Tài liệu Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa Peroxidase ở cây dừa cạn (Catharanthus Roseus (L.) G. Don) (Luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN MÃ HÓA PEROXIDASE Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON) LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên, năm 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LƢƠNG THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM GEN MÃ HÓA PEROXIDASE Ở CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS (L.) G. DON) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2015 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi thƣ̣c hiê ̣n dƣới sƣ̣ hƣớng dẫn của PGS .TS. Nguyễn Thị Tâm. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, tháng 07 năm 2015 Tác giả Lƣơng Thanh Huyền Xác nhận của khoa chuyên môn Xác nhận của người hướng dẫn khoa học Nguyễn Thị Tâm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS.TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo thuộc Bô ̣ môn Di truyề n & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn các cán bô ̣ Phòng DNA ƣ́ng du ̣ng , Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ gen , Viê ̣n Công nghê ̣ sinh ho ̣c , Viê ̣n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi tiến hành các thí nghiê ̣m của đề tài. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian ho ̣c tâ ̣p và thƣ̣c hiê ̣n đề tài luận văn. Đề tài luâ ̣n vă n thuô ̣c chƣơng triǹ h đào ta ̣o nghiên cƣ́u sinh và cao ho ̣c của Bộ môn Di truyền & Sinh ho ̣c hiê ̣n đa ̣i , khoa Sinh - Kỹ thuật nông nghiê ̣p, trƣờng Đa ̣i ho ̣c Sƣ pha ̣m - Đa ̣i ho ̣c Thái Nguyên. Tác giả Lƣơng Thanh Huyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC ........................................................................................................ iii DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................... vi MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................... 1 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ...................................................................... 2 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU...................................................................... 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3 1.1.ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA CÂY DỪA CẠN ... 3 1.1.1. Đặc điểm chung của cây dừa cạn ........................................................ 3 1.1.2. Một số công dụng của cây dừa cạn...................................................... 4 1.2. HỢP CHẤT ALKALOID ....................................................................... 5 1.2.1. Alkaloid ở thực vật .............................................................................. 5 1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn ........................................................................ 9 1.2.3. Một số gen liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây dừa cạn15 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ............................................. 21 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................ 21 2.1.2. Hóa chất và thiết bị ............................................................................ 21 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 21 2.2.1. Phƣơng pháp thu mẫu ........................................................................ 21 2.2.2. Các phƣơng pháp sinh học phân tử ................................................... 22 2.3. THỜI GIAN VÀ ĐIẠ ĐIỂM NGHIÊN CƢ́U ...................................... 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 27 3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI VÀ TÁCH DÒNG Prx TỪ MẪU DỪA CẠN HOA HỒNG TÍM VÀ HOA TRẮNG ............................................... 27 3.1.1. Kết quả khuếch đại đoạn gen Prx từ mRNA ..................................... 27 3.1.2. Kết quả tách dòng đoạn gen Prx........................................................ 28 3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN TỪ ĐOẠN GEN Prx CỦA HAI MẪU DỪA CẠN NGHIÊN CỨU ............................................. 