LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TINH SẠCH VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA
ENZYME PHYTASE TỪ NẤM Aspergillus niger
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG
NGUYỄN CÔNG DANH
MSSV: 4084238
LỚP: CNSHTT K 34
CẦN THƠ
5/2013
PHẦN KÝ DUYỆT
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. DƯƠNG THỊ HƯƠNG GIANG
NGUYỄN CÔNG DANH
XÉT DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………
Cần Thơ, ngày tháng
năm 2013
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
LỜI CẢM TẠ
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn đến TS. Dương Thị Hương Giang đã tận
tâm hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi từ việc định hướng đề tài đến theo
dõi sát tiến trình thí nghiệm.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô giảng viên Lớp Công nghệ Sinh học
tiên tiến Khóa 34 của Trường Đại học Cần Thơ cùng bạn bè đã góp ý, động
viên, hỗ trợ nhiệt tình cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại
Trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cô và các anh chị phụ trách các Phòng
thí nghiệm, đặc biệt là bạn Nguyễn Văn Tính đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn và
hỗ trợ chúng tôi sử dụng trang thiết bị thuận lợi và hiệu quả.
Tôi gửi lời tri ân chân thành và sâu sắc nhất đến Cha Mẹ và anh chị em
trong gia đình vì đã hỗ trợ rất nhiều về tinh thần cũng như vật chất, giúp tôi có
thể an tâm làm thí nghiệm trong thời gian vừa qua.
Ngoài ra, chúng tôi xin ghi nhận và trân trọng sự hỗ trợ nhiệt tình của các
anh chị làm luận văn Cao Học khóa 18, các bạn sinh viên khóa 34 tiên tiến
trong việc hỗ trợ tài liệu, phụ giúp thí nghiệm, trao đổi và tranh luận về tiến
trình thí nghiệm cũng như khả năng ứng dụng trong tương lai.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Cần Thơ, ngày 10 tháng 5 năm 2013
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
TÓM LƯỢC
Mục tiêu của nghiên cưú là tinh sạch và khảo sát các đặc điểm của enzyme phytase từ
nấm Aspergillus niger được phân lập bởi Trần Nguyễn Nhật Khoa. Kết quả chỉ ra
rằng enzyme phytase ngoại bào từ nấm A. niger có thể được tinh sạch qua các bước
tủa bằng ammonium sulfate với 80% bảo hòa, sắc ký trao đổi ion trên gel SPStreamline và sắc ký tương tác kỵ nước trên gel Pheny-Sepharose. Phytase sau khi
tinh sạch có hoạt tính gấp 12,56 lần so với phytase trong dung dịch thô với hoạt tính
thu hồi 48%. Điện di SDS-PAGE cho thấy rằng phytase được tinh sạch có trọng lượng
phân tử vào khoảng 87kDa. Nhiệt độ tối ưa cho hoạt động của enzyme vào khoảng
65°C . Sự ảnh hưởng của ion Ca2+ thể hiệ rõ nhất ở nồng độ 40mM.
