Tài liệu Tạo dòng hoa huệ (polianthes tuberosa l.) đột biến bằng tia gamma (60co) trong điều kiện in vitro

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo- ĐÀO THỊ TUYẾT THANH TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60CO) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62 42 02 01 Cần Thơ - 2018 TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU & PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -oOo- ĐÀO THỊ TUYẾT THANH TẠO DÕNG HOA HUỆ (Polianthes tuberosa L.) ĐỘT BIẾN BẰNG TIA GAMMA (60CO) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Mã ngành: 62 42 02 01 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN PGS. TS. Nguyễn Bảo Toàn Cần Thơ - 2018 Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC Luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” do nghiên cứu sinh Đào Thị Tuyết Thanh thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Bảo Toàn. Tác giả luận án Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn thầy, PGS.TS. Nguyễn Bảo Toàn, đã tận tình hƣớng dẫn khoa học, tƣ vấn thiết kế các thí nghiệm, hƣớng dẫn cách tiếp cận các kiến thức khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu, từ đó giúp tôi hoàn thành luận án nghiên cứu sinh. Xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh Đạo Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học, Trại Nghiên cứu & Thực nghiệm Nông nghiệp thuộc Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Khoa Sau Đại Học đã tạo điều kiện thuận lợi trong thực hiện các thủ tục, hỗ trợ hóa chất và trang thiết bị cho các nghiên cứu của Luận án. Chân thành cảm ơn quý thầy cô, các anh chị, các bạn đồng nghiệp thuộc Viện Nghiên cứu & Phát triển Công nghệ Sinh học và Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Xin chân thành cảm ơn chú Nguyễn Thƣợng Hiền đã hỗ trợ nguồn giống hoa huệ. Đồng thời, tôi cũng chân thành gửi lời cảm ơn đến các em học viên cao học đã cộng tác trong suốt thời gian thực hiện luận án. Xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám đốc Trung Tâm Dạy nghề & Hỗ trợ Nông dân tỉnh Tiền Giang, các anh chị em đồng nghiệp đã hỗ trợ trong công tác để tôi có thời gian hoàn thành đƣợc khóa học. Sau cùng tôi xin đƣợc cảm ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Đào Thị Tuyết Thanh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nghiên cứu “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” đƣợc thực hiện nhằm (1) xác định đƣợc môi trƣờng nuôi cấy để tạo vật liệu cho các thí nghiệm; (2) xác định đƣợc hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên mô sẹo và cụm chồi hoa huệ thông qua liều gây chết LD50; (3) xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây giai đoạn thuần dƣỡng; (4) chọn đƣợc một đến hai giống hoa huệ tăng về số lƣợng cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống. Nghiên cứu bao gồm tạo nguồn vật liệu cho thí nghiệm trên hai giống/dòng hoa huệ đơn và hoa huệ kép; xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) ở các liều khác nhau; xác định giá trị tổn thƣơng LD50; đánh giá sự sinh trƣởng của mô sẹo và cụm chồi in vitro; thuần dƣỡng và đánh giá sự thay đổi về mặt hình thái lá và hoa rồi chọn ra ít nhất hai dòng có kiểu hình trội. Kết quả thí nghiệm cho thấy môi trƣờng cơ bản bổ sung 1,0 mg/l NAA và 4,0 mg/l BA thích hợp cho tạo mô sẹo và cụm chồi cho xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co). Liều gây chết LD50 của các giống/dòng hoa huệ đơn khi xử lý tia gamma (60Co) khoảng 10-15 Gy (giá trị tính là 10,96 ± 2,96 Gy) trong khi LD50 của các giống/dòng hoa huệ kép khoảng 20-25 Gy (giá trị tính là 22,91 ± 4,01 Gy). Theo dõi sự sinh trƣởng chồi in vitro, khi xử lý liều chiếu xạ càng cao thì số chồi, chiều cao chồi và số lá càng giảm ở cả hai giống và các dòng hoa huệ. Giai đoạn này ghi nhận đƣợc các dạng bất thƣờng về hình thái ở lá và chồi. Giai đoạn thuần dƣỡng, các cây còn nhỏ, sự khác biệt về hình thái lá và chồi không nhận thấy rõ ràng. Ở giai đoạn ngoài đồng, các chỉ tiêu sinh trƣởng đều bị ảnh hƣởng bởi các liều chiếu xạ ở các dòng hoa huệ. Có sự xuất hiện các dạng bất thƣờng về hình thái lá, thân và số cánh hoa. Đặc biệt, trên cùng một phát hoa huệ đơn có sự gia tăng số lƣợng cánh hoa lên 7 và 8 cánh (thay vì hoa có 6 cánh). Hầu hết các dòng hoa huệ đơn đƣợc xử lý tia gamma (60Co) đều có mùi thơm, trừ dòng hoa huệ với liều xử lý 5 Gy với đặc điểm hoa không nở hoàn toàn. Ở hoa huệ kép chọn đƣợc 2 dòng đột biến tiềm năng nhất về đặc điểm hoa to và có mùi thơm với 22 và 36 cánh. Từ khóa: cánh hoa, chiếu xạ, đột biến, hoa huệ, in vitro, LD50, gamma. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ ABSTRACT The study on "Inducing of mutation tuberose (Polianthes tuberosa L.) lines by irradiating with 60Co gamma rays in vitro" was carried out (1) to determine culture medium to create materials for experiments on two tuberoses, single petals and double petals; (2) to determine the effects of different irradiated doses on calli and shoot clumps of tuberose through LD50; (3) to determine morphological diversities at acclimatization stage; (4) to select two new tuberose lines having bigger flower size, larger number of petals and aromatic odour. The obtained results included producing materials for experiments on two tuberose cultivars; treating irradiation of 60Co gamma rays at different doses and determining LD50values; evaluating the growth of calli and shoot clumps in vitro; acclimatizing and evaluating changes on morphologies and petals, and selecting, at least, two lines with better phenotypes. The implemented experiments showed that the base medium supplemented with 1.0 mg/l NAA and 4.0 mg/l BA was very suitable for inducing calli and shoot clumps as experimental materials. The LD50 value of single petal tuberose variety was obtained about 10-15 Gy (the counting value was 10.96±2.96 Gy), whereas that of double petal oneabout 20-25 Gy (the counting value was 22.91±4.01 Gy). At the in vitro stage, the higher radiation doses were, the lower number of shoot got, shoot height and the number of leaves were the same as in all varieties/lines. There were also appearances of the abnormal structures or disappearance of the chlorophyll in leaves. At the acclimatization stage, the lethal rates of plantlets were significantly different from each other for the irradiation doses, and the variations of leaves and shoots were not clearly recognized. At the field stage, the growth parameters such as the number and diameter of bulbs, the height of inflorescences, the number of flowers and the days to flowering in all varieties/lines were affected by irradiated doses. There were appearances of variability of leaves, trunks and petal number. In single petal tuberose, there was an increase of petal number (up to 7 or 8) in each inflorescence. Almost single petal tuberose cultivars irradiated with 60Co gamma were fragrant lines, except for the tuberose lines irradiated at 5 Gy. In double petal tuberoses, among the variations of phenotypes were the two fragrant mutant lines with 22 and 36 petals, having the most potential ability for production. Key words: gamma, in vitro, irradiation, LD50, mutation, petal, tuberose. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự do – Hạnh phúc CAM KẾT KẾT QUẢ Tôi xin cam kết luận án “Tạo dòng hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro” này đƣợc hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Bảo Toàn. Các kết quả của công trình nghiên cứu này chƣa đƣợc dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác. Tác giả luận án Đào Thị Tuyết Thanh Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC Trang TRANG XÁC NHẬN CỦA NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC.................. i LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... ii TÓM TẮT ......................................................................................................... iii ABSTRACT...................................................................................................... iv CAM KẾT KẾT QUẢ ....................................................................................... v MỤC LỤC ........................................................................................................ vi DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................... xii DANH SÁCH HÌNH ...................................................................................... xiv DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ xvi CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU................................................................................. 1 1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1 1.2 Mục tiêu ....................................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu chính .......................................................................................... 2 1.2.2 Mục tiêu cụ thể ......................................................................................... 2 1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ............................................................... 2 1.3.1 Đối tƣợng nghiên cứu ............................................................................... 2 1.3.2 Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 2 1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài ..................................................... 2 1.4.1 Ý nghĩa khoa học ...................................................................................... 2 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn....................................................................................... 3 1.5. Điểm mới của luận án ................................................................................. 3 CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................. 5 2.1 Giới thiệu về cây hoa huệ ............................................................................ 