M Gen pim M và plasmid pSET152 được căt bàng enzvme giới hạn BamHl. Sau đó sản phâm căt được nổi lại bằng ligation mix để tạo vector tái tổ họp pSETpimM. Vector pSETpimM được khuếch đại bằng cách biến nạp vào chủng E. coli DH5a và chọn lọc bằng kháng sinh apramycin và sàng lọc khuẩn lạc xanh/trắng sử dụng IPTG và X-gal. Khuẩn lạc trắng lựa chọn để nuôi, tách và kiểm tra plasmid pSETpimM bằne điện di với plasmid pSET152, giải trình tự gen pim M được chèn trong plasmid pSET152. Biến nạp vector tái tồ hợp pSE T pim M vào chủng E. coli ET12567 và tiếp hợp với chủng s. natalensis Vector pSETpimM được biến nạp vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002] bằng phương pháp sốc nhiệt ớ 42°c trong 1 phút. Bằng chọn lọc kháng sinh: apramycin, kanamycin và chloramphenicol; và chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng, các khuẩn lạc trắng được lựa chọn và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp bàng cách PCR nhân gen pimM . Chủng E. coli E T 12567 chứa vector tái tổ họp được sử dụng để tiếp hợp với chùng s. natalensis theo phương pháp của Enríquez và cs. [5]. Lựa chọn điều kiện nuôi cấy và môi trường thích hợp Để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh natamycin, chủng xạ khuẩn Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được nuôi cấy trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, tốc độ lắc 160 v/p, nhiệt độ 30°c trong 5 ngày với các điều kiện được khảo sát bao gồm: - Môi trường nuôi cấy: thí nghiệm được tiến hành với 6 loại môi trường dinh dưỡng khác nhau gồm MT1 (glucose - 20, cao bò- 8 , cao nấm men- 2, asparagin - 0,5, KH 2PO 4- 0,05 g/L); MT2 (tinh bột- 10. glucose - 10, bột đậu tương- 10, pepton - 5, CaCƠ 3~ 3 g/1); MT3 (tinh bột - 50, bột đậu tương - 30, cao nấm men - 8 , KH 2PO 4- 0,05, CaCC>3- 2 g/1); MT4 (glucose - 10, peptone- 5, malt extraci - 3, cao nấm men - 3 g/1, 2 ml/1 MgCl2.6H20 2.5M); MT5 (glucose - 10, cao nấm men - 10 g/1); MT6 (glucose - 50, asparagines - 10, ZnS 0 4 .7 H 20 - 0,02; MgSƠ 4.7 H 2 0 - 0,2; FeS 0 4 .71rỈ2 0 0,02; CuSỏ 4.7 H 20 - 0,02 g/1); MT7 (cao nấm men - 20, tinh bột - 10 g/1). - pH của môi trường MT3: được điều chỉnh về các giá trị 5; 6 ; 6,5; 7; 7,5; 8 ; 9 bằng NaOH và HC1. - Thê tích môi trường trong bình nuôi 250 ml: được thay đôi từ 25 ml đên 100 ml MT3. - Các nguồn cacbon khảo sát gồm: tinh bột, glucose, glycerol, malt extract, galactose, dextrin với nồng cộ 5% được thử nghiệm thông qua việc thay thế tinh bột trong môi trường MT3. - N ing độ tinh bột trons MT3: được thay đổi từ 10 đến 70 g/1. - N3ng độ K 2HPO 4 trong MT3 được thay đổi từ 0 đến 1 g/1. - Các nguồn nitơ: được khảo sát gồm NaNC>3 , N H 4 C I, (N H 4 ) 2 SƠ 4 , urea, cao nâm men, cao bò với n ồ n g CỘ 8 g/1 đ ư ợ c th ử n g h iệm th ô n g q u a v iệc th ay th ế cao n ấm m e n tro n g m ô i trư ờ n g M T 3. - N ìng độ cao nấm men trong MT3 được thay đổi từ 2 đến 12 g/1. Lụa ctọn điều kiện tách chiết thích hợp Để xác định được điều kiện tách chiết natamycin tối ưu, dịch nuôi cấy chủng xạ khuân Síreptomyces nataìensis VTCC-A-3245 (M2) đã loại bỏ tế bào được trộn với dung môi. Sau đó hỗn hợp tách chiết được khuấy trộn liên tục bằns máy khuấy từ. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết được khảo sát bao gồm: - Ảnh hưởng của loại dung môi: các dung môi tách chiết được khảo sát bao gồm butanol, hexan và eth /1 acetate, tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), hỗn hợp tách chiết được đảo trộn liên tục v ố tốc độ 500 v/p trong 1 giờ ở 30°c. - Ả ih hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấv : dung môi (v/v): tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi được thay đổi từ 1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v). Hỗn họp tách chiết được khuấy trộn liên tục với tốc độ 500 v/p trong giờ ở 30°c. - Ả ih hưởng của thời gian tách chiết: thời gian tách chiết tăng dần từ 30 phút, 1 giờ, 1,5 giờ và 2 Ó giờ với tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v), tốc độ khuấy trộn là 500 v/p ỡ 30°c. - Ảnh hưởng của tốc độ khuấy trộn: tốc độ khuấy trộn được khảo sát bao gồm 300, 500, 600 và 800 v/p. Hỗn hợp tách chiết có tỷ lệ dung môi : dịch nuôi cấy là 1:1 (v/v) và được đảo trộn liên tục băng máy khuấy từ trong 1 giờ ở 30°c. Gây đột biến bằng kháng sinh Các đột biến kháng rifamycin được thu nhận từ các khuẩn lạc sống sót trong 7 ngày sau khi trải giông cấp 1 trên đĩa thạch GYM chứa riíamycin với các nồng độ khác nhau. Sau đó chủng đột biến kháng rifamycin tiềm năng nhất tiếp tục được gây đột biến theo quy trình tương tự với streptomycin. Xác định hoạt tính của natamycin Hoạt tính của natamycin được xác định định tính theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch [4] với chủng kiểm định Saccharomyces cerevisiae V TCC-Y -62. Ket quả vòng hoạt tính được xác địah sau 24 giờ ủ đĩa thạch ở 30 c . Tinh sạch natamycin bằng sắc kỷ lỏng cao áp (HPLC) Natamvcin được tinh sạch bằng cột sắc ký Eclipse Plus (5 um, 4,6 x 250 mm) (Agilent, Mỹ). Phương pháp HPLC được cài đặt như sau: nồng độ acetonitrile 15% trong 7 phút, tăng đến 50% trong 8 phút, tăng tiếp đến 85% trong 5 phút, giữ ở 85% trong 5 phút và cuối cùng cân bằng lại cột băng 1 5% acetonitrile trong 3 phút; tốc độ dòng 0,5 ml/phút; thu tín hiệu trong dải bước song từ 190 - 600 nm. Đỉnh natamycin được so sánh với phổ hấp thụ của chất chuẩn natamycin trong thư viện HPLC tại Đại học Osaka, Nhật Bản. Natamycin tinh sạch được gửi đi phân tích khối phố LCMS tại Khoa Y Dược, ĐHQGHN. ’ 4. Tông kết kết quả nghiên cứu 4.1. Cải biến di truyền, tạo chủng xạ khuẩn s. natalensis có khả năng sinh chất kháng nam natamycin cao hơn chủng tự nhiên Khuếch dại gen điểu hòa dương pim M từ DNA tong so chủng s. natalensis Trong cụm gen sinh tống hợp natamycin, gen pim M được chứng minh là gen điều hòa dương trong con đường tổng hợp natamycin. pim M và promoter (~ lkb) được khuếch đại từ DNA tống số c ủ a c h u n g x ạ k h uan s. natalensis b an g P C R sứ d ụ n g cặp m ồ i P M D v à P M R . S an p h â m P C R d ư ợ c điện di kiêm tra trên gel agarose 1% với một băng duy nhất xuất hiện có kích thước gần 1 kb đúng như mong đợi (hình 1). M 1 2 Hình 1: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ DNA tổng số (M: l Marker; 1 : pimM; 2: Đối chứnơ âm) 1 2 Hình 2: Gel điện di vector tái tổ hợp pSETpimM được tách từ khuân lạc trăng E. c°li DH5ct (1: Đối chứng - pSET152; 2: pSETpimM) Tạo vector tái tổ hợp pSETpimM Plasmid pSET152 và pim M được cắt bằng Bam ỉỉl và được nối lại bằng ligation mix đế tạo vector tái tô họrp pSETpimM. Vector pSETpimM được bi ến nạp thành cône vào chủne; E. coli 4 DH5a nhàm khuếch đại vector pSETpimM. Chủng E. coli DH5a đã biến nạp được nuôi và tách plasmi d pSETpimM để kiểm tra sự có mặt của vector tái tồ họp pSETpimM. Bằng phương pháp điện di, vector pSETpimM có kích thước lớn hơn kích thước của