Từ khóa: Aspergillus niger, tương tác kỵ nước, sắc ký trao đổi ion, SP-Streamline,
Phenyl Sepharose, phytase.a
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
i
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
MỤC LỤC
Trang
TÓM LƯỢC................................................................................................................ i
MỤC LỤC ..................................................................................................................ii
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................... iv
DANH SÁCH BẢNG ...................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................vi
CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1
CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
.2
2.1. Aspergillus niger .................................................................................................. 2
2.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 2
2.1.2. Đặc điểm hình thái ..................................................................................... 2
2.1.3. Ứng dụng ................................................................................................... 2
2.2. Acid phytic .......................................................................................................... 3
2.2.1. Cấu trúc hóa học ........................................................................................ 3
2.2.2. Chức năng sinh lý ...................................................................................... 4
2.2.3. Sự phổ biến, phân bố và hàm lượng..............................................................4
2.3. Phytase ................................................................................................................ 5
2.3.1. Giới thiệu chung ........................................................................................ 5
2.3.2. Đặc điểm ................................................................................................... 5
2.3.3. Ứng dụng......................................................................................................7
2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên ............................................................. 8
2.5. Phương pháp tinh sạch protein .......................................................................... 9
2.5.1. Phương pháp tủa protein ............................................................................ 9
2.5.2. Phương pháp sắc ký ................................................................................... 9
2.6. Một số nghiên cứu về tinh sạch và khảo sát đặc điểm phytase ...................... 13
2.6.1. Tinh sạch và khảo sát đặc điểm phytase từ nấm ....................................... 13
2.6.2. Tinh sạch phytase và khảo sát đặc điểm từ vi khuẩn ................................ 14
2.6.3. Tinh sạch phytase và khảo sát đặc điểm từ thực vật ................................. 15
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 16
3.1. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................... 16
3.1.1. Thời gian và địa điểm .............................................................................. 16
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
ii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
3.1.2. Nguyên liệu ............................................................................................. 16
3.1.3. Thiết bị - Dụng cụ .................................................................................... 16
3.1.4. Hóa chất................................................................................................... 16
3.2. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 17
3.2.1. Thu nhận và tinh sạch phytase.................................................................. 17
3.2.2. Thí nghiệm khảo sát một số đặc điểm của phytase tinh sạch .................... 19
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ............................................................. 24
4.1. Thu nhận và tinh sạch phytase ......................................................................... 24
4.1.1. Thu nhận phytase thô ................................................................................ 24
4.1.2. Tinh sạch phytase ...................................................................................... 24
4.1.2.1. Tinh sạch sơ bộ phytase bằng phương pháp tủa ............................... 24
4.1.2.2. Tinh sạch phytase bằng kỹ thuật sắc ký trao đổi ion......................... 25
4.1.2.3. Tinh sạch phytase bằng kỹ thuật sắc ký tương tác kỵ nước .............. 27
4.2. Khảo sát một số đặc điểm của phytase tinh sạch ............................................. 31
4.2.1. Ảnh hưởng của ion Ca2+ đến hoạt tính phytase ......................................... 31
4.2.2. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của phytase ............................................... 32
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ .................................................................. 34
5.1. Kết luận ............................................................................................................. 34
5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 35
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iii
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
APS:
Ammonium persulfate
BSA:
Bovin Serum albumin
DEAE:
Diethylaminoethyl
EC:
Enzyme Classification
EDTA:
Ethylene diamine tetraacetic acid
SDS-PAGE:
Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamidegel electrophoresis
SP:
Sulphopropyl
TEMED:
N, N, N’, N’ –tetra methyl ethylene diamine
TCA:
Trichloroacetic acid
Tris:
Tris-[hydroxymethyl]aminomethane
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
iv
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1. Một số đặc điểm của phytase từ các loài khác nhau ........................................ 6
Bảng 2. Tổng kết các bước tinh sạch…………………………………………………27
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
v
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1. Cấu trúc hóa học của acid phytic ..................................................................... 4
Hình 2. Hoạt động thủy phân acid phytic của phytase .................................................. 5
Hình 3. Sơ đồ quy trình nuôi cấy và trích ly phytase thô từ sinh khối A. niger ........... 17
Hình 4. Sơ đồ quy trình tinh sạch phytase .................................................................. 19
Hình 5. Bảng điện di SDS-PAGE sau tủa phân đoạn ammonium sulfate…………….22
Hình 6. Sắc ký đồ trên cột SP-Streamline…………………………………………….23
Hình 7. Bảng điện di SDS-PAGE sau sắc ký trao đổi ion…………………………….23
Hình 8. Sắc ký đồ trên cột Phenyl Sepharose................................................................24
Hình 9. Bảng điện di SDS-PAGE sau sắc ký tương tác kỵ nước……………………..26
Hình 10. Sơ đồ quy trình tinh sạch phytase…………………………………………...29
Hình 11. Ảnh hưởng của ion Ca2+ lên hoạt tính phytase……………………………...30
Hình 12. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính phytase……………………………...31
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
vi
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Phytate (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chính phospho trong thực vật.
Chúng chiếm 1-3% trong hạt của các loại ngũ cốc và cây họ đậu và 60-80% trong tổng
số phospho của thực vật (Nelson, 1967). Phospho trong thức ăn của các loài động vật
như gia súc, gia cầm kể cả con người đều tồn tại dưới dạng phytate hay phytic acid.
