Tài liệu Nghiên cứu xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM NGUYỄN THỊ TRANG NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT BỘT NẤM MEN GIÀU KẼM LÀM NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT THỰC PHẨM BỔ SUNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 62.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Lê Đức Mạnh TS. Nguyễn Thị Minh Khanh Hà Nội - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và một số kết quả nghiên cứu hợp tác với các cộng sự khác. Các số liệu, kết quả trong Luận án là trung thực, khách quan, một phần đã được tôi công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành trong nước và quốc tế, phần còn lại chưa được ai công bố trên bất cứ công trình nghiên cứu nào. Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trang năm 2019 LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghiệp thực phẩm, bằng sự biết ơn và kính trọng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban Lãnh đạo, Hội đồng Khoa học và Đào tạo, Phòng Kế hoạch Khoa học và Hợp tác quốc tế, Trung tâm Hóa sinh công nghiệp và Môi trường - Viện Công nghiệp Thực phẩm đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận án tiến sĩ này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Đức Mạnh và TS. Nguyễn Thị Minh Khanh là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, định hướng, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Chu Đình Bính và các cán bộ khoa Hóa Phân tích Trường đại học Bách Khoa Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích mẫu. Tôi xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp trong và ngoài Viện đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, khuyến khích tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin gửi tấm lòng ân tình tới gia đình, chồng và các con là nguồn động viên, truyền nhiệt huyết giúp tôi hoàn thành luận án./. Hà Nội, ngày tháng Nghiên cứu sinh Nguyễn Thị Trang năm 2019 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................4 1.1. Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm................................................................4 1.1.1. Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm .........................................4 1.1.2. Nhu cầu kẽm của cơ thể ..........................................................................5 1.1.3. Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam ......................................5 1.1.4. Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể ........7 1.2. Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp...........................9 1.3. Khả năng hấp thụ kim loại và cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men ....11 1.3.1. Khả năng hấp thụ kim loại của nấm men .................................................11 1.3.2. Cơ chế tích lũy kẽm trong tế bào nấm men ..............................................12 1.3.3. Vị trí tích lũy của kẽm trong tế bào nấm men ..........................................16 1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình tích lũy kẽm của nấm men...............17 1.3.4.1. Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm ....................................................17 1.3.4.2. Ảnh hưởng của các nguồn khoáng ........................................................18 1.3.4.3. Ảnh hưởng của các nguồn cacbon.........................................................18 1.3.4.4. Ảnh hưởng của nguồn nitơ ....................................................................20 1.3.4.6. Ảnh hưởng của một số yếu tố khác .......................................................21 1.4. Các phương pháp lên men sử dụng trong sản xuất sinh khối nấm men giàu kẽm ...............................................................................................................................23 1.4.1. Phương pháp lên men gián đoạn (batch fermentation) ............................23 1.4.2. Phương pháp lên men gián đoạn bổ sung cơ chất (fed-batch fermentation) ............................................................................................................................24 1.5. Các nghiên cứu về nấm men giàu kẽm ........................................................26 1.6. Các phương pháp phá tế bào nấm men........................................................27 1.6.1. Phương pháp cơ học .............................................................................27 1.6.2. Phương pháp phi cơ học .......................................................................29 1.6.3. Sử dụng kết hợp các phương pháp........................................................32 1.7. Các sản phẩm chức năng giàu kẽm trên thế giới .........................................34 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................37 2.1. Vật liệu và hóa chất ........................................................................................37 2.2. Dụng cụ và thiết bị ..........................................................................................38 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................38 2.3.1. Phương pháp phân tích .............................................................................38 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu ..........................................................................44 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu .........................................................................53 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................54 3.1. Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập VSVCN – Viện CNTP ...............................................................54 3.1.1. Phân lập các chủng nấm men ...................................................................54 3.1.2. Nghiên cứu sàng lọc chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao ......57 3.1.3. Xác định đặc tính chủng nấm men tuyển chọn được ...............................65 3.2. Nghiên cứu các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm ............70 3.2.1. Nghiên cứu xác định điều kiện phù hợp cho quá trình nuôi cấy nhân giống chủng nấm men đã lựa chọn ...............................................................................70 3.2.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm .....................................................................................................76 3.2.3. Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung cơ chất (Fed-batch fermentation) .............98 3.3. Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm ..........105 3.3.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp phá tế bào nấm men .......................105 3.3.2. Phương pháp nâng cao chất lượng cảm quan (giảm màu, mùi của dịch thủy phân nấm men) .................................................................................................114 3.3.3. Nghiên cứu lựa chọn các thông số của quá trình sấy phun dịch nấm men ..........................................................................................................................118 3.4. Xây dựng quy trình công nghệ và sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ quy mô thực nghiệm ...................................................................................................123 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................130 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................133 PHỤ LỤC ................................................................................................................151 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần axit amin, khoáng chất và vitamin của nấm men ................10 Bảng 1.2. Những protein vận chuyển kẽm tham gia vào quá trình cân bằng nội bào kẽm ...........................................................................................................................14 Bảng 1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hiệu quả tự phân của nấm men ...................31 Bảng 1.4. Một số sản phẩm bổ sung kẽm trên thị trường ........................................35 Bảng 3.1. Đặc điểm khuẩn lạc, hình thái tế bào, khả năng lên men rượu và sinh khí CO2 của các chủng nấm men phân lập .....................................................................55 Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ Zn(NO3)2 tới hàm lượng kẽm trong sinh khối khô của các chủng nấm men (mg/g) ................................................................................58 Bảng 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ Zn(NO3)2 tới khối lượng sinh khối khô của các chủng nấm men (g/100 ml). ......................................................................................59 Bảng 3.4. Hàm lượng kẽm hữu cơ tồn tại trong 12 chủng nấm men giàu kẽm ........62 Bảng 3.5. Khả năng phát triển trên các điều kiện khác nhau ....................................66 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng nấm men .......................67 Bảng 3. 7. Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới sự sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae A112 .....................................................................................................72 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng của S. cerevisiae A112 ................73 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của các nguồn muối kẽm tới khả năng tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ............................................................................................................77 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S. cerevisiae A112 ....................................................78 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của các nguồn nitơ tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S. cerevisiae A112 ....................................................80 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của việc bổ sung MgSO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ...................................................................................83 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của việc bổ sung KH2PO4 tới khả năng sinh trưởng và tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men S. cerevisiae A112 ....................................................84 Bảng 3.14. Kết quả bổ sung muối Fe2(SO4)3 và hàm lượng kẽm tích lũy trong sinh khối nấm men ............................................................................................................85 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S. cerevisiae A112 ..........................................................................................................................88 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của pH tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S. cerevisiae A112 ..........................................................................................................................89 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của chế độ lắc tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng ..........91 Bảng 3.18. Hàm lượng kẽm và khối lượng sinh khối sau lên men ở các điều kiện khác nhau ...........................................................................................................................93 Bảng 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ oxi tới quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm .................................................................................................................................101 Bảng 3.20. Ảnh hưởng của tỷ lệ bi và sinh khối nấm men .....................................105 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối nấm men và dung dịch đệm ................106 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của thời gian nghiền bi tới khả năng thu hồi kẽm .............106 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của tỷ lệ sinh khối và dung dịch đệm ................................107 Bảng 3.24. Ảnh hưởng của thời gian phá mẫu tới khả năng thu hồi kẽm ..............108 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu quả tự phân ......................................108 Bảng 3.26. Ảnh hưởng của pH tới hiệu quả tự phân ..............................................109 Bảng 3.27. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình tự phân ....................................110 Bảng 3. 28. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình thủy phân. ...............................112 Bảng 3. 29. Kết quả sử dụng các phương pháp thu hồi dịch chiết nấm men ..........115 Bảng 3. 30. Ảnh hưởng của nồng độ than hoạt tính đến quá trình khử màu, mùi dịch chiết nấm men .........................................................................................................116 Bảng 3. 31. Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình khử màu, mùi dịch thủy phân .................................................................................................................................117 Bảng 3. 32. Ảnh hưởng của nồng độ maltodextrin quá trình sấy phun ..................119 Bảng 3. 33. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết tới hiệu xuất thu hồi và giá trị cảm quan của sản phẩm ..................................................................................................120 Bảng 3.34. Ảnh hưởng của nhiệt độ đầu vào tới hiệu quả sấy phun ......................121 Bảng 3.35. Phân tích chất lượng của bột nấm men giàu kẽm .................................122 Bảng 3. 36. Kết quả sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm ..........126 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới ................................................6 Hình 1.2. Hình ảnh tế bào nấm men S.cerevisiae ......................................................9 Hình 1.3. Sơ đồ vận chuyển kẽm trong tế bào nấm men .........................................14 Hình 2.1. Quy trình tách các phân đoạn của kẽm trong mẫu. ...................................40 Hình 3.1. Kết quả thống kê về khả năng tích lũy kẽm của các chủng nấm men ......61 Hình 3.2. Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm trong sinh khối nấm men 4087 ................62 Hình 3.3. Sắc ký đồ phân tích dạng kẽm trong sinh khối nấm men A112 ...............63 Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc và tế bào của 2 chủng nấm men tích kẽm cao ..........65 Hình 3. 5. Trình tự 26S rDNA của chủng A112 .......................................................69 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng A112 và một số loài họ hàng gần ...................69 Hình 3.7. Ảnh hưởng của glucose tới sự sinh trưởng của S. cerevisiae A112 .........71 Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự sinh trưởng của S.cerevisiae A112 ..........73 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tốc độ lắc tới sự sinh trưởng và phát triển của S.cerevisiae A112 ..........................................................................................................................74 Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nhân giống tới sự sinh trưởng và phát triển của S. cerevisiae A112 .....................................................................................................75 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ glucose tới hàm lượng kẽm tích lũy và khối lượng sinh khối khô của chủng nấm men S. cerevisiae A112 .............................................79 Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ yeast extract tới hàm lượng kẽm tích lũy và lượng sinh khối khô của chủng nấm men S. cerevisiae A112 .............................................81 Hình 3.13. Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ............................................................................................................................86 Hình 3.14. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung muối kẽm tới sự tích lũy kẽm trong sinh khối nấm men ....................................................................................................87 Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian lên men tới quá trình tích lũy kẽm trên chủng S. cerevisiae A112 .........................................................................................................92 Hình 3.16. Kết quả phân tích JMP về hàm lượng kẽm trong sinh khối và các hệ số hồi quy thu được từ thực nghiệm ..............................................................................94 Hình 3.17. Ảnh hưởng của hàm lượng glucose tới lượng sinh khối thu được..........95 Hình 3.18. Điều kiện tối ưu và hiệu suất dự kiến bởi phần mềm JMP .....................96 Hình 3.19. Động học của quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm theo phương pháp lên men gián đoạn.............................................................................................97 Hình 3.20. Ảnh hưởng của tốc độ bổ sung cơ chất đến quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm ....................................................................................................99 Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung cơ chất tới quá trình tạo sinh khối nấm men giàu kẽm ..........................................................................................................100 Hình 3.22. Động học của quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm bằng phương pháp lên men bổ sung cơ chất ....................................................................103 Hình 3.23. Hình ảnh tế bào S. cerevisiae trên kính hiển vi điện tử quét ................104 Hình 3.24. Ảnh hưởng bổ sung enzyme vào quá trình phá tế bào ..........................112 Hình 3.25. Quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm quy mô thực nghiệm .................................................................................................................................123 Hình 3.26. Hình ảnh sản phẩm viên nấm men giàu kẽm ........................................126 Hình 3.27. Nồng độ kẽm trong huyết thanh (A) và các mô (B) của chuột thí nghiệm sau khi uống ZnY, ZnSO4 liều 4 mg/kgP ................................................................127 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT Kí hiệu/ Tiếng Anh Tiếng Việt viết tắt AAS Atomic Absorption Spectrophotometric Quang phổ hấp thụ nguyên tử Abs Absorptance Độ hấp thụ ADN Deoxyribonucleic acid Axit đêôxyribônuclêic Association of Official Analytical Hiệp hội các nhà hoá phân tích AOAC Chemists CFU Colony Forming Units Đơn vị hình thành khuẩn lạc DO Dissolved Oxygen Oxi hòa tan Ethylen Diamin Tetraacetic Acid Axít Etylen Diamin Tetra Acetic Fructooligosaccharide Chất xơ hòa tan High Performance Liquid Sắc kí lỏng hiệu năng cao EDTA FOS HPLC Chromatography ICP-MS Inductively-Coupled Plasma - Mass Phương pháp phổ khối lượng Spectrometry plasma cảm ứng National Center for Biotechnology Trung tâm Thông tin Công nghệ Information sinh học Quốc gia (Hoa Kỳ) OD Optical density Mật độ quang PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi PCR SEM Scanning Electron Microscope Kính hiển vi điện tử quét NCBI TCVN ZnY Tiêu chuẩn Việt Nam Zinc yeast extract Dịch chiết nấm men kẽm MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của đề tài nghiên cứu Ngày nay, kinh tế xã hội ngày càng phát triển, đời sống nhân dân ngày càng được cải thiện thì vấn đề chăm sóc sức khỏe cộng đồng và nâng cao tầm vóc người Việt luôn được quan tâm sâu sắc. Tuy nhiên, tình trạng thiếu kẽm vẫn đang là vấn đề khá phổ biến trong cộng đồng. Theo ước tính có khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm, trẻ em dưới 5 tuổi là đối tượng có nguy cơ cao. Ở trẻ em, thiếu kẽm gây gia tăng nhiễm trùng và tiêu chảy làm khoảng 800.000 trẻ em thiệt mạng mỗi năm trên toàn cầu. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em Việt Nam khá cao: 2540% tùy địa phương, nhóm tuổi và khoảng 33% nam giới bị thiếu kẽm. Phụ nữ mang thai và cho con bú, người cao tuổi cũng nằm trong đối tượng có nguy cơ cao [81]. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh, dinh dưỡng có vai trò rất quan trọng cho sự phát triển chiều cao của trẻ. Trong các vi chất dinh dưỡng, kẽm là một vi khoáng được chứng minh có vai trò quan trọng đặc biệt đối với phát triển chiều cao, cơ bắp và miễn dịch của trẻ những năm đầu đời. Bởi lẽ, kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác nhau, đặc biệt có trong hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN, xúc tác phản ứng ôxy hóa cung cấp năng lượng [56]. Do đó, các hệ cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm. Chính vì vậy, việc bổ sung kẽm vào chế độ dinh dưỡng trong cộng đồng là hết sức cần thiết. Có thể bổ sung kẽm cho cơ thể dưới 2 dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Tuy nhiên, dạng kẽm hữu cơ được đánh giá có khả năng hấp thu tốt hơn kẽm vô cơ, vì dạng liên kết này làm giảm sự hình thành các hợp chất kẽm không tan trong đường tiêu hóa. Kẽm sunphat có vị đắng, gây ra một số phản ứng phụ cho người sử dụng. Đối với kẽm gluconat cơ thể hấp thu tốt hơn nhưng khả năng mang tải kẽm thấp và giá thành cao hơn. Có rất nhiều phương pháp để tạo ra các hợp chất của kẽm như: tổng hợp hóa học, chiết xuất từ tự nhiên, nhờ vi sinh vật… Tuy nhiên, phương pháp tổng hợp hóa học có hạn chế như: dễ sinh ra các sản phẩm phụ, khó kiểm soát, gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người. Phương pháp chiết xuất hợp chất kẽm từ tự nhiên an toàn hơn 1 nhưng chi phí sản xuất cao. Vì vậy, hiện nay trên thế giới đang tập trung nghiên cứu sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại (Zn, Cr, Se…) từ môi trường thành dạng hợp chất hữu cơ và tích lũy trong nấm men. Trong đó, kẽm được liên kết với các phân tử protein, axit amin, polysacarit... làm tăng khả năng hấp thu kẽm. Các nghiên cứu so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật đã chỉ ra rằng động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm huyết thanh và hàm lượng kẽm dự trữ trong xương, thịt, các cơ quan nội tạng cao hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ [171]. Nấm men từ lâu đã được xem là một trong các đối tượng nghiên cứu chính của ngành Công nghiệp thực phẩm. Trong đó, hướng nghiên cứu sử dụng chính sinh khối nấm men là một trong những hướng nghiên cứu tiềm năng. Bản thân sinh khối nấm men đã là một nguồn dinh dưỡng phong phú có đầy các yếu tố dinh dưỡng cơ bản, các nguyên tố vi lượng và nguồn vitamin dồi dào. Đồng thời, nhờ vào khả năng hấp thu và đồng hóa một số kim loại một như nguyên tố vi lượng kẽm để tạo ra dòng sản phẩm nấm men giàu kẽm, sẽ là nguồn thực phẩm chức năng có giá trị dinh dưỡng cao, đảm bảo vệ an toàn thực phẩm. Do đó, sản phẩm bột nấm men giàu kẽm sẽ là một sản phẩm tiềm năng phục vụ nhu cầu lớn từ thị trường, hỗ trợ chống suy dinh dưỡng cho trẻ em, nâng cao thể chất và sức đề kháng cho nhiều đối tượng người già, phụ nữ, nam giới, trẻ thành niên… Việc nghiên cứu khoa học để tạo ra quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm bột nấm men giàu kẽm có thành phần dinh dưỡng đa dạng, cân đối, đảm bảo vệ sinh an toàn làm nguyên liệu cho quá trình sản xuất thực phẩm chức năng là rất cần thiết. Những căn cứ và nhu cầu thực tiễn nêu trên là cơ sở để đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung” được thực hiện. Mục tiêu nghiên cứu  Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ làm nguyên liệu sản xuất thực phẩm bổ sung. Nội dung nghiên cứu  Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm cao từ tự nhiên và Sưu tập giống VSVCN – Viện Công nghiệp thực phẩm. 2  Nghiên cứu xác định các điều kiện thích hợp cho quá trình nhân giống chủng nấm men đã lựa chọn.  Nghiên cứu tối ưu hóa các điều kiện lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm.  Nghiên cứu nâng cao hiệu quả lên men bằng phương pháp lên men bổ sung môi trường.  Nghiên cứu công nghệ thu hồi tạo sản phẩm bột nấm men giàu kẽm. Phân tích đánh giá chất lượng sản phẩm.  Xây dựng quy trình công nghệ và triển khai sản xuất thử nghiệm bột nấm men giàu kẽm tại Viện CNTP. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài  Luận án đã tiến hành phân lập, khai thác và ứng dụng được nguồn vi sinh vật S.cerevisiae của Việt Nam để sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ.  Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất bột nấm men giàu kẽm hữu cơ, có ý nghĩa về khoa học và thực tiễn, để sản xuất thực phẩm bổ sung kẽm từ nấm men với chất lượng, giá thành thấp hơn nhiều so với các sản phẩm ngoại nhập.  Tạo được viên nấm men giàu kẽm hữu cơ đã góp phần làm phong phú thêm về số lượng, chủng loại các sản phẩm bổ sung vi chất dinh dưỡng cho người tiêu dùng góp phần vào công cuộc chăm sóc và nâng cao sức khỏe cộng đồng. Những đóng góp mới của luận án  Phân lập mới được chủng nấm men S. cerevisiae A112 có khả năng tích lũy kẽm hữu cơ cao.  Phân tích được tỉ lệ kẽm hữu cơ và một số dạng kẽm tồn tại trong sinh khối nấm men.  Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất bột nấm men giàu kẽm và triển khai sản xuất thử nghiệm tại Viện Công nghiệp thực phẩm. Đây là công trình đầu tiên của Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về sản xuất bột nấm men giàu kẽm, từ việc nghiên cứu điều kiện sinh trưởng, tối ưu hóa quá trình lên men tạo sinh khối nấm men giàu kẽm, đến việc thu hồi dịch chiết, tạo chế phẩm nấm men giàu kẽm dạng bột. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu nguyên tố vi lượng kẽm 1.1.1. Tầm quan trọng của nguyên tố vi lượng kẽm Nguyên tố vi lượng kẽm là một trong những yếu tố quan trọng đối với cơ thể con người. Kẽm tham gia vào thành phần cấu trúc tế bào, tác động đến hầu hết các quá trình sinh học trong cơ thể. Kẽm có trong thành phần của ít nhất 160 loại enzyme khác nhau như: hệ thống enzyme vận chuyển, thủy phân, đồng hóa, xúc tác phản ứng gắn kết các chuỗi trong phân tử ADN, xúc tác phản ứng ôxy hóa cung cấp năng lượng [56]. Ngoài ra, kẽm còn hoạt hóa nhiều enzyme như amylase, creatinase... Do vậy, kẽm có vai trò sinh học rất quan trọng, tác động chọn lọc lên quá trình tổng hợp, phân giải acid nucleic và protein - những thành phần quan trọng nhất của sự sống [81, 154]. Các cơ quan như hệ thần kinh trung ương, da và niêm mạc, hệ tiêu hóa, tuần hoàn rất nhạy cảm với sự thiếu hụt kẽm. Kẽm tham gia điều hòa chức năng của hệ thống nội tiết, có trong thành phần các hormon như hormon tuyến yên, tuyến thượng thận, tuyến sinh dục... [34]. Các công trình nghiên cứu cho thấy, kẽm có vai trò làm giảm độc tính của các kim loại nặng như: asen (As), cadimi (Cd)... Kẽm góp phần làm giảm quá trình lão hóa [35], tăng cường miễn dịch cho cơ thể [136]. Kẽm tham gia vào cơ chế đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, thiếu kẽm làm ảnh hưởng không tốt tới sự phát triển và chức năng của hầu hết các tế bào miễn dịch: tế bào lympho T, B và đại thực bào [98, 138]. Kẽm có chức năng bảo vệ tế bào, ức chế con đường chính dẫn tới quá trình apoptosis. Kẽm trực tiếp điều hòa apoptosis thông qua việc suy giảm kẽm nội bào. Đây là quá trình liên quan mật thiết tới cơ chế gây ung thư [152]. Kẽm không chỉ quan trọng trong hoạt động sống với vai trò độc lập mà còn tham gia vào quá trình hấp thu và chuyển hóa các nguyên tố vi lượng khác như đồng (Cu), mangan (Mn), magnesium (Mg)... Do vậy, khi cơ thể thiếu kẽm sẽ gây rối loạn chuyển hóa của nhiều yếu tố, ảnh hưởng rất lớn đến tình trạng sức khỏe như mất cân bằng lượng đường trong máu, tỷ lệ trao đổi chất chậm, quá trình phân chia tế bào và tổng hợp ADN cũng sẽ bị thay đổi. Khi thiếu kẽm, trẻ thường biếng ăn, rối loạn giấc ngủ, hay bị mắc các bệnh nhiễm 4 trùng đường hô hấp và tiêu hoá, chậm phát triển chiều cao, tóc rụng, xơ xác, trên móng tay có các vệt trắng, móng tay giòn dễ gãy… 1.1.2. Nhu cầu kẽm của cơ thể Ở người trưởng thành, cơ thể chứa khoảng 2g kẽm, được phân bố ở xương và các cơ quan nội tạng, 20% kẽm nằm ở da và tóc [21]. Kẽm được dung nạp vào cơ thể con người chủ yếu qua đường tiêu hoá. Phần lớn kẽm được hấp thụ ở ruột non, chủ yếu tại tá và hỗng tràng, một ít tại hồi tràng [26]. Axit dạ dày giúp tăng cường khả năng hấp thu kẽm trong hệ tiêu hoá. Trong điều kiện chuẩn, nồng độ kẽm tối đa đạt được sau 2-3 giờ bổ sung kẽm [146]. Với các vai trò quan trọng như vậy thì con người cần phải bổ sung một lượng kẽm nhất định hàng ngày. Đối với trẻ em, kẽm cần thiết cho sự phát triển, đối với người trưởng thành, kẽm đảm bảo cho quá trình duy trì sức khỏe hàng ngày. Tuy nhiên, với mỗi đối tượng khác nhau tùy vào độ tuổi và trạng thái sinh lý thì nhu cầu kẽm hàng ngày hoàn toàn khác nhau. Nhu cầu kẽm lớn nhất ở phụ nữ mang thai và cho con bú. Ở trẻ dưới 1 tuổi cần khoảng 2,8 - 3,4 mg/ngày, trẻ 1 - 15 tuổi cần khoảng 2,5 - 8,5 mg/ngày, thanh thiếu niên và người trưởng thành khoảng 11,2 - 13,5 mg/ngày đối với nam và 10,1 - 12,1 mg/ngày đối với nữ, phụ nữ mang thai và cho con bú cần từ 12,6 - 16,4 mg/ngày [133]. Thiếu vi chất dinh dưỡng có ảnh hưởng không tốt đến sự tăng trưởng và phát triển. Chính vì vậy, việc bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng như kẽm, canxi, sắt là một giải pháp để hỗ trợ tăng cường phát triển chiều cao ở trẻ em. Có rất nhiều phương pháp bổ sung kẽm và các vi chất khác như: đa dạng hóa khẩu phần dinh dưỡng, bổ sung vi chất dinh dưỡng… Quan điểm phòng chống thiếu vi chất dinh dưỡng hiện nay là kết hợp đồng thời giữa các giải pháp. Do vậy, khi bổ sung kẽm không nên bổ sung kẽm đơn mà cần kết hợp cùng với các chất dinh dưỡng khác như: Ca, Mg, vitamin A, B, C, D… nhằm phát huy tốt nhất tác động của kẽm, tránh tình trạng thiếu đa chất kết hợp. 1.1.3. Tình hình thiếu kẽm trên thế giới và Việt Nam Trong những năm gần đây, tình trạng thiếu kẽm ở trẻ em là vấn đề sức khỏe cộng đồng đang được quan tâm ở nhiều nước. Đặc biệt là các nước đang phát triển 5 với khoảng 2 tỉ người bị thiếu kẽm [126]. Theo ước tính có khoảng 30% dân số thế giới bị thiếu kẽm, trẻ em dưới 5 tuổi là đối tượng có nguy cơ cao. Ở trẻ em, thiếu kẽm gây gia tăng nhiễm trùng và tiêu chảy làm 1,5 triệu trẻ em chết mỗi năm vì tiêu chảy, 800.000 người trong đó có 450.000 trẻ em có nguy cơ tử vong mỗi năm do thiếu kẽm (hình 1.1) [79, 81]. Hình 1.1. Tình trạng thiếu kẽm hiện nay trên thế giới [79, 81] Tại Việt Nam, theo đánh giá thì tỷ lệ thiếu kẽm ở trẻ em tại cộng đồng dựa vào nồng độ kẽm huyết thanh thấp (< 10,7 μmol/l) dao động trong khoảng 25 – 40 % tùy theo địa phương và nhóm tuổi nghiên cứu. Điều tra về tình hình thiếu vi chất năm 2010 trên 586 trẻ từ 6 đến 75 tháng tuổi cho thấy tỷ lệ thiếu kẽm là 51,9 %. Nhóm trẻ nhỏ nhất (6 - 17 tháng) có nguy cơ bị thiếu kẽm cao nhất khi so sánh với các nhóm tuổi khác. Kết quả điều tra ở học sinh từ 11-17 tuổi tại Hà Nam cho thấy, có khoảng 26,5% trẻ có mức kẽm huyết thanh thấp. Đặc biệt, ở trẻ em bị suy dinh dưỡng và tiêu chảy kéo dài vào viện tại Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệ thiếu kẽm huyết thanh còn rất cao, vào khoảng 50% - 90% tùy theo mức độ [4]. Việt Nam có dân số hơn 90 triệu người, ước tính trong số đó có khoảng 7,1 triệu trẻ em ở độ tuổi dưới 5 tuổi. Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Viện Dinh dưỡng Quốc gia năm 2013, chế độ ăn điển hình của trẻ sơ sinh, trẻ nhỏ không cung cấp đủ năng 6 lượng, chất dinh dưỡng và vi chất dinh dưỡng để trẻ có thể tăng trưởng và phát triển tối ưu [13]. 1.1.4. Những dạng hợp chất phổ biến của kẽm và sự hấp thu vào cơ thể Kẽm thường được bổ sung vào cơ thể dưới 2 dạng hữu cơ và vô cơ. Ở dạng hữu cơ, kẽm được gắn kết với các phân tử hữu cơ như protein, vitamin, axit amin, polisaccharit hay các hợp chất hữu cơ khác… Ở dạng vô cơ, kẽm được gắn kết với các thành phần vô cơ, phổ biến nhất là muối kẽm sulphat, kẽm nitơrat, kẽm oxit… Đã có rất nhiều nghiên cứu đánh giá, so sánh khả năng hấp thu và chuyển hóa giữa 2 dạng kẽm vô cơ và kẽm hữu cơ trên động vật [36, 85, 162]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, động vật được bổ sung kẽm ở dạng hữu cơ có nồng độ kẽm nội tạng cao hơn khi được bổ sung kẽm ở dạng vô cơ. Zhang và cộng sự (2014) đã nghiên cứu so sánh dược động học và hoạt tính sinh học của nấm men giàu kẽm, kẽm sulphate (ZnSO4) khi cho chuột hấp thụ với cùng một lượng kẽm là 4mg Zn/kgP. Kết quả cho thấy, nồng độ Zn trong huyết thanh chuột khi sử dụng nấm men giàu kẽm đạt nồng độ là 3,87 µg/ml, trong khi đó ZnSO4 là 2,81 µg/ml. Đồng thời, khi so sánh hoạt tính sinh học giữa 2 hợp chất này thì nấm men giàu kẽm đạt 138,4%. Hoạt tính sinh học của nấm men giàu kẽm cao hơn rất nhiều so với kẽm sulphate [171]. Các nghiên cứu khác cũng cho rằng, hợp chất kẽm hữu cơ nói chung được đánh giá là có hoạt tính sinh học cao hơn kẽm vô cơ [19, 28, 117]. Chính vì vậy, các hướng nghiên cứu tạo hợp chất kẽm hữu cơ đang được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để cho ra thị trường dòng sản phẩm bổ sung nguyên tố vi lượng kẽm dễ hấp thu, có chất lượng cao. Một trong các hướng nghiên cứu đó là sử dụng nấm men là đối tượng nghiên cứu nhằm chuyển hóa ion kim loại (Zn, Cr, Se…) từ môi trường thành dạng hợp chất kim loại hữu cơ và tích lũy trong nấm men [84, 108, 130, 142, 145]. Không phải tất cả các nguyên tố kim loại được tích lũy trong nấm men đều ở dạng hữu cơ mà chỉ có con đường chuyển hóa sinh học thông qua kích thích hình thành liên kết ion kim loại với các loại protein, polysacarit trong tế bào nấm men mới ở dạng hữu cơ [108]. Do đó, việc tiến hành sàng lọc để 7 chọn ra các chủng nấm men có khả năng tích lũy kẽm hữu cơ với hàm lượng cao là hết sức cần thiết. Trước nhu cầu cấp thiết của việc bổ sung nguyên tố vi lượng kẽm cho cơ thể, hiện trên thị trường đã có rất nhiều dòng sản phẩm chức năng giàu kẽm nhằm phục vụ thị hiếu người tiêu dùng có bản chất là kẽm vô cơ, hữu cơ. Dưới đây là một số dạng kẽm được sử dụng để bổ sung kẽm vào cơ thể: Chelated zinc: là một dạng kết hợp của kẽm với axit amin hay vitamin. Dạng tồn tại này không đơn thuần là sự kết hợp giữa phân tử ion