5 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại thực vật cây hoa huệ .......................................... 5 2.1.2 Đặc điểm thực vật cây hoa huệ ................................................................. 5 2.1.3 Tình hình sản xuất hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam .......................... 7 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.1.3.1 Trên thế giới ........................................................................................... 7 2.1.3.2 Ở Việt Nam ............................................................................................ 7 2.1.4 Tầm quan trọng và mục đích sử dụng hoa huệ ......................................... 8 2.1.5 Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển .......................................................... 9 2.1.6 Một số yếu tố môi trƣờng ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây ............................................................................................................... 9 2.1.6.1 Nhiệt độ.................................................................................................. 9 2.1.6.2 Độ sâu khi trồng................................................................................... 10 2.1.6.3 Các chất dinh dƣỡng ............................................................................ 10 2.2 Kỹ thuật trồng và chăm sóc cây hoa huệ ................................................... 11 2.2.1 Chuẩn bị giống ........................................................................................ 11 2.2.2 Chuẩn bị đất ............................................................................................ 12 2.2.3 Chăm sóc................................................................................................. 12 2.2.4 Sâu bệnh trên cây hoa huệ ...................................................................... 12 2.3 Kỹ thuật nuôi cấy in vitro trong chọn tạo giống cây trồng đột biến .......... 13 2.3.1 Các giai đoạn của nuôi cấy thực vật in vitro .......................................... 13 2.3.2 Các loại mẫu cấy trong nuôi cấy in vitro ở cây hoa huệ......................... 13 2.3.3 Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (meristem culture) ......................... 14 2.3.4 Môi trƣờng nuôi cấy thực vật in vitro ..................................................... 15 2.3.4.1 Dinh dƣỡng khoáng và vitamin trong nuôi cấy thực vật in vitro ........ 15 2.3.4.2 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật trong nuôi cấy thực vật in vitro .......................................................................................................................... 16 2.3.4.3 Các chất bổ sung khác trong nuôi cấy thực vật in vitro....................... 17 2.3.5 Sự hình thành mô sẹo và chồi (cụm chồi) trong nuôi cấy thực vật in vitro .......................................................................................................................... 17 2.3.5.1 Sự hình thành mô sẹo trong nuôi cấy in vitro ...................................... 17 2.3.5.2 Sự hình thành chồi trong nuôi cấy in vitro .......................................... 18 2.4 Phƣơng pháp xử lý đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ trong chọn tạo giống cây trồng .......................................................................................................... 19 2.4.1 Sơ lƣợc về đột biến bằng kỹ thuật chiếu xạ ............................................ 19 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.4.2 Đặc điểm của tia phóng xạ gamma ......................................................... 19 2.4.2.1 Cơ chế tạo đột biến của tia gamma (60Co) ........................................... 19 2.4.2.2 Hiệu quả của tia gamma trong chọn giống cây trồng .......................... 20 2.4.2.3 Liều chiếu xạ ........................................................................................ 20 2.4.2.4 Liều gây chết LD50 ............................................................................... 21 2.4.2.5 Tần số đột biến in vitro ........................................................................ 21 2.4.3 Ý nghĩa của phƣơng pháp chọn giống đột biến ...................................... 22 2.4.4 Tình hình tạo giống ở hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam ................... 22 2.4.4.1 Trên thế giới ......................................................................................... 22 2.4.4.2 Ở Việt Nam .......................................................................................... 23 2.5 Sự kết hợp của chọn giống đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và chiếu xạ tia gamma .......................................................................................... 23 2.5.1 Nguồn vật liệu để tạo đột biến in vitro ................................................... 23 2.5.2 Ƣu điểm và khuyết điểm của phƣơng pháp chọn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma ........................................ 23 2.5.3 Một số kết quả nghiên cứu về sử dụng phƣơng pháp nuôi cấy thực vật in vitro và xử lý đột biến bằng tia gamma ở các loại cây trồng........................... 24 2.5.4 Một số nghiên cứu về xử lý đột biến bằng nuôi cấy thực vật in vitro và chiếu xạ tia gamma ở cây hoa huệ trên thế giới và ở Việt Nam ...................... 25 2.6 Ứng dụng chỉ thị di truyền để chọn lọc dòng đột biến trong chọn giống cây trồng và hoa huệ bằng xử lý tác nhân vật lý .................................................... 25 2.6.1 Phản ứng chuỗi trùng hợp ....................................................................... 26 2.6.2 Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa (Inter Simple Sequence RepeatISSR) ................................................................................................................ 26 2.6.3 Một số nghiên cứu về sử dụng PCR-ISSR trong chọn giống cây trồng bằng xử lý đột biến .......................................................................................... 27 2.6.4 Một số nghiên cứu ở cây hoa huệ sử dụng phƣơng pháp PCR-ISSR ..... 27 2.6.5 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên gen ITS (Internal Transcribed Spacer) ............................................................................................................. 28 2.7 Địa lý và điều kiện tự nhiên ở một số tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long... 29 2.7.1 Tiền Giang .............................................................................................. 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học viii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 2.7.2 Cần Thơ .................................................................................................. 30 2.7.3 An Giang ................................................................................................. 30 CHƢƠNG 3 PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 31 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu ............................................................................. 31 3.1.1 Thời gian và địa điểm ............................................................................. 31 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm ................................................................................. 31 3.1.3 Trang thiết bị và hóa chất ....................................................................... 32 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................... 33 3.2.1 Nội dung 1: Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro .............................................................................................. 34 3.2.1.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng cây hoa huệ ............................................... 34 3.2.1.2 Tạo mô sẹo và cụm chồi hoa huệ cho xử lý chiếu xạ .......................... 35 3.2.2 Nội dung 2: Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro........................... 36 3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia (60Co) gamma đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn .................... 37 3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép......................... 38 3.2.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh ............................. 39 3.2.3 Nội dung 3: Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dƣỡng trong nhà lƣới ............................................................................. 39 3.2.4 Nội dung 4: Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống ...................................... 40 3.2.4.1 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ đơn sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng ............................. 40 3.2.4.2 Thí nghiệm 4: Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của giống/dòng hoa huệ kép sau khi xử lý tia gamma (60Co) ở ngoài đồng ............................. 42 3.2.4.3 Đánh giá đa dạng ADN ở giống/dòng hoa huệ đột biến...................... 43 3.3 Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 45 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 47 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ix Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.1 Tạo vật liệu cho xử lý chiếu xạ bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro .................................................................................................................. 47 4.1.1 Tỷ lệ sống khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng (ĐST) hai giống hoa huệ ...... 47 4.1.2 Nhân cụm mô sẹo (callus) và cụm chồi .................................................. 47 4.2 Xác định hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) trên hai giống/dòng hoa huệ bằng liều gây chết 50% (LD50) in vitro .............................................. 48 4.2.1 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn ....................................................... 