1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đồng là một nguyên tố vi lượng thiết yếu cho cơ thể sinh vật, tham gia
vào cấu tạo nhiều enzym quan trọng, tuy nhiên, nồng độ đồng caogây độc cho
tế bào. Bệnh Wilson là một trong số những bệnh lý gây ra bởi sự nhiễm độc
đồng, lần đầu tiên được mô tả năm 1912 do nhà thần kinh học người Anh,
Samuel Alexander Kinnier Wilson.
Bệnh Wilson hay còn gọi là bệnh thoái hoá gan- nhân đậu hoặc bệnh
thoái hoá gan não, là một bệnh gây ra do rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng
bởi sự tích luỹ đồng trong gan, não và một số mô khác [2, 3]. Trong bệnh
Wilson, đồng không được chuyển hoá thành ceruloplasmin để vận chuyển vào
máu mà tích luỹ trong gan gây tổn thương tế bào. Khi tế bào gan mất chức
năng, đồng vào máu dưới dạng tự do và kết tủa ở nhiều mô đặc biệt là thận,
mắt và não. Mặc dù là một bệnh hiếm gặp song do ảnh hưởng đến nhiều mô
và cơ quan, người bệnh dễ dẫn đến tử vong nếu không được chẩn đoán và
điều trị kịp thời.
Các nghiên cứu về bệnh Wilson có nhiều thành công trong đó, một trong
những nghiên cứu có giá trị nhất được công bố năm 1993, Cox,D.W và
Bull,P.C cùng các cộng sự về mối liên quan giữa bệnh Wilson và các đột biến
trên gen ATP7B quy định cấu trúc của một protein vận chuyển đồng. Theo
đó, bệnh Wilson chịu sự chi phối của quy luật di truyền lặn trên nhiễm sắc thể
thường. Bố và mẹ mang kiểu gen dị hợp tử có thể sinh ra con bị bệnh Wilson.
Vì vậy, việc nghiên cứu sinh học phân tử phát hiện đột biến ở bệnh nhân và
người nhà bệnh nhânkhông chỉ có vai trò trong chẩn đoán bệnh mà còn có ý
nghĩa trong tư vấn di truyền.
2
Mặt khác,đột biến trên gen ATP7B ảnh hưởng đến các vùng chức năng
khác nhau của protein, làm mất hoàn toàn hoặc một phần chức năng vận
chuyển đồng của protein, như vậy theo thời gian sự lắng đọng đồng trong các
mô ngày càng nhiều, mức độ tổn thương tế bào càng nghiêm trọng. Sử dụng
thuốc điều trị nhằm giảm lượng đồng tích luỹ phải phù hợp với từng thể bệnh,
mức độ bệnh, tuổi phát bệnh… những biểu hiện kiểu hình này đều có mối liên
hệ với các đột biến trên gen.
Dó đó, nghiên cứu “Tối ưu hoáquy trình xác định đột biến gen
ATP7B trên bệnh nhân Wilson”được thực hiện nhằm mục tiêu:
1. Áp dụng quy trình xác định đột biến trên gen ATP7B gây bệnh
Wilson bằng phương pháp giải trình tự gen.
2. Bước đầu xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson
3
Chương 1:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Wilson
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh
Từ cuối thế kỉ XIX, một bệnh lý với biểu hiện xơ gan kết hợp thần kinh
đã được biết đến, song không được mô tả hoàn thiện về triệu chứng và
nguyên nhân gây bệnh. Cho đến năm 1912, nhà thần kinh học người Anh,
Samuel Alexander Kinnier Wilson (1878-1937), đã công bố báo cáo về 12
trường hợp “rối loạn thần kinh hiếm gặp” bao gồm 8 bệnh nhân đã được đề
cập đến trong y văn trước đó và 4 bệnh nhân do ông theo dõi[4]. Theo ông,
“một tác nhân gây bệnh” dẫn đến các biểu hiện lâm sàng có thể là kim loại.
Ông cũng chứng minh rằng hàm lượng đồng tăng trong não cũng như trong
gan ở những bệnh nhân này[5]. Sau đó, căn bệnh này được biết đến với tên
gọi là bệnh Wilson.