Trong dạ dày của các loài động vật này và con người thiếu enzyme phytase có thể tiêu
hóa được phytate nên hợp chất này thường không được hấp thụ mà bị thải ra ngoài qua
con đường bài tiết qua phân gây ô nhiễm môi trường (Mullaney et al., 2000). Do đó,
người chăn nuôi cần bổ sung một lượng lớn phospho vô cơ hoặc enzyme phytase thủy
phân phytate cung cấp phospho hấp thu tốt trong đường tiêu hóa. Sử dụng phytase
trong thức ăn gia súc sẽ giúp giảm lượng phospho vô cơ cung cấp trong thức ăn, đồng
thời cũng làm giảm bài tiết phospho ra ngoài môi trường.
Sản xuất enzyme phytase đang ngày càng được chú trọng trong công nghiệp chăn
nuôi, cho nên việc tìm kiếm nguồn enzyme dồi dào là cần thiết. Phytase được sinh
tổng hợp ở thực vật cũng như ở vi sinh vật, đặc biệt là trong nấm. Phytase được sản
xuất từ các nguồn như vi khuẩn (Bacillus sp., Enterbacteria sp.), hay từ nấm sợi
(Aspergillus sp., Penicillin sp., Mucor sp.). Trong đó nấm mốc A. niger là đối tượng
được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất.
Dựa trên các nghiên cứu trước đây về điều kiện nuôi cấy thích hợp chủng A. niger sinh
tổng hợp phytase cao, A. niger đã được phân lập ở phòng thí nghiệm Công nghệ
Enzyme-Viện CNSH (Trần Nguyễn Nhật Khoa, 2012). Để tiếp nối, đề tài “Tinh sạch
và khảo sát một số đặc điểm của enzyme phytase từ nấm Aspergillus niger” được
thực hiện nhằm mục đích ly trích enzyme phytase từ dòng nấm này và trải qua các
bước tinh sạch, cùng với việc khảo sát một số đặc điểm ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme phytase, để có thể ứng dụng hữu hiệu hơn trong thực tiễn chăn nuôi gia súc
gia cầm và thủy sản.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
1
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Aspergillus niger
A. niger là một loài nấm mốc phổ biến nhất của chi Aspergillus. A. niger phân
bố phổ biến trong môi trường đất, thực vật và không khí (Samson et al., 2001).
2.1.1. Vị trí phân loại
Ngành
: Eumycota
Ngành phụ : Deuteromycotina
Lớp
: Hypomycetes
Bộ
: Euhypomycetidae
Họ
: Phialoconidiae
Giống
: Aspergillus
Loài
: Aspergillus niger
A. niger thuộc giống phụ Circumdati, nhóm Nigri. Nhóm Nigri bao gồm 15 loài
liên quan có bào tử màu đen, bao gồm cả A. tubingensis, A. foetidus, A. carbonarius,
và A. awamori (Samson et al., 2004).
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Khuẩn ty của nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn và có vách ngăn, gồm hai loại:
- Khuẩn ty dinh dưỡng (vegetative mycelium): là các khuẩn ty phát triển sâu
vào cơ chất và hấp thụ các chất dinh dưỡng chứa trong cơ chất để phát triển.
- Khuẩn ty sinh sản (reproduction mycelium): khuẩn ty phát triển trong không
khí, có kích thước lớn hơn khuẩn ty dinh dưỡng rất nhiều, trong suốt. Chúng hướng
vào không khí để lấy oxy. Khi già chúng có khả năng tạo bào tử đính có màu đen.
2.1.3. Ứng dụng
A. niger được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất công nghiệp. Nhiều chủng
A. niger được sử dụng trong sản xuất acid citric (E330) và acid gluconic (E574) và
đã được Tổ chức Y tế Thế giới chấp nhận được sử dụng trong thức ăn hàng ngày.
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
2
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Nhiều enzyme hữu ích được sản xuất công nghiệp từ A. niger.