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Thành phần phản ứng RT-PCR nhân gen Prx ................................ 23 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng gắn gen Prx vào vector tách dòng pBT ...... 24 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony - PCR .............................................. 25 Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide sai khác giữa ba trình tự nucleotide của đoạn gen Prx (cDNA) ..................................................................................... 31 Bảng 3.2. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid suy diễn của protein Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN 1-Hongtim, TN2-Trang và protein suy diễn từ AY924306 trên Ngân hàng gen ...................................................................... 33 Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gen Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN1-Hongtim, TN2-Trang và 6 mẫu dừa cạn trên Ngân hàng gen ................................................................................... 34 Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng và hệ số sai khác về trình tự amino acid của protein Prx ở 2 mẫu dừa cạn TN1-Hongtim và TN2-Trang và 6 mẫu dừa cạn trên Ngân hàng gen ................................................................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus ....................................................... 4 Hình 1.2. Con đƣờng tổng hợp vinblastine và vincristine ............................. 11 Hình 1.3. Cấu trúc intron và exon của CrPrx ................................................. 16 Hình3.1. Kế t quađiê CrPrx ...... 27 ̉ ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR khuếch đại đoa ̣n cDNA Hình 3.2. Kế t quả điê ̣n di sản phẩ m colony - PCR tƣ̀ khuẩ n lạc .................... 28 Hình 3.3. So sánh trình tự đoạn gen Prx của mẫu dừa cạn TN1-Hongtim, TN2-Trang và AY924306 ............................................................................... 30 Hình 3.4. So sánh trình tƣ̣ amino acid suy diễn của hai mẫu dừa cạn TN 1Hongtim, TN2-Trang và của protein suy diễn tƣ̀ AY 924306 trên Ngân hàng gen... 32 Hình 3.5. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng đoạn gen Prx của 8 mẫu dừa cạn..................................................................................................... 35 Hình 3.6. Sơ đồ hình cây so sánh mức độ tƣơng đồng dựa trên trình tự amino acid suy diễn của 8 mẫu dừa cạn .......................................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt CrPrx Catharanthus roseus peroxidase Gen Prx ở cây dừa cạn DAT Deacetylvindoline 4-O-acetyl tranferase Gen DAT ở cây dừa cạn DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic FDA Food and Drug Administration Cục quản lý Thực phẩm và Dƣợc phẩm Hoa Kỳ ORCAs Octadecanoid - responsive Catharanthus Các gen ORCA AP2/ERF domain ORF Open read frame Khung đọc mở PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp Prx Peroxidase Gen mã hóa peroxidase Prx Peroxidase Protein peroxidase RNA Ribonucleic acid Axit Ribonucleic TIAs Terpenoid indole alkaloids Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Sự thay đổi khí hậu toàn cầu dẫn tới sự khắc nghiệt của thời tiết, môi trƣờng sống bị ô nhiễm, thói quen sinh hoạt của con ngƣời thay đổi… Những yếu tố này tác động đến sức khỏe của con ngƣời, làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh, trong đó có nguy cơ các tế bào bị biến đổi. Đây là một trong các nguyên nhân làm cho số ca mắc bệnh ung thƣ ngày càng tăng. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị ung thƣ chƣa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Vì thế, một trong những nhiệm vụ hàng đầu của các nhà khoa học là nghiên cứu, cải tiến các biện pháp chữa trị ung thƣ để kéo dài thời gian sống cho ngƣời bệnh. Xu hƣớng của thế giới hiện nay là nghiên cứu phƣơng pháp làm tăng hàm lƣợng alkaloid ở cây thảo dƣợc để hạ giá thành thuốc chƣ̃a bê ̣nh. Dừa cạn là một trong những cây có khả năng sản xuất các indol alkaloid có dƣợc tính quan trọng trong chế tạo các loại thuốc chống ung thƣ. Đặc biệt là hai loại vinblastine, vincristine có tác dụng chữa ung thƣ máu. Nhƣng các chất này lại có hàm lƣợng rất nhỏ trong tế bào thực vật (khoảng nửa tấn lá khô dừa cạn mới chiết đƣợc 1g vinblastine cho sản xuất dƣợc phẩm, còn vincristine thì ít hơn 10 lần nữa [6]) và không thể tổng hợp bằng con đƣờng hóa học do chúng có cấu trúc rất phức tạp. Do vậy, nâng cao hàm lƣợng vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn theo hƣớng công nghệ gen là một hƣớng nghiên cứu đƣợc quan tâm bởi nhiều nhà khoa học trên thế giới. Để triển khai theo hƣớng nghiên cứu này, nhiều gen liên quan đến con đƣờng sinh tổng hợp alkaloid trong dừa cạn đã đƣợc phân lập và nghiên cứu. Trong cây dừa cạn, vinblastine và vincristine đƣợc tạo ra từ sự kết hợp các tiền chất nhƣ catharanthine và vindoline dƣới sự điều khiển của một số gen nhƣ DAT, ORCA3, Prx… Trong đó, peroxidase (Prx) là một enzyme quan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2 trọng xúc tác ở giai đoạn cuối của quá trình tổng hợp vinblastine và vincristine. Nâng cao khả năng tổng hợp vinblastine và vincristine trong cây dừa cạn để phục vụ cho việc tạo thuốc chữa bệnh ung thƣ là rất cần thiết. Để tăng năng suất tổng hợp hai loại ankaloid trên, việc nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa enzyme xúc tác là rất quan trọng. Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới và Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về các gen này. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm gen mã hóa peroxidase ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don)”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Xác định đƣợc trình tự đoạn gen mã hóa enzyme Prx ở cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) mẫu hoa hồng tím, hoa trắng và so sánh với một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. So sánh trình tự amino acid suy diễn của protein Prx hai mẫu hoa hồng tím, hoa trắng với một số trình tự amino acid đã công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khuếch đại tách dòng và xác định trình tự đoạn gen Prx của hai mẫu dừa cạn hoa hồng tím và hoa trắng. - So sánh trình tự đoạn gen Prx, trình tự amino acid suy diễn của protein Prx các mẫu dừa cạn nghiên cứu với một số trình tự đã công bố trên Ngân hàng gen. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. ĐẶC ĐIỂM CHUNG VÀ MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA CÂY DỪA CẠN 1.1.1. Đặc điểm chung của cây dừa cạn Giống Catharanthus có nguồn gốc ở Madagasca với 8 loài, trừ loài C. pusillus (Murr) G. Don tìm thấy đầu tiên ở Ấn Độ, Srilanca. Từ Madagasca loài dừa cạn đƣợc di nhập sang nhiều nƣớc nhiệt đới Nam Á cũng nhƣ Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam và đảo Hải Nam - Trung Quốc [1]. Ở Việt Nam, dừa cạn có vùng phân bố tự nhiên tƣơng đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế, Quảng Nam, Ðà Nẵng, Bình Ðịnh và Phú Yên. Ở những vùng phân bố tự nhiên ven biển, dừa cạn mọc trên các bãi cát dƣới rừng phi lao, trảng cỏ, cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai khô cằn của vùng cát ven biển. Cây dừa cạn còn đƣợc trồng khắp nơi trong nƣớc để làm cảnh và làm thuốc [1]. Cây dừa cạn hay hải đằng, dƣơng giác, bông dừa, trƣờng xuân hoa… thuộc họ Apocynaceae, bộ Gentianales, có tên khoa học là: Catharanthus roseus (L.) G. Don [36]. Catharanthus roseus (L.) G. Don là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid terpenoid indole đƣợc biết đến với 3 giống cây khác nhau: „roseus‟ với hoa màu hồng tím; „ocellatus‟ với hoa màu trắng, nhụy đỏ; „albus‟ với hoa màu trắng. Trong đó giống hoa màu hồng tím có hàm lƣợng vincristine và vinblastine cao nhất [36]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 4 . Hình 1.1. Hoa của ba giống Catharanthus A: Catharanthus roseus var. roseus B: Catharanthus roseus var. ocellatus C: Catharanthus roseus var. albus Cây dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành, cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi dày [1]. Lá mọc đối, thuôn dài, đầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dƣới nhạt [1]. Hoa trắng hoặc hồng tím, có mùi thơm. Hoa đều, lƣỡng tính, mẫu 5. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá gần ngọn. Quả gồm 2 đại, dài 2-4cm, rộng 2-3cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, đầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng, trên mặt hạt có các hột nổi thành đƣờng chạy dọc. Mùa hoa quả gần nhƣ quanh năm [1]. 1.1.2. Một số công dụng của cây dừa cạn Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid. Ngƣời ta đã chiết, phân lập ra trên 150 alkaloid khác nhau, chủ yếu là vinblastine, vincristine, tetrahydroalstonine, pirinine, vindoline, catharanthine, vindolinine, ajmalicin… Trong đó, ajmalicin có hiệu quả tốt trong điều trị rối loạn thần kinh tim. Còn vinblastine và vincristine có tác dụng làm ngừng sự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5 phân chia tế bào ở pha giữa do có khả năng liên kết đặc hiệu với tubulin, protein ống vi thể ở thoi phân bào. Vì thế, chúng đƣợc sử dụng làm nguyên liệu bào chế thuốc điều trị ung thƣ [1]. Theo kinh nghiệm dân gian ở Việt Nam và Trung Quốc, có nơi dùng thân và lá phơi khô, sắc uống để thông tiểu tiện, chữa bệnh đi tiểu đỏ và ít, làm thuốc điều kinh, tẩy giun, chữa sốt, chữa bệnh ngoài da [1]. 1.2. HỢP CHẤT ALKALOID 1.2.1. Alkaloid ở thực vật 1.2.1.1. Đặc điểm chung của alkaloid Alkaloid là những chất hữu cơ có chứa dị vòng nitơ và có tính base, thƣờng gặp trong nhiều loại thực vật và đôi khi còn tìm thấy trong một vài loài động vật. Đặc biệt, alkaloid có hoạt tính sinh lý rất cao đối với cơ thể con ngƣời và động vật, nhất là đối với hệ thần kinh. Với một lƣợng nhỏ alkaloid là chất độc gây chết ngƣời nhƣng có khi nó là thần dƣợc trị bệnh đặc hiệu. Hàm lƣợng alkaloid có thể đạt tới 10% trong các loại rau quả thông dụng nhƣ khoai tây, chè, cà phê [9]. Các alkaloid thông thƣờng đƣợc phân loại theo đặc trƣng phân tử chung của chúng, dựa theo kiểu trao đổi chất đƣợc sử dụng để tạo ra phân tử. Khi ngƣời ta chƣa biết nhiều về tổng hợp sinh học của alkaloid, thì chúng đƣợc gộp nhóm theo tên của các hợp chất đã biết. Ví dụ: do các cấu trúc phân tử xuất hiện trong sản phẩm cuối cùng nên các alkaloid thuốc phiện đôi khi còn đƣợc gọi là các “phenanthren”. Hay gọi tên dựa theo nhóm động/thực vật mà từ đó ngƣời ta chiết xuất ra các alkaloid, ví dụ nhƣ các alkaloid chiết từ cây dừa cạn vinca thì đƣợc gọi chung là các vinca alkaloid [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 6 1.2.1.2. Tính chất của alkaloid Phần lớn alkaloid trong tự nhiên công thức cấu tạo có oxy thƣờng ở thể rắn ở nhiệt độ thƣờng. Ví dụ: Morphine, codeine, strychnine, quinine, reserpine. Những alkaloid mà thành phần cấu tạo không có oxy thƣờng ở thể lỏng. Nhƣng cũng có một số trƣờng hợp ngoại lệ ở thể rắn. Ví dụ: Coniin, nicotine, sparteine. Các alkaloid ở thể rắn thƣờng kết tinh và có điểm chảy rõ ràng, nhƣng cũng có một số alkaloid không có điểm chảy vì bị phân hủy bởi nhiệt độ trƣớc khi chảy [24]. Đa số alkaloid không mùi, có vị đắng và một số ít có vị cay nhƣ capsaixin, piperine… Hầu hết các alkaloid đều không màu, trừ một số alkaloid có màu vàng nhƣ berberine, palmatine, chelidonine. Các alkaloid base không tan trong nƣớc, dễ tan trong các dung môi hữu cơ nhƣ methanol, ethanol, ether, chloroform, benzen… Muối của alkaloid dễ tan trong nƣớc, hầu nhƣ không tan trong các dung môi hữu cơ. Dựa vào độ tan khác nhau của alkaloid base và muối alkaloid ngƣời ta sử dụng dung môi thích hợp để chiết xuất và tinh chế alkaloid. Do có tính base yếu nên có thể giải phóng alkaloid ra khỏi muối của nó bằng dung dịch kiềm trung bình và mạnh nhƣ NH4OH, NaOH… [24]. Trƣớc đây ngƣời ta cho rằng, nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất đƣờng hay dẫn suất của đƣờng kết hợp với amoniac để có nitơ sinh ra. Ngày nay, bằng phƣơng pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ) ngƣời ta chứng minh đƣợc rằng các alkaloid tạo ra từ các amino acid và đã có nhiều nghiên cứu tổng hợp alkaloid từ amino acid [34]. Qua nghiên cứu định tính và định lƣợng các alkaloid trong các bộ phận khác nhau của cây và theo dõi sự vận chuyển của chúng trong quá trình phát triển của cây ngƣời ta thấy, nơi tạo ra alkaloid không phải là nơi tích tụ nhiều alkaloid. Nhiều alkaloid đƣợc tạo