48 4.2.1.1 Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo giống/dòng hoa huệ đơn ................. 48 4.2.1.2 Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn .............. 49 4.2.1.3 Liều gây chết LD50 của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn. 50 4.2.1.4 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ đơn ................ 52 4.2.1.5 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn ................................................................... 53 4.2.2 Hiệu quả của liều lƣợng tia gamma (60Co) đến sự sinh trƣởng và phát triển của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép .................................................... 54 4.2.2.1 Tỷ lệ chết của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép ............................ 54 4.2.2.2 Liều gây chết LD50 của cụm chồi ở giống/dòng hoa huệ kép ............. 55 4.2.2.3 Số chồi, chiều cao chồi và số lá ở giống/dòng hoa huệ kép ................ 57 4.2.2.4 Tác động của các liều chiếu xạ tia gamma (60Co) trên các cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ kép ................................................................... 59 4.2.3 Nhân chồi và tạo rễ thành cây hoa huệ hoàn chỉnh ................................ 61 4.3 Xác định sự đa dạng về mặt hình thái của cây con giai đoạn thuần dƣỡng trong nhà lƣới ................................................................................................... 62 4.3.1 Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ đơn giai đoạn thuần dƣỡng ...... 62 4.3.2 Tỷ lệ chết của các giống/dòng huệ kép giai đoạn thuần dƣỡng.............. 63 4.3.3 Các dạng bất thƣờng về kiểu hình của các giống/dòng hoa huệ đơn và kép giai đoạn thuần dƣỡng ............................................................................... 64 4.4 Chọn các dòng hoa huệ tăng về số cánh hoa, kích thƣớc hoa và hoa có mùi thơm theo phƣơng pháp truyền thống .............................................................. 64 4.4.1 Trồng lần 1 (M1)..................................................................................... 64 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học x Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ 4.4.1.1 Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở giống/dòng hoa huệ đơn ......... 64 4.4.1.2 Các đặc điểm sinh trƣởng và ra hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép ... 75 4.4.2 Trồng lần 2 (M2)..................................................................................... 90 4.4.3 Đánh giá đa dạng di truyền các giống/dòng hoa huệ bất thƣờng chọn đƣợc ................................................................................................................. 92 4.4.3.1 Đánh giá sự đa dạng di truyền bằng phƣơng pháp đánh dấu phân tử ISSR-PCR ........................................................................................................ 92 4.4.3.2 Giải trình tự vùng ITS các giống/dòng hoa huệ .................................. 96 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................... 101 5.1 Kết luận .................................................................................................... 101 5.2 Đề nghị ..................................................................................................... 103 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN...................................................................................................... 104 LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ........................................................................... 105 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 106 PHỤ LỤC BẢNG .......................................................................................... 131 PHỤ LỤC HÌNH ........................................................................................... 140 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1: Một số nghiên cứu về liều gây chết LD50 khi xử lý chiếu xạ ở các loại cây trồng ................................................................................................... 21 Bảng 3.1: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ đơn ........ 37 Bảng 3.2: Bố trí các liều chiếu xạ và nghiệm thức ở giống hoa huệ kép ........ 39 Bảng 3.3: Danh sách các mồi ISSR sử dụng đánh giá đa dạng ADN các giống/dòng huệ ................................................................................................ 44 Bảng 4.1: Tỷ lệ sống của đỉnh sinh trƣởng ở hai giống hoa huệ đơn và hoa huệ kép ở 30 ngày sau khi cấy ................................................................................ 47 Bảng 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở cụm mô sẹo ở giống/dòng hoa huệ đơn ......... 49 Bảng 4.3: Tỷ lệ chết của cụm mô sẹo/chồi ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy ................................................................................................... 