Ví dụ,
glucoamylase được sử dụng trong sản xuất xi-rô ngô fructose cao và pectinase được sử
dụng làm trong rượu táo và rượu vang. Alpha-galactosidase, một loại enzyme phân
hủy các loại đường phức tạp, là thành phần của các loại thuốc có tác dụng làm giảm
đầy hơi.
Trong khoảng thời gian gần đây, các nghiên cứu về đặc điểm và ứng dụng của
phytase từ A. niger được tiến hành ngày càng nhiều chứng tỏ khả năng ứng dụng của
loại phytase tách chiết từ loại nấm này. Papagianni et al. (2001) đã khảo sát điều kiện
nuôi cấy A. niger để thu nhận phytase hoạt tính cao. Sariyska et al. (2005) và Greiner
et al. (2009) cũng đã tinh sạch và đặc điểm hóa phytase từ A. niger hoang và A. niger
11T53A9. Phytase của A. niger - PhyB hoạt động xúc tác tối ưu ở pH trung bình 2,5.
Tuy nhiên pH ở dạ dày của động vật lại nằm trong khoảng cao hơn 3,0-3,5. Weaver et
al. (2007) đã nghiên cứu và cho ra dòng đột biến A. niger E272K với pH tối ưu từ 2,53,2.
Ngoài các ứng dụng kể trên chủng A. niger còn được nuôi cấy để tách các
enzyme glucose oxidase (GO) và Alpha-galactosidase (AGS). Glucose oxidase được
sử dụng như chất cảm biến sinh học glucose (Staiano et al., 2005). Alphagalactosidase có thể được sản xuất bởi A. niger ứng dụng trong thủy phân liên kết
alpha 1-6 của melibiose , raffinose và stachyose .
Prolyl endoprotease ở A. niger (AN-PEP) là một prolyl endoprotease có nguồn
gốc từ vi sinh vật, có khả năng phân giải gluten, đã được nghiên cứu để ứng dụng
trong việc điều trị bệnh celiac (Mitea et al., 2008), một loại dị ứng thường gặp ở những
người bị dị ứng với chất gluten trong lúa mì và những ngũ cốc khác. Nghiên cứu này
đã được bắt đầu vào 2008 trên nhũng người mắc bệnh celiac để xác định hiệu quả của
phytase trong điều trị bệnh (Mulder, 2009).
2.2. Giới thiệu chung về phytic acid và muối phytate
2.2.1. Acid phytic
2.2.1.1. Cấu trúc hóa học
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
3
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Hình 1. Cấu trúc hóa học của acid phytic (Afinah et al. 2010)
Các cấu trúc hóa học của acid phytic (myo-inositol 1,2,3,4,5,6-hexakis
dihydrogen phosphate (IUPAC-IUB, 1977) với gốc phosphate vị trí 2 là vị trí trục, các
gốc phosphate ở vị trí khác là vị trí xích đạo (Johnson và Tate, 1969). Cấu trúc này
được mô tả như trong hình 1.
2.2.12. Chức năng sinh lý
Acid phytic có tác dụng trong việc dự trữ năng lượng, dự trữ phospho, dự trữ
cation và cũng là nguồn dự trữ chính myo-inositol (một tiền chất của thành tế bào).
Ngoài ra acid phytic có vai trò như là một chất chống oxy hóa tự nhiên trong hạt và
tham gia vào việc chống ung thư ở động vật. Các loài động vật khi ăn các loại hạt có
chứa nhiều acid phytic sẽ có thể chống lại các quá trình hình thành và phát triển của
các tế bào ung thu trong cơ thể.
2.2.1.3. Sự phổ biến, phân bố và hàm lượng
Dạng tồn tại chủ yếu của acid phytic là muối của các cation hóa trị một, hai, ba
và hỗn hợp của các ion này trong hạt ngũ cốc và cây họ đậu, chúng tích tụ trong các
hạt tinh bột mì (Reddy et al., 1989). Ferguson và Bollard (1976) cho thấy 99% phytate
trong lá mầm và 1% trong phôi của các hạt đậu khô. Hàm lượng phytate cao nhất được
tìm thấy trong ngô (0,83-2,22%) và trong đậu que (5,92-9,15%) (Reddy et al., 1989).