1948, báo cáo của Cuming đã chỉ ra có sự xuất hiện một lượng kim loại
dư thừa trong cả gan và não ở những bệnh nhân Wilson đã tử vong[6].
Năm 1985, bất thường về gen gây bệnh Wilson được nhận định nằm
trên nhánh dài nhiễm sắc thể số 13[7]. Năm 1993, Peter Bull và cộng sự xác
định vị trí và phân lập được đoạn gen. Protein mà gen này mã hoá là một
protein thuộc nhóm ATPase loại P vận chuyển đổng qua màng tế bào có ảnh
hưởng đến bệnh Wilson, tuy nhiên vị trí chính xác và chức năng của nó trong
tế bào gan vẫn chưa được làm rõ [8, 9].
Từ đó, hàng trăm công trình nghiên cứu xác định đột biến, biến đổi cấu
trúc, chức năng protein, phân tích mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình
được thực hiện, dần làm sáng tỏ cơ chế gây bệnh của đột biến[10, 11, 12, 13].
4
5
1.1.2. Dịch tễ học
Wilson là bệnh di truyền có thể gặp ở mọi dân tộc trên thế giới với tỉ lệ
mắc bệnh xấp xỉ 1/30000 trẻ sơ sinh[14], tần số alen là 0,56%; tần số người
mang alen đột biến là 1/90. Tỉ lệ này không đồng nhất ở các vùng dân cư: ở
cộng đồng người Mỹ da trắng là 1/55000[15];trong khi đó, ở cộng đồng người
Hàn Quốc là 1/37000 [16].
Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu sàng lọc bệnh Wilson trên thực tế tại các
khu vực khác nhau trên thế giới lại cho thấy con số lớn hơn rất nhiều: cộng
đồng Đông Á có tỉ lệ ~1/1500[17]đến ~1/3000[18]; cộng đồng Ireland, tần số
gen là 0,41% cho thấy cứ 122 người có 1 người mang gen đột biến[19]; ở
Anh, tỉ lệ này là ~1/7000; đặc biệt tỉ lệ mắc bệnh cao nhất là ở một ngôi làng
nhỏ trên đảo Crete với tỉ lệ mắc là 1/15 trẻ sơ sinh và tần số người mang đột
biến là 1/11[20].
Wilson là một bệnh bẩm sinh nhưng các triệu chứng không xuất hiện
ngay từ lúc sinh ra, thường xuất hiện ở độ tuổi từ 5 đến 35, cũng có nghiên
cứu cho thấy tuổi khởi phát từ 3 đến 70 tuổi[2], tuổi trung bình phát bệnh là
15,9[21]. Đa số bệnh nhân có biểu hiện thần kinh khi còn nhỏ (dưới 12 tuổi)
và chủ yếu trong số đó không có triệu chứng về gan hoặc chỉ xuất hiện sau
một năm theo dõi[1].
Bệnh Wilson do đột biến gen lặn nằm trên nhiễm sắc thể thường,nên về
mặt lý thuyết thì tỉ lệ mắc bệnh ở hai giới là như nhau. Một số báo cáo phân
tích thấy được tỉ lệ mắc bệnh ở nam giới cao hơn nữ giới một phần nhỏ
(52%)[22]. Tại thời điểm chẩn đoán, nam giới có triệu chứng thần kinh cao
hơn nữ giới (75% và 58%), có tỉ lệ mắc bệnh gan thấp hơn (25% và 41%).
Một số nghiên cứu khác thấy rằng nữ giới có khả năng phát triển suy gan cấp
tính do bệnh Wilson cao hơn nam giới[23, 24]. Nghiên cứu sự khác nhau giữa
6
hai giới về thể gan và thể thần kinh ở bệnh Wilson trên 627 bệnh nhân cho
thấy, thể thần kinh chiếm ưu thế ở cả hai giới. Bệnh gan xảy ra thường xuyên
hơn ở nữ và thường phát triển các triệu chứng thần kinh muộn hơn gần hai
năm so với nam giới. Các nhà khoa học cho rằng sự khác biệt này có thể do
tác dụng bảo vệ của estrogen và chuyển hoá sắt khác nhau[22].