50 Bảng 4.4: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều chiếu xạ ............................................................................................................ 51 Bảng 4.5: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ đơn đã xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy ..................................................... 52 Bảng 4.6: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ đơn đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy ........................................... 53 Bảng 4.7: Tỷ lệ chết của giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy ...... 55 Bảng 4.8: Bảng chuyển đổi tỷ lệ chết ở giống/dòng hoa huệ kép ở các liều chiếu xạ ............................................................................................................ 56 Bảng 4.9: Số chồi, chiều cao chồi và số lá của giống/dòng hoa huệ kép đã xử lý tia gamma (60Co) sau 150 ngày nuôi cấy ..................................................... 59 Bảng 4.10: Phần trăm xuất hiện cấu trúc bất thƣờng ở giống/dòng hoa huệ kép đã xử lý tia gamma (60Co) sau 100 ngày nuôi cấy ........................................... 60 Bảng 4.11: Tỷ lệ chết của cây sau 30 ngày thuần dƣỡng ở giống/dòng huệ đơn .......................................................................................................................... 63 Bảng 4.12: Tỷ lệ chết của cây sau 30 ngày thuần dƣỡng ở giống/dòng huệ kép .......................................................................................................................... 63 Bảng 4.13: Tỷ lệ chết của giống/dòng huệ đơn sau 60 ngày trồng ................. 64 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 4.14: Các chỉ tiêu sinh trƣởng của các giống/dòng hoa huệ đơn sau 180 ngày trồng ........................................................................................................ 66 Bảng 4.15: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 .... 68 Bảng 4.16: Tần số các dạng bất thƣờng ở lá của các dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng ........................................................................................................ 70 Bảng 4.17: Tần số các dạng bất thƣờng ở thân và củ của các dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 72 Bảng 4.18: Tần số các dạng hoa bất thƣờng trên cùng phát hoa của các dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 ............................................................................ 73 Bảng 4.19: Đánh giá mức độ mùi thơm ở các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 ........................................................................................................... 75 Bảng 4.20: Tỷ lệ chết của các giống/dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng..... 76 Bảng 4.21: Các chỉ tiêu sinh trƣởng của các giống/dòng hoa huệ kép sau 180 ngày .................................................................................................................. 77 Bảng 4.22: Đặc điểm ra hoa của giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 .... 79 Bảng 4.23: Tần số các dạng bất thƣờng ở lá của các dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng ........................................................................................................ 81 Bảng 4.24: Tần số các dạng bất thƣờng ở thân và củ của các dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 83 Bảng 4.25: Tần số các dạng bất thƣờng ở hoa của các dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ........................................................................................................... 86 Bảng 4.26: Tần số các dạng hoa bất thƣờng trên cùng một phát hoa của các dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ................................................................... 89 Bảng 4.27: Đánh giá mức độ mùi thơm của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ........................................................................................................... 90 Bảng 4.28: Đặc điểm nông học của các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc sau khi trồng lần 2 ........................................................................................................ 91 Bảng 4.29: Sự đa hình của chỉ thị ISSR ở các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc .......................................................................................................................... 93 Bảng 4.30: Hệ số tƣơng đồng di truyền của các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc với 4 cặp mồi ISSR .......................................................................................... 95 Bảng 4.31: Kết quả BLAST đoạn gene ITS các mẫu lá hoa huệ trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene NCBI6 ....................................................................... 