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
4
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
2.3. Phytase
2.3.1. Giới thiệu chung
Phytase là một enzyme phổ biến trong tự nhiên được tìm thấy ở động vật, thực
vật, tảo và trong một loạt các vi sinh vật (nấm mốc, nấm men và vi khuẩn).
Phytase xúc tác sự thủy phân của acid phytic tạo phosphate vô cơ và myoinositol ít gốc phosphate, và trong một số trường hợp tạo myo-inositol tự do (hình 2).
Danh pháp của phytase theo Hiệp hội Sinh hoá quốc tế phân biệt hai loại: 3-phytase
(EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26). Phân loại này dựa trên nhóm phosphate đầu
tiên được thủy phân bởi phytase. 3-phytase là enzyme điển hình ở vi sinh vật và 6phytase là ở thực vật.
Hình 2. Hoạt động thủy phân acid phytic của phytase
(http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S014102299700210X)
2.3.2. Đặc điểm
Đặc điểm cấu trúc
Đa số các phytase cho đến nay có cấu trúc đơn phân (monomeric). Đây là trường
hợp với phytase nấm (Wyss et al., 1998; Ullah và Gibson, 1987; Dvorakova và
Kopecky, 1997), với phytase E. coli và K. terrigena (Greiner et al., 1993; Greiner et
al., 1997), và với phytase B. subtilis (natto) (Shimizu, 1992). Tuy nhiên, một số
phytase ở thực vật và ở động vật lại có cấu tạo gồm nhiều tiểu đơn vị.
Đặc hiệu cơ chất
Phytase hiển thị đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. ADP, ATP, p-nitrophenyl
phosphate, phenyl phosphate, 1,6-bisphosphate fructose, 6-phosphate glucose, α-và βglycerophosphate và 3-photphoglyxerate không có cấu trúc tương tự như acid phytic,
cũng thường được thủy phân bởi phytase. Chỉ có một vài phytase được miêu tả là đặc
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
5
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
hiệu cho acid phytic: các phytase Bacillus (Powar và Jagannathan, 1982; Shimizu,
1992) và phytase kiềm phân lập từ phấn hoa lily (Barrientos và Muthy, 1994).
pH và nhiệt độ tối ưu (Bảng 1).
Hầu hết các phytase vi sinh vật có pH tối ưu giữa 4,5 và 5,6. Phytase A.
fumigatus có khoảng pH tối ưu rộng; ít nhất 80% hoạt động tối đa tại các giá trị pH
giữa 4,0 và 7,3. Một số phytase vi khuẩn, đặc biệt từ Bacillus, có pH tối ưu 6,5-7,5. pH
tối ưu của phytase ở hạt giống cây trồng trong khoảng 4,0-7,5. Hai phytase kiềm từ
thực vật có pH tối ưu 8,0 đã được mô tả trong hạt họ đậu (Scott, 1991) và phấn hoa lily
(Hara et al., 1985)
Bảng 1. Một số đặc điểm của phytase từ các loài khác nhau
Loài
Nhiệt độ tối
pH tối ưu
pI
ưu (oC)
Trọng lượng phân tử
(kDa)
A. niger (Natuphos)
55
5,5
4,78
66
A. nigerNRRL3135
55
2,5 và 5,5
-
-
A. niger SK-57
50
2,5 và 5,5
-
60
A. niger 113
60
2,0 và 5,0
4,63
64
A. terreus 9A1
49
5,5
5,08
61
A. terreus CBS
45
5,3
5,5
82
A. fumigatus
60
4,0 – 7,3
7,28
72
E. nidulans
45
6,5
5,27
66
M. thermophila
55
5,5
4,95
63
T. thermophilus
45
-
5.23
128
7,01
47
-
43
E. coli
B. subtilis
-
2,5 - 7,0
55
7.0
(Nguồn: Xiong et al., 2004 )
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
6
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Dãy nhiệt độ tối ưu của phytase trải dài từ 40 oC đến 70 oC. Trong đó, phytase của
Bacillus sp. DS11 có nhiệt độ tối ưu khá cao (70 oC). Ngoài ra ion Ca2+ có tác dụng
bảo vệ phytase chống lại sự biến tính nhiệt (Kim et al., 1998).