vector pSET152 đúng như mong đợi (hình 2). Thêm vào đó, vector tái tổ họp pSETpimM được gửi đi giải trình tự để kiêm tra đoạn chèn pim M . Kết quả giái trình tự cho thấy đoạn gen pim M chèn trong vector có trình tự tương đồng 100% với gen pim M AM49372.1 trên ngân hàng gen sử dụng công cụ tìm kiếm blast. Vì vậy, kết quả gi ải trình tự chỉ ra rằng không có đột biến nào xuất hiện trong đoạn gen pim M được chèn ở vector tái tổ hợp. Biến nạp vector tái tổ hợp pSE T pim M vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002] và tiếp hợp với ch ủ ng s. natalensis Bằng phương pháp sốc nhiệt, vector pSETpimM được biến nạp vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002]. Hai khuẩn lạc trắng được lựa chọn cho thí nghiệm PCR nhân gen pỉm M để kiểm tra sự có mặt của vector pSETpimM. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% và kết quả cho thấy hai khuẩn lạc trắng đều có một băng duy nhất gần 1 kb xuất hiện trùng với đối chúng dương (hình 3). Như vậy, pSETpimM được biến nạp thành công vào chủng E. coli ET12567 [pUZ8002]. 925 bp Hình 3: Gel điện di sản phẩm pim M PCR từ khuẩn lạc E. coli ET12567 được biến nạp M: XMarker 1: Đối chứng dương (khuôn pSETpimM) 2: p im M PCR từ khuẩn lạc trắng 1 3: pim M PCR từ khuẩn lạc trắng 2 4: Đối chứng âm (khuôn pSET152) Hình 4: Các thể tiếp họp xuất hiện trên đĩa thạch YS Đe chuyển một bản copy của gen pim M vào bộ gen của chủng s. natalensis, chúng E. coli E T 12567 [pUZ8002] chứa vector pSETpimM được tiếp họp với các bào từ của s. natalensỉs. Bằng cách sử dụng 107 bào tử s. natalensis cho mỗi thí nghiệm tiếp họp sẽ có khoảng 80 khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch MS sau 5 ngày ủ ở 30°c (hình 4). S àng lọc các chủng s. natalensis có chứa gen p im M đã được tích hợp thêm vào hệ gen 60 khuẩn lạc trên dĩa MS agar được cấy vạch lại trên môi trường YS bổ sung thêm kháng sinh apramycin và nalidixic acid. Một khuẩn lạc mọc trên đĩa YS có bổ sung kháng sinh được lựa chọn đê nuôi cấy và tách DNA tổng số đề làm khuôn cho phản ứnơ PCR nhân gen apramycin. Chủng này được đánh số là VTCC-A-3245 (M2). Trên gel agaroase 1%, chỉ có duy nhất một băng 1 kb từ giếng mẫu sử d ụ n ơ khuôn DNA tổng số của chủng cải biến trùng với đối chứng dương sử dụng khuôn pSET152, không có băng nào từ mẫu đối chứng âm sử dụng DNA tổng số của chủng hoang dại xuất hiện (hình 5). Vì vậy, chùng cải biến đã được tiếp họp thành công vector tái tổ hợp và hệ 5 1 2 3 M 9 2 5 bp Hình 5: Gel điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen Apramycin từ chủng cải biến 1: Đối chứng âm (khuôn DNA tổng số của chủng s. natalensis) 2: Chủng cải biến (khuôn DNA tổng số của chủng S.nataỉensis cải biến) 3: Đối chứng dương (khuôn vector pSET152) M: X Marker. Đảnh giá lượng natamycìn của chủng xạ khuẩn cải biến Để kiểm tra khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis đột biến so với chủng dại, dịch nuôi cấy của hai chủng này được tách chiết với n-butanol và phân tích bằng HPLC. Ket quả phân tích diện tích dưới đường cong của peak natamycin của hai mẫu dịch tách từ hai chủng cho thây chủng cải biến có lượng natamycin cao hơn gấp gần 3 lần so với chủng hoang dại (hình 6 ). Kêt quả cân lượng sinh khối khô của hai chủng cho thấy tốc độ sinh trường của hai chủng là như nhau. Hình 6 : Kết quả HPLC của mẫu tách chiết natamycin từ chủng s. natalensis cải biến (B) s. natalensis hoang dại (A) và chủng 4.2. Xây dựng