99 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xiii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 2.1: Hoa huệ đơn (trái) và kép (phải)........................................................ 6 Hình 2.3: Đỉnh sinh trƣởng thực vật1............................................................... 14 Hình 3.1: Giống hoa huệ đơn và kép đang canh tác ở tỉnh An Giang ............. 32 Hình 3.2: Quy trình thực hiện tạo dòng hoa huệ đột biến bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro và xử lý chiếu xạ tia gamma (60Co) ...................................... 34 Hình 3.3: Đỉnh sinh trƣởng cây hoa huệ .......................................................... 35 Hình 3.4: Môi trƣờng túi nylon đƣợc chuẩn bị trƣớc khi cấy mẫu .................. 36 Hình 3.5: Đĩa petri đƣợc cấy mẫu trƣớc khi xử lý tia gamma (60Co) .............. 37 Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ngoài đồng của giống/dòng hoa huệ đơn và kép thế hệ M1 tại Cần thơ và Tiền Giang ........................................................ 43 Hình 4.1: Đỉnh sinh trƣởng phát triển sau 30 ngày nuôi cấy ........................... 47 Hình 4.2: Sự hình thành mô sẹo (a) và cụm chồi (b) ở giống hoa huệ đơn ..... 48 Hình 4.3: Đồ thị tƣơng quan và hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ đơn sau 150 ngày nuôi cấy ......................... 51 Hình 4.4: Các dạng cấu trúc bất thƣờng của cụm chồi giống/dòng hoa huệ đơn ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy ..................................... 54 Hình 4.5: Đồ thị tƣơng quan hồi quy để xác định LD50 của các liều chiếu xạ khác nhau ở giống/dòng hoa huệ kép sau 150 ngày nuôi cấy ......................... 57 Hình 4.6: Các dạng cấu trúc bất thƣờng của cụm chồi giống/dòng hoa huệ kép ở các liều chiếu xạ khác nhau sau 150 ngày nuôi cấy ..................................... 61 Hình 4.7: Giai đoạn ra rễ giống hoa huệ đơn................................................... 62 Hình 4.8: Đƣờng kính củ ở giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 ............ 67 Hình 4.9: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ đơn khi ra hoa lần 1 .......................................................................................................................... 69 Hình 4.10: Các dạng lá bất thƣờng của các dòng hoa huệ đơn đã xử lý chiếu xạ sau 60 ngày trồng ............................................................................................. 71 Hình 4.11: Các dạng thân và củ bất thƣờng ở các giống/dòng hoa huệ đơn sau 60 ngày trồng ................................................................................................... 72 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xiv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ Hình 4.12: Các dòng hoa huệ đơn có số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1 ......... 73 Hình 4.13: Các dạng hoa huệ đơn với số cánh hoa tăng khi ra hoa lần 1........ 74 Hình 4.14: Số củ của các giống/dòng hoa huệ kép khi trồng lần 1 ................ 78 Hình 4.15: Chiều cao phát hoa của các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1........................................................................................................................ 80 Hình 4.16: Các dạng lá bất thƣờng của các dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng ................................................................................................................. 82 Hình 4.17: Các dạng thân và củ bất thƣờng của các dòng hoa huệ kép sau 60 ngày trồng ........................................................................................................ 83 Hình 4.18: Các bất thƣờng về hình thái hoa ở các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ....................................................................................................... 87 Hình 4.19: Dạng hoa bất thƣờng với hoa nở và có mùi thơm ở các giống/dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ............................................................................ 87 Hình 4.20: Hình thái cánh hoa các dạng hoa bất thƣờng với số cánh hoa nhiều hơn 12 cánh và có mùi thơm............................................................................ 88 Hình 4.21: Các dạng hoa bất thƣờng trên cùng một phát hoa ở các dòng hoa huệ kép khi ra hoa lần 1 ................................................................................... 89 Hình 4.22: Các giống hoa huệ địa phƣơng và dòng hoa huệ đột biến chọn đƣợc khi trồng lần 2 .................................................................................................. 92 Hình 4.23: Phổ điện di sản phẩm PCR của các dòng hoa huệ đột biến và giống gốc với một số mồi ISSR ................................................................................. 94 Hình 4.24: Sơ đồ hình nhánh về mối quan hệ di truyền giữa các kiểu gen hoa huệ dựa trên dữ liệu ISSR ................................................................................ 96 Hình 4.25: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 ...................... 