2.3.3. Ứng dụng
Phytase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như chăn nuôi, thủy sản,
chế biến thực phẩm, sản xuất myo-inositol phosphate, công nghiệp giấy và bột giấy.
Ngoài ra enzyme này còn có ứng dụng trong nông nghiệp, làm gia tăng độ phì của đất
trồng.
Ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi
Các loài vi sinh vật trong dạ cỏ của động vật nhai lại có tác dụng sản sinh
phytase để thủy phân phytate mà động vật nhai lại ăn vào, các phospho vô cơ tạo ra từ
sự thủy phân này được cả vi sinh vật và động vật nhai lại sử dụng. Đa số các loại vi
sinh vật này thuộc nấm và các vi sinh vật kỵ khí.
Động vật có dạ dày đơn như lợn, gia cầm, cá không có enzym phytase nên
không thể chuyển hóa acid phytic. Vì vậy, phospho vô cơ được thêm vào thức ăn của
chúng để đáp ứng yêu cầu phospho. Điều này làm tăng chi phí và gây ô nhiễm
phospho vô cơ. Việc bổ sung phytase vào thức ăn chăn nuôi làm giảm lượng phospho
trong phân và giảm ô nhiễm môi trường.
Một số kết quả nghiên cứu cho rằng nếu phytase được sử dụng trong các nguồn
cung cấp thức ăn cho tất cả động nuôi có vật dạ dày đơn ở Mỹ sẽ giải phóng lượng
phospho trị giá 168 triệu đô la Mỹ và sẽ giảm 8,23x104 tấn phospho thải ra môi trường
mỗi năm. Việc sử dụng phytase bổ sung vào thức ăn chăn nuôi đã được phê duyệt ở 22
quốc gia. FDA (Cơ quan quản lý Thuốc và Thực phẩm của Mỹ) đã phê duyệt phytase
GRAS (thường được coi là an toàn) (Wodzinski và Ullah, 1996). Phytase được bổ
sung vào khẩu phần thức ăn của lợn có chứa ngô và đậu tương sẽ chuyển đổi khoảng
một phần ba lượng phospho từ dạng không hấp thu sang dạng hấp thu được (Cromwell
et al, 1993). Các thí nghiệm bổ sung phytase vào thức ăn của lợn và gà cũng cho kết
quả tương tự (Cromwell et al., 1995; Yi et al., 1996; O'Quinn et al., 1997).
Ở Hà Lan, phytase của A. niger đã được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, làm
giảm 30 - 40% ô nhiễm phospho (Jongbloed et al., 1992). Phytase bổ sung vào thức ăn
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
7
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
chăn nuôi phải có một số đặc điểm nhất định. Đặc biệt, các enzyme cần phải chịu được
nhiệt độ cao.
Ứng dụng trong thực phẩm
Phytate có trong ngũ cốc, rau đậu và protein đậu nành với hàm lượng cao, do đó
những người ăn chay, người dân ở các nước kém phát triển ăn bánh mì không qua lên
men, những người tiêu thụ nhiều sản phẩm có nguồn gốc từ đậu nành sẽ bị tích tụ một
lượng phytate với hàm lượng cao trong cơ thể (Simell et al, 1989). Phytate không tiêu
hoá được trong ruột non ảnh hưởng tiêu cực đến sự hấp thu của kẽm, canxi, magiê và
sắt. Nó cũng làm giảm khả năng tiêu hóa của protein và ức chế các enzyme trong hệ
tiêu hóa. Anno et al. (1985) đã loại phytate từ sữa đậu nành bằng cách sử dụng phytase
từ lúa mì. Bổ sung phytase của A. niger vào bột có chứa cám lúa mì để tăng hấp thu sắt
ở người (Sandberg et al., 1996).
Sản xuất Myo-Inositol phosphate
Inositol phosphate và phospholipid có vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu ở
màng và huy động calci dự trữ nội bào (Billington, 1993). Hơn nữa, inositol
triphosphate đã được đề xuất để ngăn ngừa hoặc giảm nhẹ một số bệnh viêm nhiễm
như viêm khớp và các bệnh đường hô hấp như hen suyễn (Siren et al., 1992). Việc sử
dụng inositol triphosphates là thuốc giảm đau cũng đã được đề nghị (Siren, 1995).