1.1.3. Triệu chứng, chẩn đoán và điều trị
1.1.3.1. Triệu chứng lâm sàng
Do sự tích luỹ đồng dẫn đến tổn thương ở nhiều mô khác nhau nên biểu
hiện lâm sàng trên hầu hết các bệnh nhân Wilson là không giống nhau. Tuy
nhiên, luôn có biểu hiện về gan hoặc thần kinh bị tổn thương[25, 26, 27].
Thể gan: gan to không triệu chứng (có hoặc không có lách to), viêm gan
cấp hoặc mạn, suy gan cấp (có thể kèm theo thiếu máu tan máu). Tăng huyết
áp tĩnh mạch, xơ gan không rõ nguyên nhân, phù, giãn mạch, cổ trường hoặc
các rối loạn chức năng gan khác (chậm dậy thì, vô kinh, rối loạn đông máu..)
cũng có thể là những biểu hiện của bệnh Wilson[28]. Ung thư biểu mô tế bào
gan hiếm gặp ở những bệnh nhân Wilson[29].
Rối loạn thần kinh có thể âm thầm hoặc đột ngột với các triệu chứng
run, rối loạn vận ngôn, co cứng, biểu hiện bệnh Parkinson, hạn chế phối hợp
vận động, múa vờn, suy giảm trí tuệ hoặc rối loạn hành vi[28]. Giai đoạn toàn
phát, nổi bật là tăng trương lực cơ lan toả kiểu ngoại tháp ở mặt, cổ, gáy và thắt
lưng. Cổ điển mô tả bộ mặt “Wilson” với các đặc điểm bất động mặt, miệng,
hầu. Có thể xảy ra cơn động kinh, cơn đột quỵ. Triệu chứng tâm thần cũng rất
phổ biến từ thay đổi hành vi đến trầm cảm và rối loạn tâm thần[30, 31].
Vòng Kayser-Fleischer phát sinh do sự lắng đọng đồng ở màng
Descemet cũng có thể xuất hiện ở bệnh nhân với triệu chứng của thể gan, hầu
hết là suy gan tối cấp, thường không gặp ở trường hợp viêm gan mạn[32],
nhưng nó luôn luôn xuất hiện ở bệnh nhân có các biểu hiện về thần kinh[28].
7
Hình 0.1: Vòng Kayser-Fleischer[33]
Các dấu hiệu và triệu chứng khác phản ánh tổn thương tế bào do lắng
đọng đồng trong các mô khác bao gồm thiếu máu tan máu, bệnh cơ tim, rối
loạn nội tiết[3, 34].
Ở trẻ em, thể gan thường phổ biến nhất, với độ tuổi trung bình 10 -13,
khởi phát sớm hơn khoảng 10 năm so với thể thần kinh[32]. Khoảng 45%
bệnh nhân ở thể gan, 35% có dấu hiệu thần kinh, 20% có rối loạn tâm thần và
các triệu chứng khác[25].
1.1.3.2. Chẩn đoán
Chẩn đoán Wilson dựa trên các tiêu chí lâm sàng và cận lâm sàng. Triệu
chứng lâm sàng thường gặp: viêm gan cấp hoặc mạn không rõ nguyên nhân,
biểu hiện thần kinh, xuất hiện vòng Kayser-Fleischer, tan máu cấp tính, rối loạn
tâm thần, thay đổi hành vi, hội chứng Fanconi hoặc bệnh về xương (loãng
xương, gãy xương không rõ nguyên nhân) hay các hiểu hiện về cơ, khớp[28].
Các chỉ số hoá sinh bổ sung cho chẩn đoán xác định bệnh Wilson: nồng
độ ceruloplasmin <20mg/dl; nồng độ đồng trong nước tiểu 24h >
100mg/ngày[35]; nồng độ đồng trong gan trên 250mg trong 100g trọng lượng
khô [35]. Tuy nhiên, một số bệnh nhân Wilson có lượng đồng và nồng độ
ceruloplasmin trong huyết thanh cao trên mức tham chiếu[36].
8
Phân tích đột biến bởi việc giải trình tự toàn bộ gen có thể giúp chẩn
đoán ở những trường hợp khó khăn trên lâm sàng và xét nghiệm hoá sinh,
sàng lọc ở người nhà cấp 1 của bệnh nhân[36].