96 Hình 4.26: So sánh các trình tự nucleotide của vùng ITS trên các giống/dòng hoa huệ chọn đƣợc ......................................................................................... 100 Hình 5.1: Quy trình tạo dòng hoa huệ đột biến bằng tia gamma (60Co) trong điều kiện in vitro ............................................................................................ 102 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT 60 Co Cobalt 60 ADN (Acid deoxyribo nucleic) Axít Đêôxiribônuclêic BA Benzyl adenine BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) Công cụ tìm kiếm trình tự cơ bản BM (Base medium) Môi trƣờng nuôi cấy cơ bản ĐC Đối chứng Df Bậc tự do df EMS Ethyl methane sulphonate F Giá trị thống kê F GA3 Gibberellic acid GR50 (50% growth reduction) Sự giảm sinh trƣởng 50% Gy Đơn vị phóng xạ Gray HĐ Giống hoa huệ đơn HK Giống hoa huệ kép IAA Indole -3-acetic acid IBA Indole-3-butyric acid in vitro Trong ống nghiệm in vivo Quá trình diễn ra trong cơ thể sống ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) Kỹ thuật chuỗi lặp lại đơn giản giữa ITS (Internal Transcribed Spacer) Kỹ thuật phân tích vùng đệm trong đƣợc sao mã LD50 (Median lethal dose) Liều gây chết 50% M0 Cá thể đột biến từ vật liệu đƣợc chiếu xạ M1 Cây con sống ở thế hệ đột biến đầu tiên M2 Cây đột biến ở thế hệ đột biến thứ 2 MS Murashige & Skoog,1962 NAA 1-Naphthaleneacetic acid Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xvi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ NCBI (National Center for Biotechnology Information) Trung tâm Thông tin Công nghệ Sinh học Quốc gia, Mỹ PCR (Polymerase Chain Reaction) Phản ứng chuỗi trùng hợp RFLP (Restriction fragment length polymorphism) Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn rRNA RNA ribosome Sig. (Significance) Mức ý nghĩa TB bình phƣơng Trung bình bình phƣơng M1VĐ Giống hoa huệ đơn trồng ngoài đồng lần 1 M2VĐ Giống hoa huệ đơn trồng ngoài đồng lần 2 M1VK Giống hoa huệ kép trồng ngoài đồng lần 1 M2VK Giống hoa huệ kép trồng ngoài đồng lần 2 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học xvii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận án Tiến sĩ Khóa 2013-2017 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Cây hoa huệ (Polianthes tuberosa L.) là một trong những cây hoa cắt cành phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây hoa huệ là loại cây trồng mang lại thu nhập cao hơn so với lúa hoặc các cây trồng khác. Vì vậy, cây hoa huệ đã đƣợc đƣa vào chƣơng trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng và đƣợc xem là cây trồng xóa đói giảm nghèo ở các tỉnh nhƣ Tiền Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ và An Giang. Hiện nay, chỉ có hai giống hoa huệ với một tràng hoa gồm 6 cánh hoặc với hai tràng hoa gồm 12 cánh đƣợc canh tác chủ yếu ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Tuy nhiên, việc nhân giống hoa huệ chủ yếu bằng củ qua nhiều thế hệ dẫn đến giống bị thoái hóa nghiêm trọng, dễ bị sâu bệnh tấn công và làm giảm năng suất đáng kể. Do đó, nhu cầu về giống mới để thay thế đang rất cần thiết. Mặt khác, việc lai tạo giống mới ở cây hoa huệ theo kiểu truyền thống gặp phải một số hạn chế do tính bất tƣơng hợp cao vì hoa có nhụy và nhị chín không cùng lúc và hạt không tạo đƣợc trong điều kiện tự nhiên (Estrada-Basaldua et al., 2011). Hơn nữa, chỉ có giống hoa đơn thì tạo đƣợc hạt nhƣng hạt khó nẩy mầm. Có lẽ tạo đột biến là cách tốt nhất trong việc tạo giống hoa huệ mới. Trong các tác nhân đột biến vật lý, tia gamma đƣợc sử dụng rộng rãi và có hiệu quả nhất (Matsumara et al., 2010). Kỹ thuật này làm tăng biến dị di truyền ở một số loài hoa nhƣ sự thay đổi về màu sắc, hình dạng, đặc tính sinh trƣởng… của hoa (Xu et al., 2012). Bên cạnh đó, kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần đƣợc áp dụng để tăng số mẫu đƣợc chiếu xạ. Sự nhân giống cây hoa huệ in vitro đã đƣợc nghiên cứu (Huỳnh Thị Huế Trang và ctv., 2007; Hutchinson et al., 2004). Trong đó, nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và chiếu xạ là phƣơng pháp hiệu quả để làm cây sạch bệnh, nhân nhanh và có đƣợc biến dị. Sự kết hợp này đƣợc áp dụng thành công trên cọ, táo, khoai tây, khoai lang và khóm (Ulukapi and Nasircilar, 2015) và hoàn toàn có thể áp dụng trong việc chọn tạo giống hoa huệ. Mặt khác, cánh hoa có vai trò quan trọng trong sự nở hoa, sự thụ phấn và giao phấn… Đối với cây hoa kiểng, số lƣợng cánh hoa có liên quan lớn đến kiểu hình hoa. Khi xử lý tia gamma riêng lẻ và nuôi cấy in vitro kết hợp xử lý tia gamma đã làm thay đổi số lƣợng cánh hoa hồng, sự gia tăng số lƣợng cánh hoa cúc (Usenbaevard and Imankulova, 1974; Kahrizi et al., 2012; Nagatomi, 2001). Do đó, ở hoa huệ khả năng gây đột biến tạo nguồn biến dị mới về đặc điểm tăng số lƣợng cánh hoa rất cao khi nuôi cấy in vitro và xử lý tia gamma. Cho đến nay, Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 1 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học