Các ester của inositol triphosphate có tác dụng chống nhiễm trùng retrovirut trong đó
có HIV (Siren, 1998).
Ứng dụng trong công nghiệp giấy và bột giấy
Việc loại bỏ các acid phytic thực vật là giai đoạn quan trọng trong ngành công
nghiệp bột giấy và giấy. Các phytase chịu nhiệt có thể làm giảm acid phytic trong chế
biến bột giấy và giấy. Sự phân giải acid phytic bởi enzyme sẽ không gây ung thư và
giảm độc tính trong sản phẩm. Vì vậy, việc khai thác phytase trong công nghiệp bột
giấy và giấy là biện pháp thân thiện môi trường hỗ trợ cho việc phát triển công nghệ
sạch (Liu et al., 1998).
2.4. Nguồn sản sinh phytase trong tự nhiên
2.4.1. Phytase từ vi sinh vật
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
8
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Vi sinh vật là nguồn cung cấp phytase chủ yếu trong tự nhiên. Đa số các phytase
từ vi khuẩn là những phytase nội bào. Ngược lại, các loại phytase ngoại bào được tìm
thấy trong sợi nấm, đặc biệt chi Aspergillus có 28 loài có khả năng sản xuất phytase
ngoại bào. Loài Aspergillus niger được xem là nguồn sản xuất phytase tốt nhất
(Gargova et al., 1997). Phytase cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn như Pseudomonas
sp. (Richardson và Hadobas, 1997), Bacillus subtilis (Powar và Jaganathan, 1982),
Bacillus sp. DS11 (Kim et al., 1998), Klebsiella sp. (Tambe et al., 1994; Greiner et al.,
1997), E. coli (Greiner et al., 1993) and Enterobacter (Yoon et al., 1996). Trong đó chỉ
có phytase những loài vi khuẩn thuộc chi Bacillus và Enterobacteria là những phytase
ngoại bào. Ngoài ra, nấm men cũng là nguồn sản sinh phytase. S. Cerevisiae
(Nakamura et al., 2000) and Schwanniomyces castellii (Lambrechts et al., 1992) có
khả năng sản xuất cả phytase ngoại bào và nội bào.
2.4.2. Phytase từ thực vật
Phytase có vai trò quan trọng trong quá trình nảy mầm của thực vật , chúng phân
giải phytate cung cấp phosphate, chất khoáng, và đường myo-inositol giúp cây phát
triển và tăng trưởng. Chúng tồn tại hầu hết ở hạt và phấn hoa ở thực vật bậc cao như
ngũ cốc, cây họ đậu, hạt cây có dầu (Reddy et al., 1989). Hoạt tính phytase cao nhất
được tìm thấy ở lúa mạch đen, lúa mạch và lúa mì.
2.4.3. Phytase từ mô động vật
Các báo cáo về phytase có nguồn gốc từ động vật được tiến hành vào năm 1908,
phytase được tìm thấy trong gan và máu bò con (McCollum và Hart, 1908). Tuy nhiên,
đa số các nghiên cứu về phytase trong máu của động vật có vú không thành công và
phytase chỉ được tìm thấy trong máu của động vật có xương sống thấp hơn như chim,
bò sát và cá (Rapoport et al., 1941). Ngoài ra phytase còn được phát hiện trong niêm
mạc ruột non của chuột, thỏ, chuột lang, bò con và người (Bitar và Reinhold, 1971;
Cooper và Gowing, 1983; Iqbal et al., 1994).
2.5. Phương pháp tinh sạch protein
2.5.1. Phương pháp tủa protein
2.5.1.1. Phương pháp tủa bằng muối
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
9
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
Có nhiều loại muối có thể được dùng để tủa protein như muối (NH4)2SO4,
NaCl… vì các muối này vừa làm trung hòa điện tích (do các ion tác động tương hỗ với
các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp áo nước của phân tử protein. Các protein
có thể được kết tủa ở các nồng độ muối khác nhau, do đó dung dịch muối được dùng
để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp chứa chúng. Thuận lợi của phương pháp tủa
bằng muối là ít làm ảnh hưởng đến sự biến tính của phytase. Tuy nhiên, dịch trích
enzyme sau khi tủa cần được thẩm tích loại muối.
2.5.1.2. Phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ
Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số
đó là hằng số điện môi của dung dịch. Những chất có hằng số điện môi lớn như nước,
dimethylsulfoxide,… có khả năng ổn định sự tương tác giữa các chất này với các phân
tử protein tạo điều kiện cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các
dung môi với hằng số điện môi nhỏ như aceton, ethanol… sẽ ngăn cản sự phân tán của
các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein
giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Sự
tủa bằng aceton hoặc ethanol có nhiều thuận lợi và được áp dụng nhiều hơn vì nó
tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với
enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm
enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.
2.5.2. Phương pháp sắc ký (Dương Thị Hương Giang, 2010)
Phương pháp sắc ký là kỹ thuật phân tách một chất trong dung dịch bao gồm
nhiều chất tương tự nhau bằng cách cho hỗn hợp di chuyển qua hệ thống pha tĩnh (giá
thể trên cột sắc ký) với chất mang là pha động (dung môi). Sự phân tách xảy ra do các
chất trong hỗn hợp tương tác với pha tĩnh ở các mức độ khác nhau. Chất cần phân
tách phải tương tác thuận nghịch với pha tĩnh để có thể dễ dàng rửa giải ra khỏi cột
sắc ký.
2.5.2.1. Sắc ký trao đổi ion
Nguyên tắc: Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự khác biệt về điện tích của các phân tử
để phân tách chúng thành các thành phần riêng biệt. Protein mang điện tích âm hay
dương trên bề mặt tùy vào pH của môi trường (nếu pH < pI thì protein tích diện dương
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
10
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
Luận văn tốt nghiệp Đại Học Khóa 34- 2013
Trường ĐHCT
và ngược lại nếu pH > pI thì protein sẽ tích điện âm). Vì vậy có thể chọn loại gel thích
hợp cho từng loại protein dựa vào pI và độ bền pH của chúng.
Tương tác thuận nghịch giữa protein mang điện tích âm hay dương với các nhóm
trao đổi ion mang điện tích trái dấu được cố định trên bề mặt các hạt gel (giá thể). Có 2
loại gel trao đổi ion:
Gel trao đổi ion dương: có các nhóm trao đổi ion mang điện tích âm, tương
tác ion với các protein mang điện tích dương
Gel trao đổi ion âm: có các nhóm trao đổi ion mang điện tích dương, tương
tác ion với các protein mang điện tích âm.
Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự tương tác giữa protein và giá thể trên cột sắc
ký trao đổi ion như mạng lưới điện tích của giá thể, lực ion của dung dịch, sự phân bố
điện tích trên bề mặt protein, pH môi trường…
Các protein được đẩy ra khỏi cột bằng gradient nồng độ muối tăng dần hay
gradient pH tùy thuộc vào độ bền của protein trong dung dịch.
Các yếu tố cần chú ý khi tiến hành sắc ký trao đổi ion
Dung dịch đệm pH
Việc chọn giá trị pH thích hợp rất quan trọng trong việc giữ các protein trong
dung dịch lại trên cột. Các protein không bám được sẽ ra trước trong dung dịch đệm.
Các giá thể trao đổi ion phải bền trong những điều kiện biến đổi pH của môi trường.
Các ion cạnh tranh
Các ion này sẽ cạnh tranh với protein trong việc gắn với các nhóm trao đổi ion
trên giá thể. Ở một nồng độ thấp thích hợp có sự cạnh tranh ion thì protein có thể
tương tác với các nhóm tích điện trái dấu trên cột trao đổi ion và bám vào cột. Ở nồng
độ cao hơn các protein sẽ bị các ion cạnh tranh bám vào cột làm chúng không thể bám
vào, việc này dẫn đến các protein sẽ bị rửa giải ra khỏi cột, protein nào không bám vào
cột được hoặc bám vào cột yếu hơn sẽ bị rửa giải ra trước. Hầu hết các protein có thể
được rửa giải khỏi cột ở nồng độ muối thấp hơn 1M.
Tiến hành
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học
11
Viện NC&PT Công nghệ Sinh học
- Xem thêm -