1.1.3.3. Điều trị
Wilson là một trong những bệnh về gan đầu tiên đáp ứng tốt với việc
điều trị bằng thuốc. Các loại thuốc được sử dụng chủ yếu theo cơ chế tạo
phức với đồng để loại bỏ đồng tích luỹ trong mô,giảm sự hấp thu đồng, đi
kèm với chế độ ăn nghèo đồng. Các thuốc được sử dụng và công nhận hiệu
quả điều trị: D-penicillamine, Trientine, kẽm.
1.1.4. Cơ chế bệnh sinh
Bệnh Wilson hay còn gọi là bệnh thoái hoá gan- nhân đậu hoặc bệnh
thoái hoá gan não, là một bệnh gây ra do rối loạn chuyển hoá đồng, đặc trưng
bởi sự tích luỹ đồng trong gan, não và một số mô khác [2, 3].
Trong tế bào gan bình thường, hấp thụ đồng thông qua protein Ctr1
(constitutive triple response – 1)[37], sau đó một lượng đồng liên kết với
metallothioneins[11]giúp bảo vệ tế bào khỏi độc tính của đồng; những phân
tử còn lại liên kết với protein HAH1 và sẽ được vận chuyển vào bộ máy Golgi
thông qua tương tác protein – protein với ATP7B [11, 33, 38].
Hình 0.2: Chuyển hoá đồng trong tế bào gan[39]
9
Trong Golgi, đồng kết hợp với apo-ceruloplasmin thành ceruloplasmin,
chất này được tiết vào máu và là dạng vận chuyển chủ yếu của đồng trong
huyết tương. Khoảng 10% đồng lưu hành trong huyết tương còn lại liên kết
với albumin hoặc gắn với amino acid, là các hình thức vận chuyển vào các mô
khác nhau[33]. Lượng đồng dư thừa trong tế bào gan được chuyển ra ngoài tế
bào vào mật cũng nhờ con đường qua ATP7B[40].
ATP7B là một protein xuyên màng, thực hiện chức năng vận chuyển đồng
sử dụng ATP. Chu kì vận chuyển đồng bao gồm nhiều giai đoạn, mỗi giai đoạn
đều có thể bị ảnh hưởng bởi đột biến trên gen. Đầu tiên, ATP7B gắn đồng vào
vùng N-terminal và gắn ATP vào vùng nucleotid-binding. Sau đó, ATP bị thuỷ
phân và ATP7B trở thành dạng phosphoryl hoá. Cuối cùng, phản ứng
dephosphoryl giải phóng năng lượng và đồng được vận chuyển qua màng[10].
Hình 0.3: Chu kì vận chuyển đồng nhờ protein ATP7B[10]
Bệnh nhân Wilson có mang đột biến trên gen ATP7B, có thể làm mất
hoặc giảm chức năng protein, dẫn đến việc đồng trong tế bào không được vận
chuyển vào mạng lưới Golgi. Như vậy, tế bào không tổng hợp được
ceruloplasmin, tiết vào máu là apo-ceruloplasmin nhanh chóng bị phân
giải[3]. Trong khi đó, đồng vẫn tiếp tục được vận chuyển từ huyết tương vào
tế bào gan nhờ protein Ctr1, khiến cho hàm lượng đồng trong tế bào tăng lên,
tích luỹ và cao hơn hàm lượng các protein liên kết với nó. Đồng tích luỹ trong
10
lysosome, tạo ra các gốc tự do có tính oxi hoá gây hại cho tế bào. Do nồng độ
ceruloplasmin trong huyết tương giảm xuống, đồng dư thừa trong gan bài tiết
vào máu, không liên kết với apo-ceruloplasmin nên đồng liên kết với albumin
hoặc các acid amin mặc dù cơ chế chưa rõ ràng[39]. Kết quả, đồng không liên
kết apo-ceruloplasmin tăng trong huyết tương được bài tiết vào nước tiểu, lắng
đọng đồng trong các mô khác nhau như não, thận, giác mạc, khớp, xương[41].
Sắt cũng tích luỹ trong gan của bệnh nhân Wilson[42]. Ceruloplasmin có
hoạt tính xúc tác phản ứng biến đổi Fe2+ thành Fe3+, giảm nồng độ
ceruloplasmin trong bệnh Wilson phá vỡ sự cân bằng nồng độ sắt trong cơ
thể[33]. Tổn thương gan trong bệnh Wilson có thể một phần nguyên nhân do
tích luỹ sắt [42].
1.1.5. Cơ sở phân tử
1.1.5.1. Cơ chế di truyền
Bệnh Wilson tuân theo quy luật di truyền lặn, có nghĩa là tỉ lệ sinh con
mắc bệnh ở bố mẹ dị hợp tử là 25%. Về mặt di truyền, bệnh nhân Wilson
có thể có kiểu gen đồng hợp tử hoặc dị hợp tử hai loại đột biến khác nhau.
Mỗi đột biến này đều ảnh hưởng đến chức năng của protein và được di
truyền từ bố hoặc mẹ[2]. Người mang alen đột biến (dị hợp tử) có tỉ lệ
trong quần thể là 1/90, là người mang một alen bệnh và một alen không gây
bệnh trong kiểu gen[15, 19].
Hình 0.4: Phả hệ gia đình một bệnh nhân Wilson
11
Chú thích: Thế hệ I: bố mẹ có kiểu gen dị hợp tử, sinh ra một người con
bị bệnh mang hai alen đột biến, một người con không bị bệnh mang kiểu gen
dị hợp tử, và một người con bình thường không mang đột biến.
Thế hệ II: người con bị bệnh lấy vợ có kiểu gen dị hợp tử sinh ra hai
người con bị bệnh với hai alen đột biến và một người con không bị bệnh với
kiểu gen dị hợp tử.
1.1.5.2. Ảnh hưởng của đột biến lên các vùng chức năng protein
Khiếm khuyết trên gen ATP7B là cơ sở phân tử của bệnh Wilson. Sự
thay thế, chèn, hoặc mất một nucleotid trên gen dẫn đến sự xuất hiện bộ ba
kết thúc hoặc thay thế acid amin hoặc biến đổi một chuỗi các acid amin trong
cấu trúc protein. Tuỳ từng vị trí đột biến mà ảnh hưởng đến chức năng của
protein khác nhau.Những đột biến gây bệnh có thể có tác động mất chức năng
phosphoryl hoá hoặc mất hoạt tính xúc tác, hoặc mất cả hai chức năng này
của protein [10]. Ví dụ: đột biến Cys271Stop giảm khả năng gắn
đồng[43];c.2495-2496insG rút ngắn chuỗi acid amin, chỉ có 6 vị trí gắn đồng
và không có vùng chức năng khác[1];c.1216TCT>GCT không ảnh hưởng
chức năng protein[1].Gần 500 đột biến đã được phát hiện và công bố, số đột
biến
mới
vẫn
tiếp
tục
được
cập
nhật
và
bổ
sung
trên
websidehttp://www.wilsondisease.med.ualberta.ca/.
Nhiều nghiên cứu thiết lập mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình ở
bệnh nhân Wilson. Các đột biến ảnh hưởng nghiêm trọng như đột biến vô
nghĩa, đột biến dịch khung do chèn hoặc xoá nucleotid thường phá vỡ hoàn
toàn chức năng protein và do đó được dự kiến sẽ mang một kiểu hình lâm
sàng nặng hơn [10]. Một vài nghiên cứu chứng minh rằng đột biến nghiêm
trọng dẫn đến khởi phát bệnh sớm hơn nhưng mối tương quan với các thể
bệnh (gan hoặc thần kinh) chưa được tìm thấy[44, 45, 46]. Nghiên cứu trên bệnh
nhân đồng hợp tử ở một alen cụ thể cho thấy ít sự tương quan giữa đột biến nhất
định và tuổi khởi phát, đặc điểm lâm sàng, các chỉ số hoá sinh, hoặc mức độ ảnh
12
hưởng nghiêm trọng của bệnh[3, 47]. Ngoài ra, số lượng đột biến rất lớn, các đột
biến phần lớn là hiếm gặp, bệnh nhân thường mang hai alen đột biến khác nhau
nên việc nghiên cứu tương quan kiểu gen kiểu hình rất khó khăn.
Một số đột biến trên ATP7B, cũng có thể có mối liên quan đến bệnh
Alzheimer, nghiên cứu trên 2 SNPs K832R và R952K nằm trên ATP7B đưa
ra kết luận “sự hiện diện của các locus nhạy cảm cho Alzheimer ở gen
ATP7B, vai trò hỗ trợ rối loạn chức năng đồng, góp phần đẩy nhanh quá trình
thoái hoá thần kinh hoặc dẫn đến Alzheimer”[45].
1.2. Gen và protein ATP7B
1.2.1. GenATP7B
Hình 0.5: Vị trí gen ATP7B trên nhiễm sắc thể 13.
(genecards.org)
ATP7B: ATPase, Cu2+ transporting, beta polypeptide thuộc họ P-type ATPasa.
Vị trí: 13q14.3 [6].
Chiều dài: 51.891.085 đến 52.012.098 chia làm 21exon.
1.2.2. Protein ATP7B.
Chiều dài: 1411 acid amin [9].
Gồm 4 vùng chức năng: vùng xuyên màng có chức năng vận chuyển
đồng ra khỏi màng tế bào, vùng MBSs có chức năng là vị trí bám cho 6
nguyên tử đồng; Vùng P: phosphoryl hoá các phức hợp protein tham gia vào
sự vận chuyển đồng; vùng N: bám ATP; vùng A: khử phosphoryl hoá [48].
13
Hình 0.6: Cấu trúc của protein ATP7B [49]
Protein ATP7B có mặt ở tất cả các mô, chủ yếu ở gan, thận, nhau thai, ít
gặp ở tim, não, phổi, cơ, lách và ruột [33].
1.2.3. Mối tương quan giữa gen và protein
Trình tự nucleotid trên gen quy định trình tự acid amin trên protein, gen
ATP7B có 21 exon nhưng protein lại chỉ có 6 vùng chức năng, như vậy, mỗi
vùng chức năng được mã hoá bởi một hoặc một vài exon.
Hình 0.7:Các vùng chức năng của protein tương ứng trên gen[1]
1-21: vị trí các exon trên gen ATP7B. Cu 1-6: vị trí gắn đồng trên
protein; Tm 1-7: vùng protein xuyên màng; Ch Ph: Vùng phosphoryl hoá;
ATP loop:vùng gắn ATP; Td: vùng khử phosphoryl hoá.
14
1.2.4. Một số nghiên cứu về đột biến gen ATP7B.
Sau khi cơ chế di truyền của bệnh Wilson được làm rõ, cho đến nay,
hàng trăm công trình nghiên cứu phát hiện đột biến, nghiên cứu ảnh hưởng
đột biến, mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh Wilson đã
được tiến hành. Kết quả, hơn 500 đột biến được công bố, bao gồm các đột
biến vô nghĩa, sai nghĩa, thêm hoặc bớt nucleotid gây dịch khung mã di
truyền [43],[50],[20],[46].
Tần số mỗi đột biến khác nhau đáng kể ở các quốc gia, vùng lãnh thổ
khác nhau. Đột biến p.H1069Q được đánh giá là phổ biến ở Châu Âu [51], tuy
nhiên khi phân tích đột biến của 60 đối tượng trong 46 gia đình ở Brazil, không
tìm thấy đột biến p.H1069Q và đột biến có tần số cao nhất là c.3402delC
(30,8%) [52]. Ở Châu Á, các nhóm bệnh nhân nguyên cứu phát hiện đột biến
R778L là dạng đột biến hay gặp nhất [21, 50], Nghiên cứu thực hiện trên 65
bệnh nhân Wilson ở Hồng Kông cho thấy đột biến p.R778L có tỉ lệ lớn nhất
(17,3%) so với các đột biến khác trong cùng đề tài [53]. Trong một nghiên cứu
khác trên những bệnh nhân Hàn Quốc, tần số đột biến này là 65% [54].
Ở Việt Nam, nghiên cứu phát hiện đột biến gen gây bệnh Wilson bước
đầu được triển khai thu được kết quả khá tốt. Năm 2011, xây dựng được quy
trình phát hiện đột biến gen gây bệnh Wilson[55]. Năm 2014, Nghiên cứu
phát hiện đột biến trên gen ATP7B của TS. Trần Vân Khánh cùng cộng sự đã
phát hiện 28 dạng đột biến trên gen ATP7B, bước đầu xây dựng được bản đồ
đột biến gen gây bệnh Wilson ở người Việt Nam [56].
1.3. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
1.3.1. Polymerase Chain Reaction ( PCR)
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (phản ứng
chuỗi trùng hợp). PCR là một kỹ thuật sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo
15
ra nhiều bản sao) một đoạn DNA, thực hiện trong ống nghiệm, sử dụng các
yếu tố cơ bản của quá trình sao chép diễn ra trong tự nhiên.
Phương pháp PCR được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis và cộng sự
phát minh năm 1985 và kể từ đó,PCR được ứng dụng nhiều trong các nghiên
cứu sinh học và y học nhằm mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di
truyền, nhận dạng dấu vân tay DNA, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách
dòng gen, xác định huyết thống…
1.3.1.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồi tính
của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNA
polymerase. Với nguyên liệu là 4 loại nucleotid, enzym DNA polymerase xúc
tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn. Phản ứng đòi hỏi
sự có mặt của mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của
trình tự DNA khuôn.
1.3.1.2. Các thành phần tham gia của phản ứng PCR
DNA khuôn: Đoạn khuôn DNA (DNA template, DNA target) tinh
sạch là một yếu tố quan trọng, giúp phản ứng PCR tạo được các sản phẩm
chính xác. Kích thước đoạn DNA khuôn nhỏ hơn 3kb cho kết quả khuếch
đại gen tốt nhất[55].
Mồi: Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30
nucleotid. Để thực hiện nhân một đoạn DNA bằng phản ứng PCR, cần có một
cặp mồi thích hợp, bắt cặp đặc hiệu với DNA khuôn. Mỗi cặp mồi có một mồi
xuôi và một mồi ngược[55].
Các nucleotide tự do: Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphate
(dNTPs): dATP, dTTP, dGTP và dCTP, được dùng làm cơ chất tổng hợp
DNA. Khi hàm lượng dNTP tự do quá ít, tạo sản phẩm PCR ít không đủ để
phát hiện. Ngược lại nồng độ dNTP cao thì phản ứng PCR khó thực hiện[55].
16
Enzym DNA polymerase: Là yếu tố đóng vai trò quyết định hiệu quả
của phản ứng PCR. Enzym thường được sử dụng hiện nay là Taq
DNApolymerase, được phân lập từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở nhiệt
độ cao[55]. Hàm lượng enzym ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR.
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: cần đảm bảo các thành phần cần
thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, TrisHCl…Trong đó, Mg 2+ là thành phần ảnh hưởng rõ rệt đến hiệu quả phản
ứng PCR do ion Mg2+ ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với
mạch khuôn.
1.3.1.3. Các bước của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
3 bước:
Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản
ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA biến
tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử, thường là 94 95ºC trong vòng 30-60 giây.
Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing). Nhiệt độ được hạ thấp cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40 - 70 tùy thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây.
Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension). Nhiệt độ được
tăng lên 72ºC để DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq DNA
polymerase, Tth polymerase,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian phụ
thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây
đến nhiều phút.
Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng
để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.
Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài bằng
khoảng cách giữa hai đoạn mồi, và 2 đầu tận cùng của sản phẩm được xác
định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen[57].
17
Hình 0.8: Thành phần và các giai đoạn phản ứng PCR
(Nguồn:http://classroom.sdmesa.edu/)
1.3.1.4. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
Ưu điểm
- Thời gian thực hiện nhanh.
- Đơn giản và ít tốn kém.
- Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.
- PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, thêm đoạn
hay đột biến điểm.
Hạn chế
- Trong thực nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn
đầu tiên. PCR không hoạt động được với những phân tử có kích thước lớn
hơn 3kb.
- Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn đặt ra đối với PCR.