ra ở rễ sau đó vận chuyển lên phần trên mặt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 7 đất của cây. Sau khi thực hiện những biến đổi thứ cấp chúng đƣợc tích lũy ở lá, quả và hạt. Ví dụ: L-hyoscryamin trong cây cà độc dƣợc (Atropa belladonna) đƣợc tạo ra ở rễ, sau đó chuyển lên phần trên mặt đất. Khi cây 1 tuổi thân cây chứa nhiều alkaloid hơn lá, khi cây 2 tuổi thân cây hóa gỗ nhiều hơn, hàm lƣợng alkaloid giảm xuống, hàm lƣợng alkaloid ở phần ngọn đạt đƣợc mức tối đa vào lúc cây ra hoa và giảm đi khi quả chín [6]. Ngoài ra, hàm lƣợng của alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ khí hậu, ánh sáng, chất lƣợng đất, giống cây và bộ phận thu hái [26]. 1.2.1.3. Một số nghiên cứu nâng cao khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp bằng kỹ thuật nuôi cấy mô Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây bạch chỉ (Angelica dahurica var. Formosana). Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, đƣợc sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin đƣợc xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây bạch chỉ bằng phƣơng pháp nhân giống truyền thống thì sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng đƣợc nhu cầu. Vì vậy phƣơng pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã đƣợc chọn lựa sử dụng [27]. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây hoàng liên (Coptis japonica) và vỏ của cây quan hoàng bá (Phellondendron amurense). Berberine chloride đƣợc sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu đƣợc nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1981) đã chọn dòng tế bào có khả năng sản suất berberine cao của loài C.japonica [31]. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện đƣợc năng suất bằng cách thêm 8-10M gibberellic acid vào môi trƣờng nuôi cấy, hiệu suất berberine tăng lên rất nhiều đến 1,66 g/l [19]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 8 Merkli và cộng sự (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây cỏ ca ri (Trigonella foenum-graecum) bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp của các hormon steroid [18]. Yel và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây củ nâu (Dioscorea doryophola). Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng nhƣ một cách để thay thế quá trình tổng hợp steroid [32]. Miyasaka và cộng sự (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây xôn đỏ (Salvia miltiorrhiza). Nồng độ cao nhất của cryptotanshinone thu đƣợc trong callus nuôi cấy trên môi trƣờng có 0,2 mg/l BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lƣợng khô [20]. Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u đƣợc tìm thấy ở các cây thuộc họ Hoàng liên gai nhƣ Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng đƣợc dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u. Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trƣởng rất chậm, vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hƣớng tới một phƣơng thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã đƣợc Kadkade và cộng sự thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cộng sự (1990) đã bổ sung phức hợp coniferyl alcohol và bcyclodextrin trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào huyền phù của Podophyllum hexandrum. Khi bổ sung 3mM phức hợp coniferyl alcohol và b-cyclodextrin đã làm tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0,013% theo khối lƣợng khô, trong khi các môi trƣờng nuôi cấy không có phức hợp trên chỉ sản xuất đƣợc 0,0035% podophyllotoxin [11] [30]. Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bƣớc tiến xa trong khoa học thực vật. Việc phát triển và sử dụng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 9 các công cụ di truyền cũng nhƣ sự hiểu biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phƣơng thức điều hòa quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở quy mô thƣơng mại [23]. Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứ cấp chủ yếu gắn liền với công nghệ nuôi cấy tế bào bắt đầu hình thành và phát triển vào năm 1970. Từ đó đến nay đã đạt đƣợc nhiều thành công, đáng kể nhất là quy trình sản xuất sâm Ngọc Linh do Học viện Quân y khai thác. Chỉ với một vài tế bào từ rễ của sâm Ngọc Linh, bằng kỹ thuật nuôi cấy tế bào, các nhà khoa học của Học viện Quân y đã có thể sản xuất sâm Ngọc Linh với số lƣợng lớn trong vòng 10-20 ngày. Phƣơng pháp sản xuất sinh khối tế bào rễ nhân sâm Ngọc Linh đƣợc cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày 11/2/2009 tại Việt Nam [2]. Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ cây thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra, còn có nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng của Viện sinh học Nhiệt đới trong nghị định thƣ hợp tác với Malaysia (20072010), Đại học Huế nghiên cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense. Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn ở quy mô phòng thí nghiệm [2]. 1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn 1.2.2.1. Các alkaloid chính trong cây dừa cạn Alkaloid toàn phần có ở lá dừa cạn với hàm lƣợng 0,37-1,15%, thân 0,40%, rễ chính 0,7-2,4%, rễ phụ 0,9-3,7%, hoa 0,14-0,84%, vỏ quả 1,14%, hạt 0,18%. Trong số các loại alkaloid có trong Catharanthus roseus, đặc biệt chú ý nhóm 20 alkaloid dimeric là những nhóm có hoạt tính chống ung thƣ, bao gồm vincristine và vinblastine [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 10 Vinblastine có ở lá cây dừa cạn với hàm lƣợng 0,013-0,063%, ở bộ phận trên mặt đất 0,0015%, ở rễ 0,23%. Nếu cây bị bệnh asteryllow-virus thì sẽ không có vinblastine. Vincristine có hàm lƣợng thấp hơn vinblastine, khoảng 0,0003-0,0015% trong các bộ phận của cây [22]. Ở Việt Nam, lá dừa cạn thu thập ở nhiều địa phƣơng khác nhau chứa hàm lƣợng alkaloid toàn phần từ 0,7-1,2%, cao nhất ở Phú Yên (1,21-1,62%). Vinblastine có với hàm lƣợng 1,6-2,0 phần vạn ở lá. Thời gian thu hái nguyên liệu tốt nhất để trên cây có hàm lƣợng hoạt chất cao là vào cuối tháng 8 đến giữa tháng 9 dƣơng lịch [22]. Ngoài hai alkaloid chính là vinblastine và vincristine đƣợc chiết xuất, nhiều tác giả đã bán tổng hợp đƣợc vinblastine từ cathanthine và vindoline có ở dừa cạn và vincristine (có với hàm lƣợng thấp) từ vinblastine (có với hàm lƣợng cao hơn) [15]. Lần đầu tiên ở Việt Nam đã nghiên cứu thành công phƣơng pháp phân lập ajmalicin từ alkaloid toàn phần đã khử hóa của rễ dừa cạn mà không dùng sắc kí cột cũng nhƣ các dung môi độc hại nhƣ benzen, cloroform. Từ hỗn hợp alkaloid toàn phần đã khử hóa, ajmalicin đƣợc phân lập bằng dung môi thông dụng, không độc hại là ethanol và hỗn hợp ethyl acetat-n-hexan. Từ đó đã xây dựng một quy trình đơn giản, không độc hại để phân lập ajmalicin. Lƣợng ajmalicin chiết xuất và phân lập đƣợc đạt 0,184% khối lƣợng khô [3]. Những alkaloid này chỉ là chiếm lƣợng nhỏ trong cây, vì vậy nếu muốn sản xuất thì phải cần số lƣợng rất lớn nguyên liệu thô để chiết xuất [15]. 1.2.2.2. Sinh tổng hợp vinblastine và vincristine ở cây dừa cạn Vinblastine và vincristine đƣợc tạo thành từ sự ghép nối của hai monomer alkaloid là catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole), cả hai đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có cấu trúc tƣơng tự nhƣ vinblastine nhƣng thay nhóm formyl bằng một nhóm methyl trên phân tử nitrogen indole của vindoline [22]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 11 Hình 1.2. Con đƣờng tổng hợp vinblastine và vincristine [17] Những alkaloid này đƣợc hình thành bởi sự kết hợp của hai nửa, một nửa là indole và một nửa là dihydroindole. Vì thế, chúng đƣợc biết đến với tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid” [22]. Sự khác nhau của Catharanthus alkaloid phụ thuộc vào loại terpenoid indole alkaloid (TIA). Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt là quá trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và quá trình tryptophan cho nửa chứa tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn từ tryptophan). Và nguyên tử nitơ thứ hai đƣợc tạo thành từ sự tách rời của hai carbon tại vị trí β của vòng indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ acid mevalonic và nó là một C10-geraniol (monoterpenoid). Geraniol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu - ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn/