Tài liệu ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Sinh viên thực hiện luận văn Trần Thanh Thảo ỜI C M N Đầu tiên, em xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã tạo điều kiện cho chúng em được học tập tại Trường. Em cũng xin chân thành biết ơn sự dạy dỗ tận tình của toàn thể quý thầy cô Viện Khoa học Ứng dụng Hutech, Trường Đại học Công nghệ TP. HCM đã cho chúng em những kiến thức quan trọng trong suốt thời gian qua, nhờ vậy chúng em mới có được những tri thức quý giá để làm hành trang cho con đường sự nghiệp phía trước. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Nguyễn Hoài Hương đã trang bị cho em những kiến thức bổ ích và luôn theo sát quá trình làm việc của em để kịp thời hướng dẫn cũng như khắc phục những lỗi sai để công việc đạt kết quả tốt nhất. Cô luôn chia sẽ cũng như động viên em khi công việc chưa ổn và giúp em tìm được niềm vui khi thấy được thành quả mình sắp gặt hái được. Em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã tiếp cho em nghị lực, sự bình yên trong tâm hồn, luôn bên em những lúc khó khăn. Em cũng xin được cảm ơn tới những người bạn đã gắn bó, động viên và giúp đỡ em suốt quãng thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp. Cuối c ng, em xin cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành thời gian đọc và nhận x t đồ án tốt nghiệp này. Em xin gửi đến Thầy Cô lời chúc sức khỏe va. Trong quá tr nh làm đồ án, do kinh nghiệm c n thiếu và kiến thức chưa đầy đủ, nên có nhiều thiếu sót, mong các Thầy Cô bỏ qua. Sinh viên thực hiện Trần Thanh Thảo MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................... v DANH MỤC B NG ......................................................................................................vi DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................vii MỞ ĐẦU ......................................................................................................................... 1 CHƯ NG I: TỔNG QUAN .......................................................................................... 6 1.1.Tổng quan về nấm ...................................................................................................... 6 1.1.1.Tổng quan về Aspergillus sp. .................................................................................. 6 1.1.1.1.Phân loại khoa học ............................................................................................... 6 1.1.1.2.Đặc điểm hình thái ............................................................................................... 7 1.1.1.3.Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng ................................................................... 7 1.1.2.Tác hại của độc tố Aflatoxin ................................................................................... 8 1.1.2.1.Tác hại của nấm gây ra cho con người ................................................................ 9 1.1.2.2.Tác hại của nấm gây ra cho động vật ................................................................... 9 1.1.3.Các phương pháp khử nhiễm độc tố ....................................................................... 9 1.1.3.1.Phương pháp vật lý học ........................................................................................ 9 1.1.3.2.Phương pháp hóa học ......................................................................................... 11 1.1.3.3.Phương pháp sinh học ........................................................................................ 12 1.2.Tổng quan về bảo quản hạt giống ............................................................................ 15 1.3.Tổng quan về vi khuẩn lactic ................................................................................... 16 1.3.1.Giới thiệu chung .................................................................................................... 16 1.3.2.Đặc điểm hình thái ................................................................................................ 17 1.3.3.Đặc điểm sinh lý – sinh hóa .................................................................................. 19 1.3.4.Nhu cầu dinh dưỡng .............................................................................................. 20 1.3.4.1.Nguồn cacbon..................................................................................................... 20 1.3.4.2.Nguồn nito .......................................................................................................... 20 i 1.3.4.3.Nguồn vitamin .................................................................................................... 21 1.3.4.4.Các chất hữu cơ khác ......................................................................................... 21 1.3.4.5.Các muối vô cơ khác .......................................................................................... 21 1.3.4.6.Nguồn oxy .......................................................................................................... 22 1.3.5.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic và các hợp chất kháng nấm ................. 22 1.3.5.1.Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic .......................................................... 22 1.3.5.2.Các hợp chất kháng nấm .................................................................................... 23 CHƯ NG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯ NG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 29 2.1.Địa điểm nghiên cứu ................................................................................................ 29 2.2.Thời gian thực hiện .................................................................................................. 29 2.3.Vật liệu nghiên cứu .................................................................................................. 29 2.3.1.Vật liệu .................................................................................................................. 29 2.3.2.Hóa chất sử dụng ................................................................................................... 29 2.3.3.Môi trường sử dụng ............................................................................................... 30 2.3.4.Thiết bị .................................................................................................................. 30 2.4.Phương pháp luận..................................................................................................... 30 2.4.1.Mục tiêu đồ án ....................................................................................................... 30 2.4.2.Nội dung ................................................................................................................ 30 2.5.Phương pháp nghiên cứu.......................................................................................... 31 2.5.1.Sơ đồ nghiên cứu................................................................................................... 31 2.5.2. . Phương pháp khảo sát độ thuần khiết của các chủng vi khuẩn lactic Lactobacilus sp. (L5), Lactobacillus sp. (L3), Lactobacillus sp. (L2N) và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CDP1. .................................................................................................... 32 2.5.2.1.Khảo sát độ thuần khiết của vi khuẩn lactic....................................................... 33 2.5.2.2.Chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 ............................................................. 38 2.5.3. ... Phương pháp khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus spp. ...................................................................................................... 39 ii 2.5.4.Phương pháp khảo sát môi trường lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic ........... 40 2.5.5.Phương pháp khảo sát khả năng bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1 .............................................................................................................................. 43 CHƯ NG III: KẾT QU VÀ TH O LUẬN ........................................................... 51 3.1.Khảo sát tính thuần khiết của 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3, L2N ....................... 51 3.1.1.Quan sát hình thái khuẩn lạc ................................................................................. 51 3.1.2.Nhuộm gram.......................................................................................................... 52 3.1.3.Nhuộm bào tử ........................................................................................................ 53 3.1.4.Thử nghiệm Catalase............................................................................................. 54 3.1.5.Thử nghiệm khả năng lên men đường .................................................................. 55 3.1.6.Thử nghiệm khả năng di động .............................................................................. 57 3.2.1.Xác định hàm lượng acid tổng .............................................................................. 59 3.2.2.Khả năng tạo màng biofilm ................................................................................... 63 3.3.Khảo sát sự phát triển của chủng Aspergillus sp. CĐP1 và khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic ................................................................................................................ 63 3.3.1.Sự phát triển của nấm CĐP1 ................................................................................. 63 3.3.2.Khả năng kháng nấm trực tiếp của vi khuẩn lactic ............................................... 65 3.4.Lên men vi khuẩn lactic ........................................................................................... 66 3.4.1.Sinh khối của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp cải ....................... 66 3.4.2.Hàm lượng acid tổng (%) của 3 chủng vi khuẩn trên môi trường MRS và bắp cải .................................................................................................................................. 68 3.4.3.Sự tạo màng biofilm của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS và bắp cải ................................................................................................................................... 70 3.4.4.Khả năng kháng nấm CĐP1 của các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRS và bắp cải. ....................................................................................................................... 71 3.5.Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng ............................................................. 73 iii 3.6.Sơ đồ quy trình bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng Lactobacillus sp. L5, L2N, L3 ........................................................................................................................................ 77 CHƯ NG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 79 4.1. Kết luận ................................................................................................................... 79 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................. 79 TÀI LIỆU THAM KH O ........................................................................................... 80 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 82 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria/ Lactobacillales VSV Vi sinh vật VK Vi Khuẩn BVTV Bảo vệ thực vật MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm NT Nghiệm thức KĐC Không điều chỉnh v DANH MỤC B NG Bảng 1.1: Tóm tắt các cơ chế khử nhiễm sinh học bằng một số chủng vi khuẩn Bảng 1.2: Text sinh hóa của Lactobacillus Bảng 1.3: Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998) Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm của một số hợp chất được tóm tắt qua bảng dưới đây Bảng 1.5: Bảng tóm tắt về 3 chủng vi khuẩn lactic L5, L3 và L2N Bảng 1.6: Acid lactic và giá trị OD ở bước sóng 6 nm sau 66 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. Bảng 1.7: Số liệu thống kê tỉ lệ phần trăm ức chế sự phát triển của nấm CĐP1 Bảng 1.8: Số ngày mọc nấm ở 2 thí nghiệm không cảm nhiễm và cảm nhiễm vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus Hình 1.2: Hình dáng tế bào Lactobacillus Hình 1.3: Cấu trúc phân tử của các hợp chất kháng nấm: (a) 4-hydroxy-phenyllactic acid, (b) 3-phenyllactic acid, (c) 3-hydroxydecanoic acid, (d) 3-hydroxydodecanoic acid, e) 3-hydroxytetradecanoic acid, (f) 3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid, (g) Cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone, (h) methylhydantoin, (i) mevalonolactone, (j) Caproic acid, (k) Propionic acid, (l) Butyric acid, (m) Acetic aicd, (n) Formic acid, (o) n-valeric acid Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng Lactobacillus spp. trên đĩa MRS Agar Hình 3.2: Kết quả nhuộm gram của các vi khuẩn (từ trái qua phải) vi khuẩn E.coli gram âm, vi khuẩn Bacillus subtilis gram dương, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 Hình 3.3: Kết quả nhuộm bào tử của các vi khuẩn (từ trái qua qua phải) vi khuẩn Bacillus subtilis sinh bào tử, vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 không sinh bào tử Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. L5 (trái qua phải: thử nghiệm âm tính vi khuẩn L5, đối chứng âm vi khuẩn lactic trong nước cất, thử nghiệm dương tính với vi khuẩn Bacillus subtilis) Hình 3.5: Khả năng lên men các loại đường của vi khuẩn Lac obacillus sp. L3 A – Glucose; B – Fructose; C – Sucrose; D – Manose; E – Manitol; F – Galactoe Hình 3.6: Thử nghiệm tính di động của chủng Lactobacillus sp. L5 và chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis. vii Hình 3.7: So sánh acid lactic và giá trị OD ở bước sóng 6 nm sau 24 giờ nuôi cấy của các chủng Lactobacillus spp. Hình 3.8: Đồ thị so sánh 3 chủng vi khuẩn lactic tạo màng ở điều kiện lắc và không lắc Hình 3.9: (trái qua phải Khả năng phát triển của chủng nấm Aspergillus sp. CĐP1 trên môi trường MRS Agar cải tiến và PDA Hình 3.1 : Đồ thị so sánh sự kháng nấm trực tiếp của 3 chủng vi khuẩn Hình 3.11: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp. L5 trên 2 môi trường Hình 3.12: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp. L2N trên 2 môi trường Hình 3.13: Độ đục dịch nuôi cấy của Lactocbacillus sp. L2N trên 2 môi trường Hình 3.14: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L5 trên 2 môi trường Hình 3.15: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L2N trên 2 môi trường Hình 3.16: Nồng độ acid tổng của Lactobacillus sp. L3 trên 2 môi trường Hình 3.17: Đồ thị so sánh khả năng tạo màng biofilm của 3 chủng vi khuẩn trên 2 môi trường Hình 3.18: Khả năng kháng nấm mốc của chủng vi khuẩn L5 trên 2 môi trường nuôi cấy so với đối chứng + Daconil .5g l và đối chứng (- nước cất (A – đối chứng (+), B – đối chứng (-), C – môi trường MRS, D – môi trường bắp cải) Hình 3.19: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ kháng nấm (%) của 3 chủng vi khuẩn trên 2 môi trường với đối chứng (+) Daconil viii MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, với sự phát triển của nhiều lĩnh vực khoa học – kỹ thuật nhằm phục vụ cho con người, cùng với cuộc cách mạng 4. đã đưa con người tới nên nền văn minh hiện đại. Nhờ sự phát triển đó thì con người ngày càng chú trọng tới sức khỏe của mình hơn, do vậy vấn đề an toàn thực phẩm lại trở nên cần thiết và quan trọng. Song song với việc phát triển kinh tế, chính trị và xã hội thì lĩnh vực Công nghệ sinh học cũng đang được phát triển và mở rộng ở nước ta. Ở nước ta, nông nghiệp đóng vai tr chủ yếu và những người nông dân phải luôn đảm bảo năng suất và nhu cầu lương thực cho người tiêu d ng trong và ngoài nước. Đa số các loại cây trồng đều sử dụng hạt giống và khi gieo trồng sẽ chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: thời tiết khí hậu, điều kiện đất, … ngoài những yếu tố đó c n có vi sinh vật, côn trùng, nấm mốc làm ảnh hưởng đến sự phát triển của cây. Có khoảng 50 loài nấm mốc có mặt trong thức ăn và nguyên liệu làm thức ăn ngũ cốc) gây hại cho vật nuôi và con người vì chúng sản sinh ra đốc tố, người ta thường gọi tên chúng là độc tố nấm mốc (mycotoxin). Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin làm thiệt hại kinh tế nặng nề, nhiều nhất là các nhà chăn nuôi, sản xuất thức ăn gia súc và thực phẩm cho con người. Điều kiện khí hậu nóng ẩm ở Châu Á thuận lợi cho việc nấm mốc phát triển như trong lúc canh tác, lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc chế biến thức ăn, lúc bảo quản, lúc vận chuyển và ngay trong cả quá trình cho ăn. Họ biết sự có mặt độc tố trong thức ăn không những làm giảm giá trị dinh dưỡng của thức ăn mà c n sản sinh ra các độc tốt 1 gây bệnh cho vật nuôi. Có thể kể điển hình là Aflatoxin – là độc tố của nấm Aspergillus flavus và parasiticus – có nhiều ở hạt bắp, đậu phộng và một vài loại hạt khác có chứa dầu. Nó không chỉ là độc tố nấm mốc gây nhiễm độc, gây rối loạn chức năng, gây suy giảm miễn dịch, thoái hóa gan thận mà còn gây chết gia súc. Aflatoxin c n được chứng minh là chất độc gây ung thư cho động vật, do đó rất nguy hiểm cho con người. Các nhà nghiên cứu đã ứng dụng từ những kiến thức và những tư liệu trên Thế Giới, bên cạnh đó kết hợp với những kỹ thuật tiên tiến cho ra các sản phẩm ưu việt hơn như giống cây trồng, vật nuôi, thức ăn mới, các loại thuốc chữa bệnh, các loài vi sinh vật sử dụng trong chế biến – bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa các loại vi khuẩn, nấm mốc gây bệnh nhằm phục vụ đời sống cho con người, phát triển kinh tế - xã hội và bảo vệ môi trường. Trước thực trạng đó, con người luôn tìm kiếm những vi sinh vật có khả năng bảo vệ thực phẩm mà cũng bảo vệ sức khỏe con người và động vật. Theo các nghiên cứu thì vi khuẩn sinh acid lactic được ứng dụng nhiều nhất. Vi khuẩn này có hoạt tính sinh học khá cao, an toàn, có khả năng tiêu diệt những vi sinh vật có hại và cũng là nguồn vi sinh vật hữu ích, duy trì hệ cân bằng vi khuẩn đường ruột. Từ những lợi ích của vi khuẩn lactic, chúng còn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm mốc. Do đó, đây cũng chính là lý do em chọn để thực hiện đề tài “Khảo sát khả năng ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong bảo quản hạt đậu phộng.” 2. Tình hình nghiên cứu Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng về khả năng kháng nấm do vi khuẩn lactic sinh ra.  ―Khả năng kháng nấm của 2 chủng Lactobacillus plantarum với mốc Fusarium in vitro trong nấu mạch nha lúc mạch‖ của A. Laitila và cộng sự (2002). 2  ―Khả năng kháng nấm của vi khuẩn sinh acid lactic trong sản xuất hợp chất kháng nấm trong thực phẩm‖ của Cassandra De Muynck và cộng sự (2004).  ―Nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn lactic phân lập từ kim chi kháng Aspergillus fumigatus‖ của Kim Jeong Dong (2005).  ―Ngăn cản sự sản xuất độc tố của Aspergillus nomius của vi khuẩn sinh acid lactic và Saccharosemyces cerevisae‖ của R Muñoz và cộng sự (2010). Ở nước ta, cũng có một vài nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic.  ―Khả năng giảm hàm lượng Aflatoxin từ nấm mốc của vi khuẩn lactic và nấm Trichoderma‖ của Lương Thị Phương Thảo (2015).  ―Chủng nấm men Saccharosemyces cerevisae sử dụng bổ sung vào thức ăn chống tác hại của Aflatoxin và bệnh đường tiêu hóa‖ của Đậu Ngọc Hào và Phạm Minh Hằng. 3. Mục đích nghiên cứu Ứng dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt đậu phộng khỏi sự phát triển nấm mốc sinh Aflatoxin. 4. Mục tiêu nghiên cứu Ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt giống. 5. Nội dung nghiên cứu Hoạt hóa các chủng lactic Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N và chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. Khảo sát đặc điểm hình thái, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic: Lactobacillus sp. L5, Lactobacillus sp. L3, Lactobacillus sp. L2N. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp của vi khuẩn lactic với Aspergillus sp. CĐP1. 3 Khảo sát hoạt tính sinh học của 3 chủng vi khuẩn vi khuẩn lactic (sinh khối, tổng hợp acid lactic, tạo biofilm, ức chế nấm mốc) khi nuôi cấy trên môi trường bắp cải so sánh với môi trường MRS. Khảo sát khả năng bảo quản hạt đậu phộng khi xử lý với các tổ hợp vi khuẩn lactic. 6. Tính mới của đề tài Đã tuyển chọn và kết hợp được 3 chủng vi khuẩn lactic Lactocbacillus sp. L5, L3 và L2N. Xây dựng được quy trình để bảo quản hạt đậu phộng từ 3 chủng lactic. Tạo sản phẩm hạt đậu phộng xử lý vi khuẩn lactic kéo dài thời gian bảo quản khỏi nấm mốc sinh Aflatoxin. 7. Phương pháp nghiên cứu 7.1. Phương pháp luận Để ứng dụng vi khuẩn lactic bảo quản hạt đậu phộng thay cho chất bảo quản hóa học, các vi khuẩn lactic có nguồn phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống được khảo sát tuyển chọn theo khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối kháng nấm. Đồng thời ảnh hưởng của các môi trường lên men lên các tính chất trên cũng được khảo sát. Cuối cùng khả năng chống mốc của hạt đậu phộng xử lý dịch nên cấy trong môi trường tối ưu sẽ được chứng minh. 7.2. Phương pháp xử lý số liệu  Phần mềm Excel 2 16 để vẽ đồ thị.  Phần mềm thống kê SAS 9.1. 4 8. Kết quả đạt được Xác định khả năng sinh acid, tạo sinh khối, tạo màng biofilm và đối kháng nấm của 3 chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus sp. L5, L3, L2N đối với chủng nấm mốc Aspergillus sp. CĐP1. Xác định môi trường lên men thích hợp của các chủng vi khuẩn lactic. Xây dựng được quy trình bảo quản hạt đậu phộng. 5 CHƯ NG I: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về nấm Nấm (tên khoa học: Fungi) là một giới trong năm giới theo hệ thống phân loại của R.H.Whittaker (1996). Nấm tồn tại và phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, xác sinh vật chết, động vật, thực vật,… chúng đóng vai tr quan trọng trong việc phân giải các hợp chất trong tự nhiên như Cellulose, Protein, Lipid, Chitin,… đảm bảo vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng còn có khả năng sinh độc tố gây hại cho con người, động vật và thực vật. 1.1.1. Tổng quan về Aspergillus sp. Aspergillus là một chi gồm vài trăm khuôn loài được tìm thấy ở vùng khí hậu khác nhau trên thế giới, được nhà hóa học và nhà sinh học người Ý Pier Antonio Micheli xếp vào danh mục đầu tiên vào năm 1729. 1.1.1.1. Phân loại khoa học  Giới: Fungi  Ngành: Ascomycota  Lớp: Eurotiomycetes  Bộ: Eurotiales  Họ: Trichocomaceae  Chi: Aspergillus Aspergillus gồm hơn 185 loài, nhiều loài gây bệnh cho con người và động thực vật. Nhiều loài được con người ứng dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme. 6 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái Aspergillus có hình dạng sợi, phân nhánh, có vách ngăn ngang hoàn chỉnh. Nhiều khuẩn ty phát triển trên bề mặt cơ chất để hấp thu chất dinh dưỡng, đặc biết vách ngăn ngang có 1 lỗ nhỏ để cho tế bào chất trao đổi qua lại giữa hai tế bào. Khuẩn ty đứt thành khúc, và mỗi khúc hay đoạn đều có thể phát triển cho ra một khuẩn ty mới. Hình 1.1: Hình dáng tế bào Aspergillus 1.1.1.3. Quá trình dinh dưỡng và sinh trưởng Các loài nấm sinh trưởng không cần ánh sáng. Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2 – 500C, tối ưu từ 22 – 270C và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được 35 – 400C. Nói chung, nấm có thể phát triển ở môi trường acid nhưng pH tối ưu 7 là 5 – 6.5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9. Oxy cũng cần cho sự phát triển của nấm vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Nấm có thể phát triển liên tục trong 4 năm hoặc hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng. Nấm mốc không có diệp lúc tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh sống ký sinh trong cơ thể động vật hoặc thực vật) hay hoại sinh trên xác,… Nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm là C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như Glucose, muối Ammino,… sẽ được hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử thành những phân tử nhỏ để dễ hấp thu vào trong tế bào. 1.1.2. Tác hại của độc tố Aflatoxin Độc tố nấm mốc (Mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân thử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật và con người. Điểm đặc biệt ở độc tố nấm mốc là chúng có thể gây hại ở nồng độ thấp. Các loại đốc tố do Aspergillus sp. tiết ra: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2), Ochratoxin A, Stermatocystin, Acid cyclopianxoic. Độc tố gây ngộ độc và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do nấm mốc A. flavus, A. parasiticus, A. nomius sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số hạt. Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan, nếu mức độ ô nhiễm thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản và về lâu dài sẽ gây ung thư. 8 Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất (Nabil Saad, 2004). 1.1.2.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người Aflatoxin gây ngộ độc cấp tính qua đường ăn uống và nhiễm ở liều lượng cao trong thời gian ngắn. Những triệu chứng cấp tính chuyên biệt bao gồm: xuất huyết, hủy hoại gan cấp tính, phù nề, cản trở hấp thu các chất và tử vong. Trong khi đó, nếu hấp thu ở liều lượng từ thấp đến trung bình trong một thời gian dài thì khó có thể nhận biết, một số triệu chứng có thể kể đến như là chuyển hóa thức ăn k m, sụt cân, nhưng rõ nhất chính lả ngộ độc mãn tính trên gan và ung thư gan. 1.1.2.2. Tác hại của nấm gây ra cho động vật Các triệu chứng nhiễm độc Aflatoxin được nghiên cứu thông qua các vụ nhiễm độc tự nhiên và qua thí nghiệm trên động vật. Sự nhiễm độc mãn tính Aflatoxin có tính di truyền theo 3 kiểu: gây ung thư, quái thai, đột biến. Hậu quả của việc nhiễm Aflatoxin còn phụ thuộc vào tuổi, giới tính, loài, tình trạng dinh dưỡng và mức độ tiếp xúc. Chẳng hạn như động vật càng non thì khả năng mẫn cảm với tác nhân càng cao.  Aflatoxin B1 là độc tố quan trọng nhất và là chất gây ung thư nguy hiểm nhất trong số các Aflatoxin. Chúng có thể tạo các khối u ở gan, thận, dạ dày và hệ thống thần kinh. 1.1.3. Các phương pháp khử nhiễm độc tố 1.1.3.1. Phương pháp vật lý học Phân hủy Aflatoxin bằng không khí nóng: dùng không khí nóng thổi qua nguyên liệu có chứa Aflatoxin để làm giảm liều lượng Aflatoxin đã được nhiều tác giả nghiên cứu, phương pháp này đã đem lại nhiều kết quả đáng kể. Nếu nhiệt độ không khí nóng đưa vào là 1 0 C – 1450C ở ngô hạt thì lượng Aflatoxin có thể giảm tử 877 ppb còn 9 452 ppb, tử 378 ppb còn 223 ppb. Nếu nhiệt độ tang lên tới 1650C có thể làm cho lượng Aflatoxin B1 giảm đến 65 Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phân hủy Aflatoxin bằng hấp ướt ở áp xuất cao: phương pháo hấp ướt ở nhiệt độ cao dưới áp lực hơi nước đem lại kết quả khả quan hơn. Quá trình này nhanh chóng phá hủy vòng lacton trong cấu trúc phân tử của Aflatoxin. Theo Rehana (1979) nhận ppb được hấp ướt trong 5 phút ở 1200C thấy nếu gạo nhiễm Aflatoxin từ 40 – 4 thêm nước vào gạo tỉ lệ 1:4) có thể làm giảm hàm lượng Aflatoxin đến 68%. Ở đậu phộng có độ ẩm 10%, chứa 7 ppb Aflatoxin B1 được hấp ướt ở 1200C trong 4 giờ giảm còn 370 ppb. Ở hàm lượng Aflatoxin thấp 76 ppb được hấp ở 1.5 atm trong vòng 1 giờ đã phân hủy hoàn toàn Aflatoxin Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Làm giảm Aflatoxin bang các chất hấp phụ hoặc kết dính độc tố: các chất hấp phụ thường là các chất vô cơ hoặc hữu cơ tự nhiên hoặc nhân tạo) có hoạt tính bề mặt cao. Các chất có khả năng hấp phụ Aflatoxin gồm: than hoạt tính, một số polymer hữu vô cơ có bản chất aluminosilicate như bentonite, HSCAS (Hydrated sodium calcium alumino – silicate), một số chất s t đặc biệt (kaolin, sepiolite, clinoptilolite, zeolite), một số polymer hữu cơ tự nhiên (alfalfa) hoặc nhân tạo (nhựa trao đổi ion, polyvinyl, polypyrrolidone). Những chất này không được hấp phụ qua ruột mà được bài thải ra ngoài Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). Phân hủy Aflatoxin bằng các tia bức xạ: Aflatoxin rất mẫn cảm với tia cực tím. Ở bước song 365 nm, khả năng hấp phụ Aflatoxin đạt cực đại. Okonkwo (1978) nhận thấy lượng Aflatoxin ở bắp (150ppb và 250 ppb) có thể giảm tới 30% và 16% trong 10 giờ tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003). 10