1.3.2. Giải trình tự gen
Năm 1977, Sanger và cộng sự đã công bố về kĩ thuật sinh học phân tử có
khả năng xác định trình tự nucleotid trên DNA[58].Đây là một kĩ thuật sử dụng
18
enzym DNA polymerase và các dideoxyribonucleotid có tác dụng dừng chuỗi
phản ứng. Kỹ thuật này giúp xác định trình tự nucleotid nhanh hơn, chính xác và
vẫn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau như: giải trình tự
để định danh, định type vi khuẩn, virus, nhận dạng cá thể, nhận dạng loài, xác
định đột biến gen, sản xuất vaccine, điều trị đích ung thư....Cùng với sự phát
triển của khoa học kỹ thuật, giải trình tự gen hiện nay đều thực hiện trên máy tự
động. Dựa trên phương pháp enzym của Sanger, máy giải trình tự tự động
giúp việc thực hiện kĩ thuật trở nên dễ dàng và tiết kiệm thời gian hơn.
Nghiên cứu này sử dụng phương pháp giải trình tự bằng máy tự động.
1.3.2.1. Nguyên lý:
Dưới tác dụng của enzym DNA polymerase, thực hiện phản ứng tổng
hợp DNA trong môi trường có chứa các dideoxyribonucleotid (ddNTP) có tác
dụng dừng chuỗi phản ứng, thực hiện lặp lại nhiều chu kì tổng hợp sẽ tạo ra
nhiều sợi DNA có chiều dài từ vị trí mồi cộng 1 nucleotid đến vị trí cuối cùng
của đoạn DNA, xác định trình tự nucleotid bằng việc điện di cả 4 giếng chứa
4 loại ddNTP trên gel polyacrylamid.
Hình 0.9: Minh hoạ phương pháp giải trình tự gen
(Nguồn:http://rsc.org)
19
1.3.2.2. Các thành phần tham gia giải trình tự
DNA khuôn: đoạn DNA đích cần xác định trình tự. Tất cả các phân tử
DNA có cùng chiều dài, được khuếch đại nhiều lần bằng PCR hoặc nhân
dòng gen.
Mồi: Mồi là những đoạn oligonucleotid có chiều dài khoảng 15-30
nucleotid, đặc hiệu với trình tự của DNA.
Các nucleotide tự do: Gồm 4 loại deoxynucleotid triphosphate
(dNTPs): dATP, dTTP, dGTP và dCTP.
Các dideoxyribonucleotid (ddNTP) được đánh dấu phóng xạ huỳnh
quang có màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP: ddATP màu xanh lá cây,
ddTTP màu đỏ, ddGTP màu đen, ddCTP màu xanh da trời. Nồng độ của
ddNTPs phải thấp hơn dNTPs nhiều lần. Nếu chỉ bổ xung dNTPs thì sản
phẩm PCR sẽ là đoạn DNA hoàn chỉnh. Mặt khác, khi bỏ toàn bộ là ddNTPs,
Taq polymerase sẽ gắn 1 ddNTPs vào phía trướcđoạn mồi và phản ứng kéo
dài DNA sẽ dừng lại. Do vậy, phản ứng tổng hợp cả dNTPs và ddNTPs với tỷ
lệ tối ưu là 100:1, và với tỉ lệ này DNApolymerase sẽ gắn dNTPs vào mạch
DNA bổ xung vào có cơ hội gắn 1 ddNTP để dừng phản ứng kéo dài.
Enzym DNA polymerase: chức năng kéo dài mạch.
Dung dịch đệm cho phản ứng: Dung dịch đệm gồm các thành phần cần
thiết cho hoạt động của enzym DNA polymerase như MgCl2, KCl, Tris-HCl…
1.3.2.3. Cấu tạo của máy giải trình tự tự động
Gồm hai phần chính: phần điện di với gel polyacrylamid và phần phát
hiện các vạch điện di. Phần điện di có thể là một bản gel hay một ống mao
quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những “con mắt cảm quang” và
chùm tia laser đi qua trước nó.Khi gặp ánh sáng laser, các vạch điện di phát
sáng với cường độ khác nhau đặc trưng cho từng loại ddNTP. Ánh sáng này
20
được “mắt cảm quang” thu nhận tín hiệu, phân tích, so sánh với cường độ của
từng loại Nu và đưa ra trình tự của đoạn DNA.
Kĩ thuật giải trình tự đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu để xác
định đột biến điểm. Phần lớn các đột biến gây bệnh Wilson là đột biến điểm
nên sử dụng phương pháp giải trình tự gen ATP7B có hiệu quả cao.
- Xem thêm -