kim loại với phân tử hữu cơ mà là khả năng phân tử hữu cơ mang điện tích phù hợp, thu hút tích cực các khoáng chất. Nói cách khác, mỗi phân tử hữu cơ có thể mang nhiều phân tử kim loại, điều này giúp cho việc hấp thu các khoáng chất đạt hiệu quả hơn [18]. Dạng hợp chất này có ưu điểm nổi trội như: dễ hòa tan trong nước, không độc hại và bị biến tính trong môi trường axit dạ dày, không ảnh hưởng đến môi trường axit dạ dày và chịu được tác động bởi nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Các dạng chelated của kẽm có thể kể đến như kẽm picolinate (dạng hợp chất của kẽm với axit amin picolinic), kẽm orotate (dạng kết hợp với axit orotic hay vitamin B3). Kẽm orotate là một trong các dạng trung hòa so với các hợp chất khác của kẽm. Điều này cho phép chúng có thể hấp thụ dễ dàng qua màng tế bào, làm tăng nồng độ kẽm trong tế bào. Kẽm orotic có khả năng chống oxi hóa, bảo vệ cơ thể, là một trong các dạng kẽm dễ hấp thu nhất. Kẽm gluconate: là dạng hợp chất kẽm phổ biến trong chế độ ăn uống được tạo ra bởi quá trình sản xuất công nghiệp, thực chất là quá trình lên men glucose. Tuy nhiên, dạng tồn tại này cho khả năng mang tải kẽm và sinh khả dụng trong cơ thể thấp [172]. Kẽm acetate: là một dạng hợp chất hóa học của kẽm có khả năng hấp thu tốt hơn dạng kẽm gluconate. Kẽm oxide: là dạng hợp chất kẽm vô cơ được sử dụng phổ biến trong thuốc bôi ngoài da, sử dụng trong trường hợp da bị bỏng nhẹ hay kích ứng. Đây cũng là một thành phần phổ biến trong kem chống nắng. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều về khả năng hấp thụ của kẽm oxit trong cơ thể. 8 Kẽm sulfat: là dạng hợp chất kẽm vô cơ tan trong nước. Các nghiên cứu cho kết quả khác nhau về khả năng hấp thụ và chuyển hóa hợp chất kẽm này của cơ thể [59, 171, 172]. 1.2. Đặc tính ưu việt của nấm men trong sản xuất công nghiệp Nấm men là nhóm nấm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn. Vào năm 1939, Meyen đã phát hiện ra một số loài nấm men có khả năng lên men rượu, bia và đặt tên là chủng nấm men Saccharomyces. Đây là chủng có bào tử túi, thường có 1 – 4 bào tử, có khi đến 8 bào tử. Tế bào nấm men có dạng hình cầu, dài, elip... không có khuẩn ty, không tạo bào tử bắn, không tạo váng, khuẩn lạc có dạng bột nhão, hơi bóng. So với các vi sinh vật khác (như vi khuẩn) nấm men có kích thước tương đối lớn. Một số nấm men được sử dụng trong công nghệ thực phẩm thường có kích thước khoảng 3 ÷ 5 × 5 ÷ 10µm. Kích thước này thay đổi nhiều tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường sống. Nảy chồi là cách sinh sản vô tính điển hình của nấm men [1]. Tế bào nấm men trong tự nhiên có thể đứng riêng lẻ hoặc sau khi nảy chồi vẫn dính vào nhau tạo thành chuỗi (hình 1.2). S.cerevisiae thuộc nhóm sinh vật ưa ấm (mesophile), sinh trưởng tốt ở điều kiện nhiệt độ từ 25-35oC. Chủng sinh trưởng hiếu khí tùy tiện, trong điều kiện môi trường giàu oxi, nấm men sinh trưởng phát triển tốt, ưu tiên tạo sinh khối, trong điều kiện thiếu oxi, nấm men chuyển hóa đường thành rượu. Nấm men S. cerevisiae có khả năng sinh trưởng tốt trong môi trường axit yếu, pH từ 4-5,5. Hình 1.2. Hình ảnh tế bào nấm men S.cerevisiae [177] 9 Phần lớn nấm men được sử dụng trong công nghiệp thuộc giống Saccharomyces, trong lớp nấm túi và vài giống thuộc lớp nấm bất toàn. Trong đó, loài Saccharomyces cerevisiae được dùng nhiều trong công nghiệp thực phẩm. Một số chủng của nấm men này dùng làm men nở bánh mì, một số khác dùng trong công nghiệp rượu, bia, rượu vang, sản xuất glyxerol hoặc enzyme invertase. Hiện nay, nhiều nước trên thế giới đã sản xuất thu nhận sinh khối nấm men sử dụng phổ biến trong chăn nuôi hoặc tách chiết tinh sạch protein dùng trong dinh dưỡng cho người làm thức ăn nhân tạo, bổ sung vào các nguồn chế biến thực phẩm [8-10, 160]. * Đặc điểm sinh khối nấm men: Sinh khối của nấm men rất giàu protein, lipid, các vitamin và khoáng chất. Theo khảo sát của các nhà nghiên cứu trên thế giới thì tỷ lệ protein của nấm men khô vào khoảng 44 - 45%, glucid 25 - 35%, lipid chiếm khoảng 1,5 - 5%, các chất chiết xuất vô đạm khoảng 22 - 40%, các chất khoáng khoảng 6 - 12%. Điều này chứng tỏ rằng, giá trị dinh dưỡng của nấm men rất lớn. Đặc biệt là hàm lượng acid amin, vitamin nhóm B trong nấm men rất cao, dễ tiêu hóa và hấp thụ. Đây là một lợi thế để sử dụng chúng như một nguồn thực phẩm bổ sung dinh dưỡng [6, 10]. Bảng 1.1. Thành phần axit amin, khoáng chất và vitamin của nấm men [7] Hàm lượng Thành Khoáng Thành phần (%) chất phần (%) Leucin 3,80 Cacbon 49,8 D2 (calciferol) 250 Tryptophan 0,68 CaO 12,4 B6 (Pyridoxyn) 60 Alanin 5,78 Nitơ 6,7 B1 (thiamin) 40 Acid glutamic 6,74 Hydro 3,54 B9 (acid folic) 4,2 Phenylalanin 2,01 P2O5 2,34 B2 (riboflavin) 50 Glycin 2,20 K2 O 0,04 H (biotin) 2,0 Arginin 2,33 SO3 0,42 B5 (nicotinic) 21 Valin 3,30 MgO 0,38 Tyrosin 2,77 Fe2O3 0,035 Lysin 3,11 SiO 0,09 Acid amin 10 Vitamin (mg/kg)