qui trình nuôi cấy tối ưu cho chủng s. nataỉensis đã được cải biến A n h hưởng của loại m ôi trường dinh dưỡng Khả năng sinh natamycin của chủng cải biến Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát trên 7 loại môi trường khác nhau (kí hiệu MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT 6 , MT7). Kết quả ở hình 7 cho thấy, môi trường tốt nhất cho khả năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu là môi trường MT3, tiếp theo là MT2, MT5, MT4, MT1, MT7. Trong môi trường MT 6 , chủng này sinh trưởng kém và khône; sinh natamycin. Như vậy môi trường MT3 (tinh bột - 50. bột đậu tương 30, cao nấm men - 8 , KH 2PO 4- 0,05 CaCOi- 2 g/1) được lựa chọn là môi trưÒTig phù họp nhât cho khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2). 6 \ V V - *A ."0 n \T>'5 v A t^ Hình 7: Ảnh hường của loại môi trường dinh dưỡng lên khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2). Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bàng T test Ợ p < 0,05). A n h h ư ở n g của thê tích môi trường trong bình nuôi v à p H m ôi trường Với mục đích xác định ảnh hưởng của nồng độ oxi hòa tan trong môi trường nuôi cây đến khả năng sinh natamycin của chủng nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thể tích môi trường trong bình nuôi từ 25, 50, 75, 100 ml/bình 250 ml. Kết quả chỉ ra trên hình 8 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin cao nhât khi thê tích môi trường là 50 mỉ. Tăng hoặc giảm thê tích môi trườnơ đều làm giảm sự tổng hợp natamycin của chủng này. 30 Ị ") ■%-ị 20 H - - Ẽ = 15 í = 5 10 '2 15 * 10 r ỉ ỉ 00 Tké tich môi trường (mL) pH Hình 9: Ảnh hưởng của pH lên khả năng Hình 8 : Ảnh hưởng của thể tích môi trường sinh natamycin của chủng s. natalensis lên khả năng sinh natamycin của chủng s. cải biến natalensỉs cải biên Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05) Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) nghiên cứu được xác định trong dải pH từ 5 đến 9 (hình 9). Kết quả chỉ ra trên hình 2 cho thấy, chúng VTCCA-3245 (M2) có khả năng sinh trường và sinh natamycin tốt trong dải pH rộng (từ pH 5 đến 9), trons đó khoảng tối ưu là từ pH 6 đến 8 . Tại khoáng pH tối ưu này, kích thước vòng hoạt tính đạt 23 - 24 mm sau 5 ngày nuôi cấy. A nh hưởng của nguồn cacboiĩ và nồng độ tinh bột Anh hưởng của nguôn cacbon lên khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis cải biên dược chỉ ra trên hình 10. Chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tôt trên tât cả các nguôn cacbon được khảo sát. trong đó galactose là nguồn cacbon tốt nhất với đường kính vòng hoạt tính đạt 26.5 ram sau 5 ngày nuôi cấy. Tiếp theo là nguồn tinh bột, malt extract và dextrin có đường kính vòng hoạt tính đạt 23.5-24 ram sau 5 ngày nuôi cấy. Mặc dù, galactose là nguồn cacbon tôi ưu cho khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) nhưng khi xem xét thêm các khía cạnh vê 7 mặt giá thành và mức độ phong phú của nguồn nguyên liệu thi tinh bột được lựa chọn là nguồn cacbon phù họp nhất cho chủng này. 30 10 ỉ/. 10 GV)'" t i » v' 20 30 40 50 60 Nong độ tinh bộr (g L) (yữ V ‘ -" Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) 70 Hình 11: Anh hưởng của nồng độ tinh bột lên khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05) Kết quả ảnh hường của nồng độ tinh bột khác nhau lên khả năng sinh natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt nhất ờ nồng độ tinh bột 20 g/1 (hình 11). Ở nồng độ tinh bột 20 g/1, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 29,5 mm sau 5 ngày nuôi cấy. A n h hưởng của nông độ phosphate Ảnh hưởng của nồng độ phosphate lên khả năng sinh naíamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) được xác định bàng cách thay đổi nồng độ KH2PO4 trong môi trường nuôi cấy từ 0 đến 1,0 g/1. Kêt quả thu được chỉ ra trên hình 12 cho thấy chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt ở tất cả các nồng độ KH 2PO 4 khảo sát, trong đó đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 23 mm sau 5 ngày nuôi cấy ở nồng độ KH2PO4 0,05 g/1. 2 lỡ zl 0 0,05 cụ ũ=_ 0.3 v,_, vt. > ổ nơ độ K ọ H P 0 4 (g L) Hình 12: Ảnh hường của phosphate lên khả năng sinh natamycin của chủng s. natalensis VTCC-A3245 (M2). Sai khác thống kê giữa các sổ liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05). A n h hưởng của nguồn nitơ và nong độ cao nấm men Sự tống hợp natamycin của chủng VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát trên 7 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ khác nhau như NaNƠ 3- NH4CI, (NH^)2S0 4 , urea, cao nấm men, cao bò. Chủng VTCC-A3245 (M2) sinh natamycin cao nhất trong môi trường chứa nguồn nitơ là cao nấm men với đường kính vòng hoạt tính đạt 24,5 mm sau 5 ngày nuôi cấy. Tiếp theo là (NH 4 )2SC>4 với đường kính vòng 8 hoạt tính đạt 21mm, NH4CI - 17 mm và NaNƠ 3 - 16 mm sau 5 ngày nuôi cấy. Trong môi trường chửa nguồn nitơ là cao bò và urea, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh trường tốt nhưng không sinh natamycin (hình 13). * N ỏ n g đ ộ c a o n â m m e n ( g /L ) Hình 13: Ánh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Hình 14: Ảnh hưởng của nồng độ cao nấm men lên khả năng sinh natamycin của chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05) Khả năng sinh natamycin của chủns VTCC-A-3245 (M2) được khảo sát ở các nồng độ cao nấm men thay đổi từ 2 đén 12 g/1. Kết quả trên hình 14 cho thấy, chủng VTCC-A-3245 (M2) sinh natamycin tốt ở tất cả các nồng độ cao nấm men thí nghiệm, trong đó dường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất là 26 mm sau 5 ngày nuôi cấy khi môi trường có nồng độ cao nấm men 6 g/1. Tuy nhiên, khi so sánh giữa nồng độ cao nấm men 2 g/1 và 6 g/1 thì kích thước vòng hoạt tính đo được khác nhau không nhiều (24 mm và 26 mm, tương ứng) nên khi nuôi cấy ờ quy mô lớn thì có thê xem xét sử dụng nồng độ cao nấm men 2 g/1 để giảm chi phí. Để thấy rõ hơn ảnh hưởng của thành phần môi trường lên khả năng sinh natamycin của chủng Sừeptomycẻs nulalensis VTCC-A-3245 (M2), chúng tôi đã tiên hành so sánh sự tông hựp natamycin của chủng này trong môi trường tối UXI và môi trường không tối ưu. Ket quả trên hình 15 cho thây, đường kính vòng hoạt tính đạt cao nhất trong môi trưòng tối ưu và không tối ưu lần lượt là 26 mm và 18 ram, tương ứng, sau 5 ngày nuôi cấy. Như vậy có thể thấy rằng sau quá trình lựa chọn môi trường nuôi cấy thích họp thì đường kính vòng hoạt tính đã tăng lên khoảng 44% so với môi trường ban đầu. 30 1 = s ec* 25 1 0 DD 2 0 i •p s - £ 1 ‘I 10] - 1 <5 - 5 j 0 '— 1 2 3 4 5 6 7 T h òi gian (n gày) ~ M ô i trư ờ n e tố i ưu —®— M ôi trư ờ n g ban đâu Hình 15: Khả năng sinh natamycin của chủng Strepíomyces natalemis VTCC-A-3245 (M2) trong môi trường tối ưu và môi trưÒTìg ban đâu 4.3. Xây dựng quy trình tách chiết, tinh sạch natamycin sinh ra từ chủng s. natalensis đã được cái biên 9 A n h hưởng của loại dung m ôi và tỷ lệ dịcli nuôi cấy : dưng môi Đe xác định loại dung môi tối un cho quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s. naíalensis cải biến, chúng tôi đã tiến hành khảo sát 3 loại dung môi khác nhau bao gồm: hexan, ethyl acetate và hutanol. Ket quả cho thấy, butanol là dung môi tốt nhất để tách chiết natamycin từ chủng này (hình 16). 25 o £2 20 Ồ sD'p 15 o i 10 c 3 c 5 bD •S V T ' ■ ■-r........... 1.. = 5 Ethyl Hexan Butanol acetate 20 15 1 Ì > 10 ị zl £ -| ĩ J ■ 0 4 1:0,5 1:1 1:2 1:3 Tỷ lệ dịch nuôi cây/dung môi (V A ) ' Hình 16: Ảnh hưởng của loại dung môi lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s. natalensis cải biến Hình 17: Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s. natalensis cải biến Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0,05) Ảnh hường của tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi butanol (1:0,5; 1:1; 1:2 và 1:3 (v/v)) lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chùng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được chỉ ra trên hình 17. Kết quà cho thấy, tỷ lệ dịch nuôi cấy : dung môi = 1 :1 (v/v) là tỷ lệ tối ưu nhất để tách chiết r.atamycin. Tăng hoặc giảm thể tích butanol đều làm giảm hiệu quả tách chiết natamycin. Anh hưởng của thời gian tách chiết và tốc độ khuấy trộn Chung tôi tiến hànhkhảo sát hiệu suấtthu nhận natamycin từ dịch nuôi cấy chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) ở các thờigian tách chiết thay đổi từ 0,5 đến 2 giờ. Kết quả chỉ ra trên h nh 18 cho thấy, thời gian tách chiết natamycin tối ưu là 1 giờ. Giảm thời gian tách chiêt xuông 0,5 giờ hoặc tăng lên 1,5 hoặc 2 giờ đều làm giảm khoảng 10 - 12% hiệu suất tách chiết natam/cin. 20 •s — -4 ;C __— zt - Thời gian rách chiẻt (giờ) H hh 18: Anh hưởng của thời gian tách chiết lên hiệu suất thu nhận natamycin sinh ra từ chủng s. natalensis cải biến 300 500 ố 00 800 Tôc độ khuây trộn (v/p) Hình 19: Ảnh hường của tốc độ khuấy trộn lên quá trình tách chiết natamycin sinh ra từ chủng s. nataỉensis cải biên Sai khác thống kê giữa các số liệu được tính toán bằng T test (*p < 0.05) Am hưởng của tốc độ khuấv trộrt lên quá trình tách chiết natamvcin sinh ra từ chủng StrepDmyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) được chỉ ra trên hình 19. Kết quả cho thấy, tốc độ 10 khuấy trộn tối ưu nhất là 600 v/p. ở các tốc độ khuấy trộn khác (300, 500 và 800 v/p), hiệu suất tách chiết natamycin giảm đi không đáng kê. Tinh sạch natamycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCC-A-3245 (M2) Natamycin trong dịch chiết butanol được tinh sạch bằng phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký Eclipse Plus C18, tốc độ dòng 0,5 ml/phút. Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết butanol trước và [-lình 20: Kết quả phân tích HPLC của dịch chiết natamycin trước (A) và sau tinh sạch (B) Kết quả phân tích HPLC cho thấy, natamycin sinh ra từ chủng Streptomyces natalensis VTCCA-3245 (M2) có phổ hấp thụ trùng với natamycin chuẩn với 4 đình hấp thụ cực đại ở các bước sóng 279, 290, 304 và 318 nm (hình 21). Tiến hành chạy HPLC nhiều lần và thu lại phân đoạn chứa duy nhất natamycin. Phân đoạn natamycin thu nhận dược được làm khô bằng máy cô quay chân không và bảo quản ở -2 0 °c. Phô hấp thụ của natamycìn chuàn Norm 1200 £3- 1000 a «ữ Phô hâp thụ của natamycin sinh ra tử chủng s, natalensis cải biên lí Ờ} > \ - Xem thêm -